慢性心力衰竭與外周血白細(xì)胞端粒長度的相關(guān)性

張秀麗，吳智業(yè)，王秋實(shí)，繆 緋，李和慨，陳敏生

（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心內(nèi)科∕∕珠江醫(yī)院心臟中心實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510280；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050）

端粒位于人類染色體的末端，保護(hù)著染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和遺傳完整［1］，它的初始長度由遺傳和環(huán)境因素決定［2-5］。生理和病理老化的修復(fù)過程伴隨著細(xì)胞分裂，在細(xì)胞分裂時(shí)，脫氧核糖核酸（deoxyri‐bonucleic acid，DNA）聚合酶不能完全復(fù)制端粒，從而導(dǎo)致端粒累積磨損。當(dāng)端粒達(dá)到臨界長度時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制性衰老，發(fā)生凋亡或基因不穩(wěn)定［6-7］。因此，端粒長度在維持DNA 的完整性和細(xì)胞的健康方面起著至關(guān)重要的作用。端粒長度與很多心血管疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)［8-10］，而許多心血管疾病與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)，慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是其中之一［11-13］。氧化應(yīng)激和炎癥是加速端?？s短和生物衰老的主要環(huán)境因素。國外有臨床研究顯示CHF 與端粒長度相關(guān)［14］。白細(xì)胞端粒長度易于檢測，若端粒長度對診斷CHF 有價(jià)值，則其不僅是CHF 的潛在生物標(biāo)志物，還可能是導(dǎo)致CHF 發(fā)生的危險(xiǎn)因素。而國內(nèi)還未見報(bào)道關(guān)于CHF 與端粒長度的相關(guān)性研究，為了研究中國漢族人群的端粒長度與CHF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是否相關(guān)，我們檢測并分析了117 位非CHF（Non-CHF）患者和107位CHF患者端粒長度。

1 材料與方法

1.1 研究對象納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

選擇2016 年5 月至2017 年5 月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的患者，均為漢族。根據(jù)左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection frac‐tion，LVEF）分為Non-CHF 和CHF 組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝腎功能不全；②惡性腫瘤；③急性或慢性炎癥。納入標(biāo)準(zhǔn)：入選患者年齡在35 歲到85 歲之間，對照組Non-CHF 患者LVEF 為大于50%，紐約心臟病協(xié)會心功能分級I 級；CHF 組患者的LVEF小于40%，紐約心臟病協(xié)會心功能分級Ⅱ級到Ⅳ級超過3 個(gè)月。一般臨床資料的采集和血液樣本的收集都經(jīng)過入選對象的知情同意，并通過南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2017-XXGNK-001）。

1.2 臨床基本資料

采集所有入選患者的年齡、性別、身高、體質(zhì)量、LVEF、吸煙史、糖尿病史、高脂血癥病史、高血壓病史等。

1.3 端粒長度測定

將采集的外周靜脈血解凍后，分離提取白細(xì)胞DNA，使用Cawthon 描述的實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polynucleotide chain reaction，qPCR）方法測定端粒長度［15］。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，人端粒引物為：Tel1：GGTTTTTGAGGGTGAGGGT‐GAGGGTGAGGGTGAGGGT，Tel2：TCCCGACTATCC CTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA，人對照基因引物為HBG1：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC，HBG2：CACCAACTTCATCCACGTTCACC兩 種。每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行測定，以qPCR 反應(yīng)體系進(jìn)行熱循環(huán)，在熒光定量PCR 儀中完成。端粒的長度由端粒樣本重復(fù)拷貝數(shù)和對照基因的拷貝數(shù)的比值表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，Kolmogorov-Smirnov test 進(jìn)行計(jì)量資料的正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)性分布的計(jì)量資料采用表示，非正態(tài)性分布采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距M（P25～P75）表示；符合正態(tài)分布的兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)性分布兩組間的比較采用Mann-WhitneyUtest。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)Non-CHF 和CHF 組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)以及冠心病（CAD）引起的CHF 和非冠心?。∟on-CAD）引起的CHF 組患者的年齡、LVEF 符合正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)。Non-CHF 和CHF 組患者的年齡、LVEF 以及CAD CHF 和Non-CAD CHF 組患者的心率、體質(zhì)量指數(shù)不符合正態(tài)性分布，采用Mann-WhitneyUtest。計(jì)數(shù)資料性別及吸煙史、高血壓病史、高血脂病史及糖尿病史占比以百分率表示，兩組間的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用二元logistic 回歸分析評估端粒長度與CHF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床基本資料

Non-CHF 組和CHF 組患者分別為117 例、107例，兩組患者的年齡、吸煙史、高血壓病史、心率、高脂血癥病史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、糖尿病病史差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；表1）。

表1 一般臨床資料比較Table 1 Comparison of total participant characteristics［M（P25～P75），］

表1 一般臨床資料比較Table 1 Comparison of total participant characteristics［M（P25～P75），］

CHF：chronic heart failure；Non-CHF：non-chronic heart failure；BMI：body mass index；bmp：beats per minute；LVEF：left ventricular ejection fraction.1）Statistical analysis was performed using t test，2）Statistical analysis was performed using χ2 test，3）Statistical analysis was per‐formed using Mann Whitney U test，between two groups.

2.2 非慢性心力衰竭與慢性心力衰竭患者端粒長度的比較

檢測Non-CHF 與CHF 組患者外周血白細(xì)胞端粒長度分別為0.9（0.64～1.18）、0.7（0.53～0.89），CHF 組患者的端粒長度明顯短于Non-CHF 組患者（圖1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.36，P＜0.001）。

圖1 Non-CHF組與CHF組患者端粒長度的比較Fig.1 Comparison of telomere length between Non-CHF group and CHF group

2.3 非冠心病導(dǎo)致的慢性心力衰竭與冠心病導(dǎo)致的慢性心力衰竭患者端粒長度的比較

我們根據(jù)冠狀動脈脈造影結(jié)果及病史，把入選的CHF 患者分為Non-CAD CHF 組和CAD CHF 組，兩組患者的人數(shù)分別為46例、61例，兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、心率、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；表2）。Non-CAD CHF 組與CAD CHF 組患者的端粒長度分別為0.76（0.55～0.94）、0.65（0.5～0.86），CAD-CHF 組端粒長度稍短（圖2），但是兩組端粒長度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.42，P=1.57）。

表2 兩組CHF患者一般臨床資料比較Table 2 Comparison of general clinical data of patients with CHF ［M（P25～P75），］

表2 兩組CHF患者一般臨床資料比較Table 2 Comparison of general clinical data of patients with CHF ［M（P25～P75），］

CAD CHF：chronic heart failure caused by coronary heart disease；Non-CAD CHF：chronic heart failure caused by non-coronary heart dis‐ease；BMI：body mass index；bmp：beats per minute；LVEF：Left ventricular ejection fraction.1）Statistical analysis was performed using t test，2）Statistical analysis was performed using χ2 test，3）Statistical analysis was performed using Mann Whitney U test，between two groups.

Non-CHF 患者分別與Non-CAD CHF 和CAD CHF 患者的端粒長度進(jìn)行比較，結(jié)果顯示Non-CHF 患者的端粒長度明顯長于Non-CAD CHF 和CAD CHF 患者（圖2），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.67，P=0.008；Z=-4.26，P=0.000）。

圖2 Non-CHF、Non-CAD CHF和CAD CHF組端粒長度的比較Fig.2 Comparison of telomere length among Non-CHF，Non-CAD CHF and CAD CHF groups

2.4 端粒長度與慢性心力衰竭發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

進(jìn)一步分析端粒長度是否與CHF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，以外周血白細(xì)胞端粒長度作為自變量建立Lo‐gistic 回歸模型1（表3），結(jié)果顯示端粒長度與CHF發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（OR=0.17，95% CI 為（0.07，0.40），P＜0.05）。在調(diào)整了性別、BMI、糖尿病等混雜因素后建立Logistic 回歸模型2（表4），結(jié)果顯示端粒長度仍與CHF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)［OR=0.14，95% CI為（0.05，0.33）；P＜0.05］。

表3 Logistic回歸模型1中端粒長度與慢性心力衰竭發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系Table 3 Relationship between telomere length and CHF in logistic regression model 1

表4 Logistic回歸模型2中端粒長度與慢性心力衰竭發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系Table 4 Relationship between telomere length and CHF in logistic regression model 2

3 討論

本研究采用qPCR 測量方法，檢測外周血白細(xì)胞端粒長度，結(jié)果顯示CHF 患者端粒長度比Non-CHF 患者明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.36，P＜0.001）。按病因?qū)HF 患者分為CAD CHF 組和Non-CAD CHF 組，比較兩組端粒長度并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-1.42，P=1.57）。在調(diào)整混雜因素后，Lo‐gistic 回歸分析顯示外周血白細(xì)胞端粒長度與CHF發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)（OR=0.14，95% CI 為（0.05，0.34），P＜0.05）。

外周血白細(xì)胞端粒長度的縮短速率與其他組織保持動態(tài)一致［16］。且外周血白細(xì)胞端粒長度易獲取、無創(chuàng)傷，被廣泛用作其他組織的替代指標(biāo)。用qPCR方法［17］檢測外周血白細(xì)胞端粒長度所需的材料少，并且速度快，是目前測量端粒長度最常用的方法。因此本研究采用了qPCR方法檢測外周血白細(xì)胞端粒長度。

端粒被稱為細(xì)胞的“生物鐘”，是公認(rèn)的細(xì)胞衰老的標(biāo)志［18］。當(dāng)端粒長度達(dá)到一個(gè)臨界時(shí)，將阻止細(xì)胞分裂，并可能導(dǎo)致細(xì)胞功能下降。許多實(shí)驗(yàn)研究觀察到端粒長度與各種衰老相關(guān)的心血管疾病相關(guān)，而CHF 是與衰老相關(guān)的心血管疾病之一，有研究發(fā)現(xiàn)CHF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與端粒長度相關(guān)［19-20］，文獻(xiàn)中報(bào)道對照人群的端粒長度為1.05（0.86～ 1.29），CHF 患者的端粒相對長度為0.64（0.47～0.88）。在我們的研究中Non-CHF 患者的端粒相對長度為0.9（0.64～1.18），CHF 患者的端粒平均相對長度為0.7（0.53～0.89），CHF 患者的端粒長度明顯縮短（Z=-4.36，P＜0.001）。CHF 急性失代償情況會發(fā)生急性心力衰竭，有文獻(xiàn)報(bào)道急性心力衰竭的年齡與端粒長度負(fù)相關(guān)［21］，但是，急性心力衰竭是否與端粒長度相關(guān)還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

有文獻(xiàn)報(bào)道CAD CHF 患者的端粒長度比Non-CAD CHF 患者的明顯縮短［20］，而在我們的研究中，比較CAD CHF 和Non-CAD CHF 患者的端粒長度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組之間的端粒長度并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-1.42，P=1.57）。與文獻(xiàn)報(bào)道不同的原因可能是本研究中兩組CHF 患者的一般資料及LVEF均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而文獻(xiàn)中并未提及這些因素的差別，另外可能的原因是本研究入組患者人數(shù)有限。

以上研究結(jié)果提示端粒長度可能與CHF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)。因此，在調(diào)整混雜因素后，Logistic回歸分析顯示外周血白細(xì)胞端粒長度與CHF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)［OR=0.14，95% CI 為（0.05，0.33），P＜0.05］。但這一研究結(jié)果并不能明確兩者之間的因果關(guān)系，端粒長度的縮短可能是CHF 的危險(xiǎn)因素，也有可能是CHF 加速了端粒長度的縮短，又或者兩者互為因果，需要更多的研究去證實(shí)。