異體真皮基質(zhì)與自體耳屏軟骨-軟骨膜在鼓膜修補(bǔ)中臨床研究分析

王博琛，劉彩鵬，陳炯垣，劉 振

（1.佛山市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科∕∕廣東省聽覺與平衡醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東佛山 528000；2.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東廣州 510220；3.佛山市第一人民醫(yī)院病理科，廣東佛山 528000）

鼓膜穿孔是一種常見的由于炎癥或者外傷引起的耳科疾病，長期鼓膜穿孔易反復(fù)中耳炎，殘余鼓膜鈣化，鼓室硬化以及聽力進(jìn)行性下降［1］。目前，對(duì)于長期的鼓膜穿孔手術(shù)修補(bǔ)是其唯一的治療方法，由于自體材料具有生物相容性好、易獲得、療效好等優(yōu)優(yōu)勢，所以臨床鼓膜修補(bǔ)材料多為自體材料，其中較常用的有：耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物、顳肌筋膜、乳突骨膜等［2-5］。其中耳屏軟骨膜與顳肌筋膜修補(bǔ)效果最佳，由于耳內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)理念，自體材料存在取材后易導(dǎo)致供區(qū)的疼痛、提高了供區(qū)感染的發(fā)生率、二次修補(bǔ)時(shí)供區(qū)取材困難和取材量受限等缺點(diǎn)。為解決以上缺點(diǎn)與適應(yīng)目前的微創(chuàng)手術(shù)理念，生物工程鼓膜材料逐漸應(yīng)用于臨床［6-8］。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為生物工程材料，廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于傷口的修復(fù)以及重建［9-10］，已證明其安全性及有效性。本研究旨在從病理生理學(xué)角度分析脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為鼓膜修補(bǔ)材料的臨床效果，找出一種符合耳微創(chuàng)外科要求的鼓膜修補(bǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選2020 年1 月至2020 年6 月在佛山市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科行鼓膜成形術(shù)的慢性化膿性中耳炎患者74 例回顧性分析，其中23 例使用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為鼓膜修補(bǔ)材料，為A 組，年齡23～52歲；51 例使用耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物作為鼓膜修補(bǔ)材料，為B 組，年齡17～61 歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：①中耳炎干耳控制2 月以上；②緊張部穿孔穿孔，穿孔大小小于6 mm 的非邊緣穿孔；③術(shù)前CT 未見鼓室以及乳突異常，聽力學(xué)檢查：氣骨導(dǎo)差小于15 dB HL的單純鼓室成形術(shù)1型；④隨訪期至少3個(gè)月，并行耳內(nèi)鏡檢查。鼓膜修補(bǔ)術(shù)中取患者修剪后多余的耳屏軟骨膜、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)送病理科切片檢查。本研究資料以及方法均經(jīng)倫理委員會(huì)審核，且對(duì)參與病理研究的患者，均在手術(shù)前已簽署了相關(guān)的之情同意書與個(gè)人信息保密協(xié)議。

1.2 研究方法

1.2.1 手術(shù)方法 所有入組患者均采用全麻下全耳內(nèi)鏡下內(nèi)置法修補(bǔ)鼓膜的手術(shù)方式，由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的手術(shù)者完成。脫細(xì)胞真皮為江蘇優(yōu)創(chuàng)生物醫(yī)學(xué)科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)提供。耳內(nèi)鏡下外耳道骨膜下局部浸潤后，在外耳道峽部做半環(huán)形切口，分離外耳道鼓膜皮瓣至纖維鼓環(huán)，由纖維鼓環(huán)內(nèi)側(cè)進(jìn)入鼓室后，剝離外耳道皮瓣-鼓膜復(fù)合物至外耳道前壁，將鼓膜從錘骨柄上分離。A 組內(nèi)置法將脫細(xì)胞真皮基質(zhì)植入，其中真皮面朝向鼓室，鼓室內(nèi)放置適當(dāng)明膠海綿支撐，復(fù)位外耳道鼓膜瓣，耳內(nèi)鏡檢查鼓膜是否還有裂隙，適當(dāng)調(diào)整移植物位置直到檢查無裂隙后，復(fù)位外耳道鼓膜瓣，局部填塞明膠海綿。B 組：在耳屏游離緣內(nèi)側(cè)少許行縱行切口，分離耳屏軟骨，將耳屏軟骨凸面軟骨膜去除，保留凹面的軟骨膜，軟骨凸面朝鼓室面植入鼓室，余手術(shù)步驟與A組相同。

1.2.2 術(shù)后處理 兩組均安爾碘明膠海綿填塞外耳道兩周。2 組手術(shù)后均給與靜脈抗感染2 天以上，出院后繼續(xù)口服抗感染2 周。術(shù)后2 周取外耳道填塞物。之后1 周最少觀察1 次鼓膜愈合情況，并記錄患者鼓膜表面出現(xiàn)血管生長的時(shí)間以及情況以及修補(bǔ)鼓膜完全上皮化時(shí)間（以手術(shù)時(shí)間為起始時(shí)間，周為統(tǒng)計(jì)單位）。

1.2.3 病理分析 鼓膜修補(bǔ)術(shù)中取患者修剪后多余的耳屏軟骨膜、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)送病理科切片檢查。送檢組織10%甲醛固定，24 h后，脫鈣處理，包埋在石蠟塊里，用切片機(jī)切成薄片，再用蘇木精－伊紅（HE）染色以及行免疫組化CD31 標(biāo)記染色，用顯微鏡進(jìn)一步檢查對(duì)比兩者之間差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0對(duì)研究數(shù)據(jù)分析，研究指標(biāo)有患者年齡、性別等基本資料，以及鼓膜愈合與否，鼓膜血管在耳內(nèi)鏡下爬生地時(shí)間以及鼓膜上皮化時(shí)間等。所有計(jì)量數(shù)據(jù)資料（年齡，聽力情況，鼓膜愈合時(shí)間）符合正態(tài)分布的，以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。而對(duì)于計(jì)數(shù)資料（性別、側(cè)別等）采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床基本資料

兩組患者年齡有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A 組平均年齡39.87 歲（S=12.08），B組平均年齡46.59歲（S=11.77），A 組相對(duì)年齡小些。術(shù)后2 組鼓膜愈合率均為100%，且術(shù)后均無感染等并發(fā)癥出現(xiàn)，兩組之間性別、側(cè)別術(shù)前氣導(dǎo)平均聽閾，術(shù)前氣骨導(dǎo)差值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。但真皮基質(zhì)組顏色較耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物組術(shù)后鼓膜蒼白，血管分布較少，見圖1、2。兩組鼓膜愈合時(shí)間，可見鼓膜表面開始血管爬生時(shí)間真皮基質(zhì)組（3.74±1.05）周，耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物組（2.22±0.42）周，耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物組血管爬生更快，且兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.70，P＜0.01）；鼓膜表面完全上皮化時(shí)間真皮基質(zhì)組（5.35±0.98）周；耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物組（4.00±0.53）周，耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物組上皮化更快，且兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.19，P＜0.01，圖3）。術(shù)后兩組氣導(dǎo)平均閾值（dB HL）：22.35±5.44 和23.41±5.33，較術(shù)前各組氣導(dǎo)聽閾均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。兩組聽力提高值（dB HL）：8.04±2.16 和8.76±1.87，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 兩組手術(shù)前后聽力情況Table 2 Two groups of hearing before and after operation (，dB HL）

表2 兩組手術(shù)前后聽力情況Table 2 Two groups of hearing before and after operation (，dB HL）

AC：air conduction；PTA：Puretone threshold average.There wasstatistical significance in air conduction thresholds before and after operation in Group A and Group B.There was no statistical significance in air conduction thresholds between the two groups before and after operation.There was no statistical significance in hearing improvement between the two groups.

圖1 真皮基質(zhì)組Fig.1 Allogeneic dermal matrix group

圖2 耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物組Fig.2 Traguscomplex cartilage-Perichondrium group

表1 兩組患者臨床基本資料Table 1 Basic clinical data of the two groups()

表1 兩組患者臨床基本資料Table 1 Basic clinical data of the two groups()

AC：air conduction；PTA：Puretone threshold average；ABG：Air-bone gap.

圖3 兩組鼓膜術(shù)后鼓膜血管生長時(shí)間和上皮化時(shí)間均值比較Fig.3 Comparison of the mean values of time-costing of angiogenesis and epithelization the two groups after tym?panoplasty

2.2 組織病理學(xué)染色觀察

病理組織形態(tài)（HE染色）結(jié)果可見脫細(xì)胞真皮基質(zhì)僅為膠原纖維，無血管以及細(xì)胞等活性成分，見圖4A；耳屏軟骨膜中含有膠原纖維血管、細(xì)胞等活性成分（圖4B）；耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物可見致密軟骨膜與軟骨組織，其中大量存在血管，細(xì)胞活性組織以及成骨細(xì)胞等（圖4C）。并行免疫組化CD31 后同樣可見脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中，無細(xì)胞血管等活性成分，僅有纖維組織；耳屏軟骨膜中可見除纖維組織外，可見散在的血管以及細(xì)胞核存在（圖5A、B）。

圖4 組織病理學(xué)觀察Fig.4 Histopathological observation

圖5 組織病理學(xué)免疫組化CD31Fig.5 Histopathology and immunohistochemical staining of CD31

3 討論

鼓膜成形術(shù)，即鼓室成形術(shù)I型，其主要目的是修補(bǔ)鼓膜穿孔，防止中耳炎反復(fù)發(fā)生，提高患者聽力。目前鼓膜成形術(shù)成功率較高，且術(shù)后并發(fā)癥較低，總體成功率高達(dá)81.5%［11］。但是移植物不同，其成功率有較大差別。耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物是自體移植物中成活率最高的，可達(dá)到92%～100%［12-13］，是目前鼓膜成形術(shù)應(yīng)用較多的移植物。并且由于取材方便隱蔽，符合目前的耳內(nèi)鏡下微創(chuàng)手術(shù)的理想，其應(yīng)用廣泛。自體材料組織相容性好，抗感染性高，并且耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物修補(bǔ)鼓膜后鼓膜抗壓性良好，對(duì)于粘連性中耳炎具有良好的支撐效果。但自體移植材料也有不足之處，如：供區(qū)新的切口，過大的取材易致取材區(qū)域外觀變形，提高取材傷口感染的風(fēng)險(xiǎn)［14］；并且二次手術(shù)相對(duì)取材困難，增加了患者痛苦，并且軟骨-軟骨膜復(fù)合物修補(bǔ)的鼓膜透光性差，不易于術(shù)后鼓室積液或膽脂瘤復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)。而組織工程鼓膜可有效的解決以上不足，且更符合目前微創(chuàng)手術(shù)的要求。其具有材料充足，創(chuàng)傷小，操作簡單無須取材，縮短手術(shù)時(shí)間等優(yōu)勢。目前已廣泛的應(yīng)用于臨床創(chuàng)面的保護(hù)等方面。有學(xué)者研究指出單純的鼓膜成形術(shù)，使用耳屏軟骨-軟骨膜或脫細(xì)胞真皮基質(zhì)術(shù)后手術(shù)成功率與改善聽力上無明顯差異［8，15］。

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)主要分兩個(gè)類型：人工合成脫細(xì)胞真皮基質(zhì)和天然脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。本組研究使用的是后者。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)指應(yīng)用物理和化學(xué)方式，去除原皮中的表皮層和真皮細(xì)胞成分，僅保留膠原蛋白、彈力蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的無細(xì)胞真皮支架材料。由于無組織相容性復(fù)合物，所以避免了機(jī)體排斥反應(yīng)［15］，有基底膜、真皮兩個(gè)面。由于缺少細(xì)胞活性成分，這勢必影響了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)鼓膜的促愈合性和抗感染性。

本研究可見自體耳屏軟骨-軟骨膜復(fù)合物愈合速度明顯快于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，這可能與細(xì)胞活性因子介入的創(chuàng)面修復(fù)功能有關(guān)［16］。鼓膜穿孔愈合是一個(gè)復(fù)雜的多因素影響的病理過程，是由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和生物活性分子（如生長因子）之間相互作用和介導(dǎo)地過程［17-18］。在慢性鼓膜穿孔的研究中，不同的生物活性分子均扮演著促進(jìn)或延遲鼓膜愈合的角色。生長因子可廣義上分為5 種主要的家族：表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和胰島素樣生長因子。各種生長因子在鼓膜穿孔修復(fù)過程中起決定性作用，通常在鼓膜損傷時(shí)就已出現(xiàn)，其可以刺激穿孔周圍組織的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖，增強(qiáng)血管通透性，誘導(dǎo)纖維和新血管的生成等，從而促進(jìn)鼓膜的修復(fù)。這包含了：上皮再生，上皮遷移，成纖維細(xì)胞再生，纖維合成及疤痕形成等過程。并且生長因子還可誘發(fā)蛋白酶及膠原酶的生成。進(jìn)一步促進(jìn)新血管生成。組織病理切片可見，由于脫細(xì)胞真皮主要為膠原組織，為防止自身免疫排除，已充分洗脫滅活，所以其內(nèi)無促進(jìn)鼓膜愈合的生長因子，這可能會(huì)導(dǎo)致愈合時(shí)間較自體組織材料愈合長的原因之一［19］。同時(shí)可見自體材料CD31 陽性，而白細(xì)胞的遷移、血管生成和整合素的激活需要CD31 的參與，其多見于血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些類型的T 細(xì)胞表面，以及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處。這更加驗(yàn)證了自體耳屏軟骨膜組織存在活性細(xì)胞組織與血管等，且手術(shù)會(huì)造成細(xì)胞破壞釋放炎癥介質(zhì)以及各種生長因子，而這些炎癥介質(zhì)以及各種生長因子，又將參與到調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)、促進(jìn)周圍組織增殖，誘導(dǎo)纖維細(xì)胞增生、新生血管和上皮形成等作用。有利于鼓膜的愈合。

兩組研究組間臨床基本資料的研究中，A 組的患者相對(duì)比B 組年齡小，研究可見在成人的鼓室成形術(shù)手術(shù)中年齡對(duì)于鼓室成形的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甚至鼓膜穿孔的患者自然愈合中，甚至年齡較小的患者中愈合相對(duì)更快，所以年齡差異不影響本研究結(jié)果可靠性［20］。同時(shí)本研究可見脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修補(bǔ)后鼓膜顏色較耳屏軟骨膜組織蒼白這也可能與其新生血管爬生慢，血運(yùn)相對(duì)較差有關(guān)。目前，關(guān)于組織工程鼓膜的研究國內(nèi)外仍較少，隨著微創(chuàng)外科理念的深入發(fā)展其必將是材料工程學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，從而促進(jìn)組織工程鼓膜的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，最終尋求出一種完美鼓膜修補(bǔ)材料。