洛美利嗪調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制研究*

唐慧瑢， 古麗再帕爾·托合尼亞孜， 陳東馨， 姜洪超， 趙文娟， 孫 磊， 錢 峰

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞與治療抗體工程研究中心，上海200240）

炎癥反應(yīng)是機(jī)體面對外來刺激產(chǎn)生的一種生理性自動防御反應(yīng)，該過程有大量炎癥因子和免疫細(xì)胞參與［1］。過度激活的炎癥反應(yīng)會釋放大量炎癥介質(zhì)，影響器官功能，引發(fā)過敏反應(yīng)和代謝紊亂等疾病，甚至?xí)T發(fā)腫瘤，嚴(yán)重危害人體健康［2］。目前臨床上常用的抗炎藥物主要包括甾體類化合物與非甾體類化合物，然而這些藥物副作用及不良反應(yīng)較多、選擇性較低，因此尚無法完全滿足臨床用藥需求，故亟需開發(fā)更多療效良好、靶向明確的新型抗炎藥物。

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程中重要的細(xì)胞之一［3］，在不同刺激下，巨噬細(xì)胞的表型、功能及形態(tài)等都會發(fā)生不同的分化，稱為巨噬細(xì)胞的極化［4-5］。巨噬細(xì)胞的極化在免疫應(yīng)答中承擔(dān)重要角色。在細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等活化因子介導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞通常向M1型極化，分泌促炎因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β 等，同時表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），活化大量促炎信號［6］，對細(xì)胞外基質(zhì)的降解與細(xì)胞凋亡有加速效果，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th1 型免疫應(yīng)答［1，7-8］，促進(jìn)炎癥進(jìn)一步發(fā)展［2，9-10］。而在 IL-4 等細(xì)胞因子介導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞主要向M2 型分化，特征性表達(dá)幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白3（chitinase 3-like protein 3，CHI3L3/Ym-1）、Fizz-1（found in inflammatory zone-1）、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）等，抑制T 細(xì)胞過度增殖和活化［3，9］，并促進(jìn)抗炎物質(zhì)的分泌，調(diào)節(jié)Th2型免疫應(yīng)答作用［3，9，11］。許多信號通路參與并介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化和免疫應(yīng)答過程。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外刺激信號，普遍存在于生物體中，并參與不同炎癥反應(yīng)和炎性分子的表達(dá)和調(diào)控，對M1型巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答具有重要調(diào)控作用［12-14］。而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）信號通路在IL-4 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中會發(fā)生活化，促使巨噬細(xì)胞釋放抗炎細(xì)胞因子，表達(dá)一系列抗炎物質(zhì)，進(jìn)而介導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)［15］。一般認(rèn)為抑制巨噬細(xì)胞促炎因子分泌或增加抗炎因子產(chǎn)生，調(diào)控免疫應(yīng)答相關(guān)信號通路是抗炎藥物發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)。

洛美利嗪是二苯基哌嗪類新一代的鈉、鈣雙通道拮抗劑，臨床上廣泛用于偏頭痛的治療［16］。有證據(jù)表明偏頭痛患者體內(nèi)可能存在神經(jīng)源性炎癥［17］，在家族遺傳性偏癱型的偏頭痛轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)小鼠模型體內(nèi)也檢測到三叉神經(jīng)節(jié)中有較高TNF-α、IL-6 和IL-1β 等促炎細(xì)胞因子的 mRNA 表達(dá)［18-19］，提示洛美利嗪作為高效低毒的偏頭痛治療藥物，可能也具有一定的抗炎活性。然而關(guān)于洛美利嗪的抗炎活性和巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用目前知之尚少，有待進(jìn)一步的開發(fā)研究。

本研究中我們以LPS 和IL-4 體外刺激小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）和小鼠巨噬細(xì)胞株Raw 264.7，檢測洛美利嗪對于巨噬細(xì)胞極化的影響，并探討其可能機(jī)制。

材料和方法

1 主要材料

洛美利嗪（純度大于99%）購于愛必信（上海）生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)液、RPMI-1640 培養(yǎng)液、胰蛋白酶、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）和胎牛血清購于Thermo Fisher；100×青霉素/鏈霉素購自上海翌圣生物有限公司；Ym-1 抗體購于 STEMCELL；Fizz-1 抗體購于Abcam；p38 MAPK、p-p38 MAPK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、p-ERK1/2、c-Jun 氨基末端激酶 1/2（c-Jun N-terminal kinase 1/2，JNK1/2）、p-JNK1/2、iNOS、Arg-1、NF-κB p65、p-p65、NF-κB抑制因子α（NF-κB inhibitor α，IκBα）、STAT6、p-STAT6 和 β-actin 抗體購自Cell Signaling Technology；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒購于R&D；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒購于TOYOBO。

本實(shí)驗(yàn)中所用小鼠為 6～8 周齡、體重20～25 g 的SPF 級野生型C57BL/6小鼠（雌雄不限），購于上海實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證：No.20180003000592），飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，環(huán)境濕度恒定為55%，溫度恒定為25 ℃，光照為12 h循環(huán)，飲食及飲水均自由提供。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合上海交通大學(xué)生物學(xué)研究倫理委員會及國立衛(wèi)生研究院的相關(guān)規(guī)定。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BMDM 所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液。取6～8周齡野生型小鼠，處死后分離后肢脛骨和股骨，在無菌環(huán)境內(nèi)將骨髓沖出，加入10 μg/L M-CSF 培養(yǎng)3 d進(jìn)行換液，補(bǔ)加M-CSF 繼續(xù)培養(yǎng)2 d后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Raw 264.7細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液。細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，在細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，及時進(jìn)行傳代、接種和凍存。

2.2 RT-qPCR 對于M1 型極化實(shí)驗(yàn)，將狀態(tài)良好的 BMDM 或 Raw 264.7 細(xì)胞以每孔 1×106接種至 6 孔板，過夜培養(yǎng)，共分為4組：對照組、LPS 刺激組、洛美利嗪和LPS 共刺激組以及小白菊內(nèi)酯和LPS 共刺激組，待細(xì)胞長滿約80%～90%時，在洛美利嗪和LPS共刺激組加入10 μmol/L 洛美利嗪預(yù)孵育0.5 h，在小白菊內(nèi)酯和LPS 共刺激組，加入10 μmol/L 小白菊內(nèi)酯預(yù)孵育0.5 h，隨后在對照組以外的其他組加入100 μg/L LPS 刺激 6 h 后收樣檢測。對于 M2 型極化實(shí)驗(yàn)，將狀態(tài)良好的BMDM 或Raw 264.7 細(xì)胞以每孔 1×106接種至6 孔板，過夜培養(yǎng)，共分為 3 組：對照組、IL-4 刺激組以及洛美利嗪和IL-4 共刺激組，待細(xì)胞長滿約80%～90%時，在洛美利嗪和IL-4 共刺激組加入10 μmol/L 洛美利嗪預(yù)孵育0.5 h，隨后在對照組以外的其他組加入10 μg/L IL-4 刺激6 h 后收樣檢測。使用Trizol 法提取細(xì)胞樣本總RNA，使用Nano-Drop 2000 微量分光光度計進(jìn)行RNA 定量。按照說明書完成反轉(zhuǎn)錄，獲得模板cDNA。根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR 檢測試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3 個復(fù)孔，求平均值，通過分析ΔΔCt值，進(jìn)行定量計算，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次。以 2-ΔΔCt法測定相關(guān)分子的 mRNA 相對表達(dá)量。IL-6 的上游引物序列為5'-TACCACTTCACAAGTCGGAGGC-3'，下游引物序列為5'-CTGCAAGTGCATCATCGTTG-3'；IL-1β 的上游引物序列為5'-TGGACCTTCCAGGATGAGGACA-3'，下游引物序列為 5'-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3'；TNF-α 的上游引物序列為5'-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3'；Arg-1 的上游引物序列為5'-CATTGGCTTGCGAGACGTAGAC-3'，下游引物序列為5'-GCTGAAGGTCTCTTCCATCACC-3'；Fizz-1 的上游引物序列為5'-GAACGCGCAATGCTCCTTTGAG-3'，下游引物序列為5'-AGCCACAAGCACATCCAGTGAC-3'；Ym-1 的上游引物序列為5'-AGAAGGGAGTTTCAAACCTGGT-3'，下游引物序 列 為 5'-CTCTTGCTGATGTGTGTAAGTGA-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3'，下游引物序列為5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'。

2.3 Western blot 分析 將狀態(tài)良好的BMDM 或Raw 264.7 細(xì)胞以每孔 1×106接種至 6 孔板，共分為 5組：對照組、單獨(dú)（10 μg/L IL-4 或100 μg/L LPS）刺激組及 3、10 和 30 μmol/L 洛美利嗪預(yù)處理組。過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿約80%～90%時，在洛美利嗪預(yù)處理組加入 3、10 和 30 μmol/L 洛美利嗪預(yù)孵育 0.5 h，隨后在對照組以外的其他組內(nèi)加入10 μg/L IL-4或100 μg/L LPS 刺激0.5 h 或24 h 后收樣檢測。棄去上清，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，用預(yù)冷的PBS 沿壁輕輕清洗，將 PBS 吸凈棄去，每孔加入 150 μL 1× loading buffer 后靜置5 min，用細(xì)胞刮板將細(xì)胞充分裂解，并將裂解完全的細(xì)胞收集起來，金屬浴加熱10 min 后樣品制備完成。將樣品（上樣量一般為7 μL）與Marker（2 μL）逐個加入至 10% SDS-PAGE 凝膠樣品槽內(nèi)；開始電泳用80 V 壓膠待樣品濃縮至平后再改用120 V，電泳至藍(lán)色液條帶到凝膠底部為止；電泳結(jié)束后，將樣品從凝膠轉(zhuǎn)移到NC 膜上。剪下比凝膠大小略大的NC 膜，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中操作，電壓保持在110 V，時間90 min，冰水浴完成轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后取出已帶有蛋白樣的NC膜放進(jìn)5%脫脂牛奶中封閉1 h，在室溫?fù)u床上孵育。棄去牛奶，用1× TNET緩沖液洗去多余的牛奶，加入相對應(yīng)的Ⅰ抗，放入4 ℃冰箱里的搖床上，慢搖，孵育過夜?；厥闸窨谷芤海?× TNET 緩沖液洗3 次膜，每次為7 min。加入帶有HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫?fù)u床孵育2 h。1×TNET 緩沖液洗 3 次膜，每次 10 min；將 ECL 底物 A 與 B 以 1∶1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，盡量避光，用吸水紙吸干NC 膜上的殘余液，膜上滴滿配好的顯影液，并用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。將曝光后的條帶用ImageJ 軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.4 ELISA 分析 將狀態(tài)良好的BMDM 或Raw 264.7 細(xì)胞以每孔 1×106接種至 6 孔板，過夜培養(yǎng)，共分為 4 組：對照組、LPS 刺激組、洛美利嗪和 LPS 共刺激組以及小白菊內(nèi)酯和LPS 共刺激組。待細(xì)胞長滿約80%～90%時，在洛美利嗪和LPS 共刺激組加入10 μmol/L 洛美利嗪預(yù)孵育0.5 h，在小白菊內(nèi)酯和LPS共刺激組，加入10 μmol/L 小白菊內(nèi)酯預(yù)孵育0.5 h，隨后在對照組以外的其他組加入100 μg/L LPS 刺激24 h 后收集上清，用于檢測細(xì)胞上清培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的表達(dá)水平。提前1 天鋪板，按照所需檢測的量配制Capture Antibody（120 倍稀釋），每孔加入0.1 mL，室溫孵育過夜，第2 天棄去液體，用PBST 溶液洗3 遍，然后加入3%BSA 溶液，每孔加入0.2 mL，室溫孵育2 h，棄去液體，PBST 溶液清洗3 遍，然后加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，每孔加入0.1 mL，室溫孵育2 h，棄去液體，PBST溶液清洗3次，之后按照所需檢測的量配制 Detection Antibody（60 倍稀釋），每孔加入 0.1 mL，室溫孵育 2 h，棄去液體，PBST 溶液清洗3 次，然后加入40 倍稀釋的HRP 溶液，避光孵育1 h，然后棄去液體，PBST溶液清洗3次，隨后加入底物緩沖液避光孵育20 min 后加入終止液，按說明書在特定的吸光度處進(jìn)行檢測，然后根據(jù)吸光度進(jìn)行換算，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prim 8.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為至少3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 洛美利嗪對巨噬細(xì)胞M1型極化的影響

本研究中以小白菊內(nèi)酯（parthenolide）作為陽性藥物，檢測了洛美利嗪對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1 型極化的影響。我們首先檢測了LPS 刺激下BMDM 和Raw 264.7 細(xì)胞炎癥因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表達(dá)。結(jié)果顯示了 LPS 刺激 6 h 后 BMDM 中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平顯著升高（P＜0.01），而 10 μmol/L 洛美利嗪預(yù)處理顯著抑制了BMDM 中TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平（P＜0.01），見圖 1A。如 圖 1B 所 示 ，LPS 刺 激 6 h 后 ，Raw 264.7 細(xì) 胞 中TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平升高，10 μmol/L洛美利嗪預(yù)處理顯著抑制了Raw 264.7 細(xì)胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平（P＜0.01）。

Figure 1.The effect of lomerizine on the inflammatory cytokine release of M1 macrophages.A：the mRNA expression levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced BMDM detected by RT-qPCR；B：the mRNA expression levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by RT-qPCR.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs LPS group.圖1 洛美利嗪對M1型巨噬細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的影響

同時對細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的分泌進(jìn)行檢測顯示，LPS 誘導(dǎo)的 BMDM 及 Raw 264.7 細(xì)胞中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 分泌均可以被洛美利嗪抑制（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The effect of lomerizine on the inflammatory cytokine secretion of M1 macrophages.A：the secretion of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced BMDM detected by ELISA；B：the secretion of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by ELISA.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖2 洛美利嗪對M1型巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌的影響

為了檢測LPS 刺激后洛美利嗪對巨噬細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物的影響，我們分別檢測了LPS刺激24 h后BMDM 和Raw 264.7 細(xì)胞中iNOS 蛋白的表達(dá)水平。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 刺激 BMDM 和Raw 264.7 細(xì)胞24 h 后，iNOS 蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；3、10 和 30 μmol/L 洛美利嗪預(yù)處理巨噬細(xì)胞0.5 h 可劑量依賴性地下調(diào)iNOS 的蛋白水平（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.The effect of lomerizine on expression of M1 polarization marker in macrophages.A：the protein level of iNOS in LPS-induced BMDM detected by Western blot；B：the protein level of iNOS in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by Western blot.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖3 洛美利嗪對巨噬細(xì)胞M1型極化標(biāo)志物的影響

2 洛美利嗪對巨噬細(xì)胞M2型極化的影響

為了進(jìn)一步探究洛美利嗪抗炎活性，我們隨后檢測了洛美利嗪對巨噬細(xì)胞M2 型極化的影響。用IL-4 刺激 BMDM 6 h 后，與 IL-4 處理組相比，10 μmol/L 洛美利嗪預(yù)處理能夠顯著增加M2 型極化標(biāo)志物Arg-1、Fizz-1 和 Ym-1 的 mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01），見圖 4A。用 IL-4 刺激 Raw 264.7 細(xì)胞 6 h 后，與IL-4處理組相比，10 μmol/L 洛美利嗪預(yù)處理顯著上調(diào)了M2 型極化標(biāo)志物 Arg-1、Fizz-1 和 Ym-1 的 mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05），見圖4B。

Figure 4.The effect of lomerizine on the mRNA expression of M2 polarization markers in macrophages.A：the mRNA expression of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in IL-4-induced BMDM detected by RT-qPCR；B：the mRNA expression of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in IL-4-induced Raw 264.7 cells detected by RT-qPCR.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs IL-4 group.圖4 洛美利嗪對巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的洛美利嗪預(yù)處理兩種巨噬細(xì)胞后，M2 型極化標(biāo)志物Arg-1、Fizz-1和Ym-1的蛋白水平隨著洛美利嗪濃度的增加而上調(diào)（P＜0.05），見圖5。

Figure 5.The effect of lomerizine on the protein expression of M2 polarization markers in macrophages.A：the protein levels of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in LPS-induced BMDM detected by Western blot；B：the protein levels of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by Western blot.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs IL-4 group.圖5 洛美利嗪對巨噬細(xì)胞M2型極化標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

3 洛美利嗪通過MAPK 和NF-κB 信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化

接下來我們檢測了洛美利嗪是否通過調(diào)控MAPK、NF-κB 和 STAT6 信號通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化。結(jié)果顯示，洛美利嗪能夠劑量依賴性地降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中 p38 MAPK、ERK1/2、JNK1/2 和NF-κB p65 的磷酸化水平（P＜0.01），同時顯著增加IκBα 的表達(dá)（P＜0.01），見圖6A、7A。此外，洛美利嗪對IL-4 誘導(dǎo)的STAT6 磷酸化無顯著影響，見圖6B、7B。

Figure 6.The effect of lomerizine on MAPK and NF-κB signaling pathways（A）and STAT6 signaling pathway（B）in BMDM.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖6 洛美利嗪對BMDM 中MAPK、NF-κB和STAT6信號通路的影響

Figure 7.The effect of lomerizine on MAPK and NF-κB signaling pathways（A）and STAT6 signaling pathway（B）in Raw 264.7 cells.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖7 洛美利嗪對Raw 264.7細(xì)胞中MAPK、NF-κB和STAT6信號通路的影響

討 論

洛美利嗪是二苯基哌嗪類的非甾體類新一代鈉、鈣雙通道拮抗劑。與同類藥物相比，它可以選擇性的擴(kuò)張血管，作用時間長，對腦缺血和腦缺氧起到保護(hù)作用，而且無錐體外系副作用，臨床上普遍應(yīng)用于偏頭痛的治療［20-21］。有研究表明偏頭痛與神經(jīng)源性炎癥有密切的聯(lián)系，提示了洛美利嗪有潛在的抗炎活性［16，18，20］。本研究中檢測到洛美利嗪可以顯著降低M1型巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，表明洛美利嗪在外周也能發(fā)揮抗炎作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答，這為洛美利嗪的老藥新用開辟了新思路。目前關(guān)于洛美利嗪的研究主要集中在其神經(jīng)保護(hù)作用方面，包括對氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)毒性［22］和記憶損傷［23］、視神經(jīng)損傷［24-25］以及陣發(fā)性眩暈［26］的恢復(fù)作用等。然而關(guān)于洛美利嗪對免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚未有深入探究，腦內(nèi)存在的小膠質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在功能上有許多類似之處，小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)炎癥反應(yīng)中同樣具有重要調(diào)控作用。本研究的結(jié)果表明洛美利嗪可能也能夠影響神經(jīng)炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞功能，提示洛美利嗪的適應(yīng)證可能并不局限于此。

巨噬細(xì)胞在外界刺激下會發(fā)生極化，表型、形態(tài)及功能發(fā)生改變，顯著增加其吞噬和殺傷能力［8］，同時釋放大量細(xì)胞因子，觸發(fā)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞受到LPS 刺激后通常向M1 型極化，并釋放大量炎癥因子，加劇炎癥反應(yīng)［27］。iNOS 是調(diào)控 NO 產(chǎn)生的 M1 型巨噬細(xì)胞中特征性酶［28］。IL-4 刺激巨噬細(xì)胞后則會促進(jìn)其抗炎因子表達(dá)并向M2型極化［1，29］。本研究檢測到洛美利嗪在體外不僅能夠降低巨噬細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生并下調(diào)iNOS 的表達(dá)，還能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 型標(biāo)志物的表達(dá)。洛美利嗪對巨噬細(xì)胞極化的雙重作用揭示其具有良好的抗炎活性。

NF-κB 是炎癥早期的重要調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)許多不同的免疫反應(yīng)和相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控［30］，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6 和TNF-α 等促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，放大炎癥信號。由于活化NF-κB 亞基的組成存在著兩種形式，即促炎的p65/p50 M1 型和抗炎的p50/p50 M2 型，使得NF-κB 信號通路在巨噬細(xì)胞不同應(yīng)答模式下發(fā)揮不同作用［31-32］。MAPK 也是 LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的重要信號通路之一，可以激活JNK、ERK和p38 MAPK等亞群，然后再作用于各自的配體和底物，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)［33-34］。此外也有研究顯示 MAPK 信號通路能參與巨噬細(xì)胞 M1/M2 轉(zhuǎn)化［35］。STAT6 是IL-4 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號分子，而STAT6 與Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)期間M2 巨噬細(xì)胞激活有關(guān)，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放抗炎因子，從而發(fā)揮抗炎作用［3，15］。小白菊內(nèi)酯作為經(jīng)典的抗炎化合物，普遍認(rèn)為可以有效抑制LPS 誘導(dǎo)的M1 型巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)［36］，且有證據(jù)證明其對NF-κB 和 MAPK 信號通路具有調(diào)控作用［36-37］，尚無研究顯示小白菊內(nèi)酯能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 型極化。本研究結(jié)果顯示洛美利嗪也可以抑制NF-κB 和MAPK信號通路過度活化，但其對IL-4/STAT6 的活化無顯著影響。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使之一，調(diào)節(jié)很多重要的生理過程［38］。LPS 被證明可以促發(fā)小鼠巨噬細(xì)胞胞漿中的鈣離子流，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生［39-41］。我們推測洛美利嗪作為一種非選擇性的鈣通道拮抗劑，可能通過作用于鈣通道蛋白，減少LPS 刺激下巨噬細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+的濃度進(jìn)而影響下游信號NF-κB 和MAPK通路，從而抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，而STAT6信號通路可能不受其影響。

在本研究中，我們檢測到洛美利嗪能夠抑制抑制巨噬細(xì)胞M1 型極化以及促進(jìn)M2 型極化，其機(jī)制可能與調(diào)控MAPK 信號通路中p38 MAPK、ERK1/2、JNK1/2 的活化和 NF-κB 信號 通 路中 NF-κB p65、IκBα的活化及表達(dá)有關(guān)。