藍光對小鼠血壓及血管內皮功能影響的研究

唐名揚，馮健，歐登科，郎明健，韓乾國，鄒文淑，劉朝暉，李霜

最新調查研究顯示，2012～2015年我國成人高血壓患病率為27.9%，且患病率呈逐漸升高趨勢[1]。高血壓發(fā)病機制復雜，與遺傳因素、神經機制、精神及生活方式等多種因素有關，其中生活方式在高血壓的發(fā)展中起主導作用[2-3]。Donneyong 等[4]研究表明，夏季時人體血壓、心血管疾病發(fā)病率和死亡率均低于冬季，與陽光照射時間及強度密切相關。上述研究提示陽光照射可能對心血管疾病具有一定保護作用，但是具體機制尚不明確。

陽光主要由紅外線和微波構成，其次為可見光和紫外線。目前對陽光生物效應的研究主要集中在紫外線上，但紫外線能夠引起細胞內脂質、輔酶以及DNA 出現氧化損傷，從而導致癌癥的發(fā)生[5-6]，最終阻礙了其在臨床疾病中的應用和發(fā)展。與之相反，近年來對陽光中藍光的研究顯示出其對多種疾病具有潛在價值，使其成為陽光生物效應新的研究熱點。Manuel 等[7]研究表明，模擬陽光中的可見藍光對人體的照射后，能夠通過將皮膚內一氧化氮（NO）代謝產物釋放到循環(huán)血液中，從而改善血壓、內皮功能和動脈僵硬度，提示藍光存在調節(jié)血壓的潛能。但是，藍光調節(jié)血壓及血管內皮功能的機制尚不明確，深入研究這一問題對高血壓病的防控具有重要意義。因此，本研究在前期實驗的基礎上，使用血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導小鼠血壓升高為模型，旨在探索藍光在小鼠血壓調節(jié)中的作用及對血管內皮功能的影響，以期為高血壓的預防及治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物:8 周齡SPF 級雄性C57BL6/J 野生型（WT）小鼠100 只，體重（25.44±3.22）g，健康狀況良好，由成都達碩實驗動物有限公司提供。于中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心SPF 級動物房飼養(yǎng)2 周，飼料為SPF 級小鼠飼料，飲用滅菌水，恒溫23℃～25℃，恒濕（55±5）%，日夜規(guī)律光照各12 h。

主要儀器及試劑：藍光光源、對照光光源 [型號：HL-A-5730D34W-S1-08-HR3（LY），廣州鴻利光電股份有限公司]；小鼠智能無創(chuàng)血壓計（型號Softron BP-2010A,北京軟隆生物技術有限公司）；微型滲透泵(美國Alzet 公司)；小鼠NO、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及內皮素-1（ET-1）檢測試劑盒（武漢默沙克公司）；-80℃超低溫冰箱、-20℃低溫冰柜、4℃冷藏冰箱（中國海爾公司）；超凈工作臺（中國富康凈化儀器設備）；離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.2 實驗方法

動物實驗分組：先取20 只WT 小鼠隨機均分為對照光組（CL組）及藍光組（BL組），每組各10 只，觀察各組小鼠血壓變化；另取WT 小鼠40 只，隨機分為4組：對照光+假手術組（CLS組）、對照光+手術組（CLO組）、藍光+假手術組（BLS組）及藍光+手術組（BLO組），每組各10 只，手術組利用Ang Ⅱ微型滲透泵干預建立高血壓小鼠，假手術組利用生理鹽水干預，在手術后即刻開始使用對照光或藍光照射，觀察各種小鼠血壓變化；為進一步研究藍光對小鼠血壓影響的內在機制，再取40 只WT小鼠，隨機分為對照光+正常血壓組（CLN組）、藍光+正常血壓組（BLN組）、對照光+高血壓組（CLH組）及藍光+高血壓組（BLH組），利用Ang Ⅱ/生理鹽水微型滲透泵建立各組模型小鼠，在高血壓小鼠模型成功后開始使用對照光或藍光照射，并觀察各種小鼠血壓變化。

高血壓動物模型建立：小鼠稱重后用異氟烷麻醉小鼠，固定于手術臺上，將兩肩胛骨間背部毛發(fā)剔除，并進行皮膚消毒，做0.5 cm 左右小切口，鈍性分離皮下，埋入預制Ang Ⅱ或0.9% 生理鹽水的微型滲透泵，縫合皮下及皮膚，Ang Ⅱ以400 ng/（kg·min）的速度連續(xù)灌注27 d。

尾夾法測定小鼠血壓：采用Softron BP-2010A小鼠無創(chuàng)血壓測定儀測定CL組及BL組在相應干預前、干預期間及干預后100 min 血壓值，在干預60 min 內及干預停止后100 min 內分別間隔10 min及20 min 多次重復測量小鼠血壓；CLS組、CLO組、BLS組及 BLO組小鼠于每日上午8 時進行30 min 藍光及對照光照射，并于手術當天及術后前10 d 每天測量血壓，此后間隔4 d 測量血壓，直至術后27 d；CLN組、BLN組、CLH組及BLH組前10 d 每天檢測小鼠血壓，此后間隔2 d 測量血壓，測定前在小鼠安靜、清醒狀態(tài)下將傳感器套在小鼠尾部，通過充氣、放氣對尾動脈加壓和釋壓的同時監(jiān)測血流信號，得出尾動脈血壓值，收縮壓、舒張壓連續(xù)測量3 次，取其平均值。

光房：對照光房與藍光房長寬高均為3 m×4 m×3 m，房間內安裝空調恒溫23℃～25℃，小鼠置于鼠籠內，對照光房內置于對照光源，波長為592 nm，藍光房內放置藍光光源，藍光波長為469 nm，兩組燈光放置在離皮膚40～60 cm 之間的距離處，輻照度水平約為42 mW/cm2，6 h 以上強度變化＜10%，6 h以上溫度變化＜10℃。

酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測NO 及eNOS 生成：收集各組血液標本，予以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝靜置15 min，1 000 g 離心15 min，收集上清，將樣品與標準品加入96 孔板中，37℃溫育30 min，洗板5 次，加入酶標試劑50 μl，37℃溫育30 min，洗板5 次，加入顯色液，37℃避光顯色15 min，加入終止液50 μl，15 min 內450 nm 波長依序測量各孔吸光度（OD 值）并處理數據[8]。

ELISA 檢測ET-1 生成：收集各組血液標本，予以EDTA 抗凝靜置15 min，1 000 g 離心15 min，收集上清，標本用標本稀釋液1：1 稀釋后將樣品與標準品加入96 孔板中，加入50 μl 的生物素標記的抗體，37℃溫育1 h，洗板5 次，每孔加入50 μl 的親和鏈酶素-辣根過氧化物酶（SA-HRP），37℃溫育30 min，洗板5 次，每孔加入底物A、B 各50 μl，37℃避光顯色15 min，加入終止液50 μl，15 min 內450 nm 波長依序測量各孔吸光度（OD 值）并處理數據[9]。

1.3 統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 16.0 及GraphPad Prism 6 軟件進行統(tǒng)計分析。小鼠血壓指標以均數±標準誤（）表示；ET-1、eNOS、NO 指標使用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用重復測量方差分析，方差齊進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊采用非參數檢驗，每組各時間點減去本身基線所得差值表示血壓變化（Δ），用均數±標準誤（）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藍光對正常小鼠血壓的影響（圖1A、1B）

圖1 藍光對正常小鼠血壓影響的變化值（n=10，）

CL組與BL組小鼠來自同一批次，血壓基線一致，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。BL組小鼠收縮壓在藍光開始照射時即有下降趨勢，并在照射30 min時下降最顯著，與CL組相比，BL組收縮壓也降低（P＜0.05）。此后BL組小鼠收縮壓隨著藍光繼續(xù)照射呈上升趨勢，照射60 min 時停止照射，在藍光停止照射20 min 后回到基線值附近。BL組小鼠的舒張壓在藍光照射前、照射60 min 內以及停止照射100 min 均無明顯變化（P均＞0.05），與CL組相比，各個時間點差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。CL組小鼠在進入前、暗室內40 min以及此后2 h的收縮壓、舒張壓均無明顯變化，各時間點差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

2.2 藍光對Ang Ⅱ誘導過程中小鼠血壓的影響

CLS組、CLO組、BLS組與BLO組小鼠來自同一批次，血壓基線一致，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。CLS組小鼠在藍光照射27 d 內血壓在基線值附近波動；BLS組小鼠于藍光照射后第1 天至第7天血壓在基線值附近波動，第7 天至第27 天血壓始終處于基線值之下，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

CLO組小鼠在Ang Ⅱ泵入第2 天可見血壓有升高趨勢，隨后血壓逐漸升高，并在第7 天血壓達到最高點。與CLS組比較，收縮壓升高了（45.10±4.51）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），舒張壓升高了（53.60±3.10）mmHg（P均＜0.05），隨后進入平臺期，到第27 天血壓仍維持較高水平且血壓波動不明顯（圖2A、2B）。

圖2 藍光影響Ang Ⅱ誘導過程中小鼠血壓的變化趨勢（n=10，）

BLO組小鼠在Ang Ⅱ泵入后第2 天可見血壓升高趨勢，隨后血壓持續(xù)升高，并于第10 天到達平臺期。與CLS組比較，收縮壓升高了（37.70±4.14）mmHg，舒張壓升高了（48.20±4.41）mmHg（P均＜0.05）；與CLO組相比，BLO組小鼠血壓升高緩慢，血壓升高幅度較低，收縮壓相差（-9.10±4.31）mmHg，舒張壓相差（-7.20±3.30）mmHg（P均＜0.05）；此后進入平臺期，直到第27 天血壓維持在較高水平且波動不明顯（圖2A、2B）。

2.3 藍光對高血壓小鼠血壓的影響

予以Ang Ⅱ誘導形成高血壓小鼠模型，CLH組小鼠血壓始終維持在高水平，BLH組在藍光干預的第5 天可見血壓下降趨勢，隨后繼續(xù)緩慢下降，并于第14 天血壓降至最低，與CLH組比較，BLH組小鼠血壓顯著降低，收縮壓相差（-7.50±5.41）mmHg，舒張壓相差（-7.10±4.06）mmHg（P＜0.05），隨后進入平臺期，直到第24 天兩組小鼠血壓無明顯波動（圖3A，3B）。

圖3 藍光影響高血壓小鼠血壓的變化趨勢（n=10，）

2.4 藍光對高血壓小鼠eNOS、ET-1及NO的影響（表1）

表1 各組小鼠藍光照射前后血清中eNOS、ET-1、NO 的含量變化（）

表1 各組小鼠藍光照射前后血清中eNOS、ET-1、NO 的含量變化（）

注：CLN組：對照光+正常血壓組；BLN組：藍光+正常血壓組；CLH組：對照光+高血壓組；BLH組：藍光+高血壓組；eNOS：內皮型一氧化氮合酶；ET-1：內皮素-1；NO：一氧化氮。與CLN組比較*P＜0.05；與CLH組比較ΔP＜0.05

高血壓小鼠模型建立成功后按計劃隨機分組并干預，于藍光照射第14 天分別測量各組小鼠血漿中eNOS、ET-1 及NO 的含量，與CLN組相比，CLH組和BLH組小鼠血清中eNOS 及NO 含量減少，ET-1 含量增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與CLH組相比，BLH組血清中eNOS 及NO 含量明顯升高，而ET-1 含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

3 討論

越來越多的研究表明，陽光照射與人類健康密切相關，陽光照射與人的全因死亡率呈反比[10-11]。心血管疾病領域眾多研究[4]表明，人體血壓在夏季持續(xù)低于冬季，心血管死亡率及發(fā)病率于冬季時最高，同時與陽光照射時間呈負相關；Manuel 等[7]發(fā)現，對健康成年人進行全身藍光30 min 照射后，能夠明顯降低人體收縮壓。我們的研究發(fā)現，健康小鼠經469 nm 藍光照射后，收縮壓呈持續(xù)下降趨勢，于藍光照射30 min 時下降最明顯，當繼續(xù)進行藍光照射時，收縮壓變化不明顯并有升高的趨勢，在停止藍光照射后，小鼠收縮壓逐漸升高到基線附近，而小鼠舒張壓在整個藍光照射中波動不明顯。以上數據說明正常血壓小鼠經藍光短時間（30 min）照射能夠使收縮壓明顯降低，這為我們探索藍光對高血壓小鼠血壓的影響提供了研究基礎。

為進一步探究藍光是否可以預防小鼠高血壓的形成，我們使用Ang Ⅱ誘導小鼠血壓升高，對小鼠進行Ang Ⅱ干預的同時，給予每日固定時間（8：00）30 min 藍光照射，結果發(fā)現，與CLO組小鼠比較，BLO組小鼠血壓升高的速率減慢，到達平臺期的時間延長，且血壓升高的程度較低，說明藍光能夠延緩并減輕Ang Ⅱ誘導過程中導致的小鼠血壓升高。接著，我們研究了藍光對高血壓小鼠血壓的影響，用Ang Ⅱ誘導形成高血壓小鼠模型，并給予每日固定時間（8：00）30 min 藍光照射，結果顯示，高血壓小鼠于藍光照射后第5 天血壓呈現下降趨勢，并于第14 天血壓下降最顯著，說明藍光能夠降低高血壓小鼠的血壓。

既往Opl?nder 等[12]研究表明，藍光照射能夠增加人體皮膚中游離NO 的水平，并能夠使增加的NO 從皮膚表面轉移到皮膚下面的組織中，從而增加健康受試者局部皮膚的血流量；Manuel 等[7]發(fā)現，全身藍光照射可以分解皮膚中對光不穩(wěn)定的氮氧化物，釋放NO 進入循環(huán)血液，從而降低大動脈僵硬度，并且能夠通過使阻止動脈擴張來降低收縮壓。為進一步明確藍光對小鼠血壓影響的內在機制，我們檢測了高血壓小鼠開始照射藍光前及照射藍光后第14天時血漿中eNOS 和NO 的含量，結果發(fā)現高血壓小鼠經每日固定時間（8：00）藍光照射30 min，干預14 d 后，血液中eNOS 及NO 的含量顯著增加；同時我們還檢測了小鼠體內縮血管物質ET-1 的含量，我們發(fā)現高血壓小鼠經每日固定時間（8：00）藍光照射30 min，14 d 后，血液中ET-1 的含量顯著降低。

血管內皮功能障礙是高血壓形成的主要原因，內皮依賴性收縮功能增強與內皮依賴性舒張功能減弱是其主要表現。在病理條件下，內皮合成縮血管物質ET-1 產生增多，舒血管物質NO 產生減少，從而引起血管劇烈收縮，導致高血壓的形成，故NO 與ET-1 是衡量血管內皮功能的重要指標[13-14]。我們發(fā)現，藍光有助于維持高血壓小鼠體內NO/ET-1 的平衡，說明藍光可以改善高血壓小鼠的血管內皮功能。

近期，Ortiz 等[15]研究表明，藍光通過調節(jié)人體晝夜節(jié)律改善輕度顱腦外傷患者預后；Killgore 等[16]探索發(fā)現，短波（450 nm）藍光可以通過非視覺G 蛋白偶聯受體黑素介導大鼠肺血管擴張;Bartman 等[17]闡明了在缺血及再灌注損傷中，藍光能夠通過增強糖酵解減輕心肌梗死面積，提高心功能。因此，我們推測：藍光對小鼠血壓及內皮功能的調節(jié)可能是通過調節(jié)晝夜節(jié)律或通過皮膚NO 途徑實現的，具體機制將在下一步研究中論證。

總之，我們發(fā)現，正常小鼠接受30 min 藍光照射能夠使其收縮壓下降；長期每日藍光照射能夠延緩Ang Ⅱ誘導小鼠形成高血壓、降低血壓升高的程度；高血壓小鼠接受每日藍光照射后血壓顯著下降，同時改善高血壓小鼠血管內皮功能，這為藍光在高血壓防控方面提供了一定的研究基礎和理論依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突