EZH1/2抑制劑UNC1999對外周血免疫細胞表型的影響

劉丹平，池沛冬，梅美華，游 瑩，黃俊琪

（1.中山大學附屬第一醫(yī)院器官移植科∕∕廣東省器官捐獻與移植免疫重點實驗室∕∕廣東省器官移植國際科技合作基地，廣東廣州 510080；2.中山大學腫瘤防治中心檢驗科，廣東廣州 510060）

Zeste 增強子同源物1（enhancer Zeste of homo‐log 1，EZH1）和Zeste增強子同源物2（enhancer Zeste of homolog 2，EZH2）是多梳蛋白抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的兩個功能亞基，可以催化組蛋白3賴氨酸27位點（H3K27）甲基化至其三甲基化形式（H3K27me3），誘導轉錄阻斷和基因沉默；EZH1 還可通過與參與RNA 聚合酶介導的轉錄起始和∕或延伸的因子的賴氨酸殘基甲基化促進轉錄激活［1-2］。UNC1999是一個EZH1∕2雙重抑制劑，通過與S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adeno‐syl-L-methionine，SAM）競爭發(fā)揮作用，可口服生物利用，細胞毒性低［3-4］，已被報道能抑制套細胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌等多種腫瘤［5-7］，為多種癌癥治療帶來了新的希望。同時有研究發(fā)現UNC1999具有潛在的抑制病毒復制的作用［8］。本研究利用多色流式細胞術對用藥后外周血免疫細胞亞群表型進行分析，為UNC1999的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2020年12月至2021年1月中山大學附屬第一醫(yī)院成年健康體檢者，簽署知情同意書后，使用其檢測剩余血液標本，研究方案已通過中山大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批（倫理審查批件號：［2018］259）。實驗使用12 份健康者血液樣本（2 mL∕份），為減少個體差異帶來的誤差，每4 份血液樣本提取PBMC 后混合均勻，獲得PBMC 細胞數為（1.57±0.27）×107個，其中1∕4 細胞用于CCK8 試驗，3∕4 細胞經處理后用于流式細胞術檢測。實驗所用的1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液、青鏈霉素、胎牛血清均為Gibco 產品；CCK-8 試劑盒購自日本同仁；Ficoll 分離液（17-1440-03）；流式細胞儀（Beckman Coulter）；DuraClone IM 表型檢測管（B53309、B53318、B53328、B53351、B53340、B53346；Beck‐manCoulter）、固定液（8 546859；Beckman Coul‐ter）、PerFix-nc Kit（B31168；Beckman Coulter）。

1.2 方法

1.2.1 外周血PBMC 提取及細胞培養(yǎng) 外周血（EDTA 抗凝）500×g離心5 min 后，棄血漿，加入兩倍血液體積的PBS，混勻后，在15 mL 離心管加入Ficoll 分離液（Ficoll 分離液：血液：PBS=1：1：2），管子傾斜45 ℃，緩慢加入混了PBS 的血，形成明顯分層，2 300 r∕min 離心20 min（離心機半徑r=9.5 cm），升速為6，降速為0，離心完畢后中間白色層細胞為PBMC，分離出PBMC后用PBS洗滌細胞3次。使用含體積分數10 g∕L 胎牛血清及體積分數1%青鏈霉素的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMC（培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數5%CO2）。

1.2.2 CCK-8 實驗 將細胞懸液以100 000 個∕孔的密度鋪于96 孔板，每孔100 μL，二氧化碳孵育箱培養(yǎng)（37 ℃、體積分數5% CO2）。分別加入終濃度梯度為0、5、10、20 和40 μmol∕L 的UNC1999（溶劑為DMSO），作用12 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育4 h，于450 nm 下檢測OD 值，計算細胞存活率，細胞存活率=［（實驗孔-空白孔）∕（對照孔-空白孔）］×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞亞群 以1×106∕mL 將細胞接種于12 孔板中，置于37 ℃，體積分數5%CO2培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)12 h 加入藥物，使終濃度為10 μmol∕L，對照組加入DMSO，終濃度為2 μL∕mL，作用36 h后終止，離心去培養(yǎng)基，加PBS洗滌1次，留下100 μL（包含1×106細胞），混勻后，各加100 μL 樣本至貝克曼干粉管，Treg 管加50 μL 樣本；常溫孵育15 min（避光），各加2 mL PBS，離心后吸凈上清，各加400 μL PBS 重懸（Treg 管除外），上機檢測；Treg 管盡量吸干凈上清，加入5 μL 固定液，混勻，避光放置10 min；加入300 μL 的破膜液，室溫避光孵育1 h，加入2 mL 的PBS，離心5 min 去上清，加入500 mL PBS重懸，上機檢測（表1）。

表1 UNC1999組與對照組外周血免疫細胞表型的比較Table 1 Comparison of immunophenotype of peripheral immune cells in UNC1999 and DMSO groups（）

表1 UNC1999組與對照組外周血免疫細胞表型的比較Table 1 Comparison of immunophenotype of peripheral immune cells in UNC1999 and DMSO groups（）

續(xù)表

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數據均使用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，采用均數±標準差，不符合正態(tài)分布，采用中位數（四分位間距）描述。配對數據兩組間比較，差值數據呈正態(tài)分布且方差齊，采用配對t檢驗；否則采用校正t檢驗或配對資料的符號秩和檢驗。多組均數比較，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用單因素方差進行分析，反之用Kruskal WallisH檢驗，有統(tǒng)計學意義時再進行兩兩比較。均采用雙側檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UNC1999的細胞存活率檢測

不同濃度的UNC1999 與PBMC 作用12 h 后，CCK-8 法檢測細胞OD 值計算其存活率。經檢驗5組差異有統(tǒng)計學意義（F=134.953，P＜0.001），5、10 μmol∕L 濃度與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P=0.992，0.087），且細胞的存活率保持在80%以上，遂選擇UNC1999 10 μmol∕L 作為后續(xù)實驗的處理條件（圖1）。

圖1 UNC1999作用后PBMC的存活率Fig.1 The cell viability of PBMC after UNC1999 treatment

2.2 流式細胞術檢測結果

2.2.1 用藥組與對照組單核細胞亞群的比較 相比對照組，用藥組單核細胞占PBMC 比例差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），經典型單核細胞（CD14++CD1 6-）比例上調，中間型單核細胞（CD14++CD16+）和非經典型單核細胞（CD14+CD16+）比例下調（P＜0.05；圖2）。

圖2 用藥組與對照組單核細胞亞群的比較Fig.2 Comparison of monocyte subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.2 用藥組與對照組NK亞群的比較 相比對照組，用藥組NK細胞占淋巴細胞比例差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CD56dimCD16+，CD56domCD16+細胞亞群比例明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖3）。

圖3 用藥組與對照組NK細胞亞群的比較Fig.3 Comparison of NK subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.3 用藥組與對照組B 細胞的比較 相比對照組，UNC1999組B細胞比例差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），初始B 細胞（na?ve B）比例明顯上調，記憶B細胞（non switched memory B cells，class switched memory B cells，memory B Cells）、過渡B 細胞（tran‐sitional B cell）、漿細胞（plasmablasts）比例下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖4）。

圖4 用藥組與對照組B細胞亞群的比較Fig.4 Comparison of B cells subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.4 用藥組與對照組樹突狀細胞亞群的比較相比對照組，UNC1999 組DC 比例上調，其中pDC∕DC 下調，mDC∕DC 上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖5）。

圖5 用藥組與對照組DC細胞亞群的比較Fig.5 Comparison of DC subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.5 用藥組與對照組T 淋巴細胞亞群的比較相比對照組，UNC1999 組CD8+T 細胞亞群中CD8+中樞記憶T 細胞（central memory T cell，TCM）、CD8+PD-1+比例上調，CD8+效應記憶T 細胞（effec‐tive memory T cell，TEM）比例下調；CD4+T細胞亞群中CD4+CD27+比例下調（P＜0.05），其余淋巴細胞亞群在兩組間差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖6）。

圖6 用藥組與對照組T淋巴細胞亞群的比較Fig.6 Comparison of T lymphocyte subsets in UNC1999 and DMSO group

3 討論

UNC1999處理后CD16表達下調，CD16是Ⅲ型免疫球蛋白Fc 受體，分為FcγRⅢA 和FcγRⅢB，FcγRIIIB 僅中性粒細胞表達，FcγRⅢA 與FcRγ 鏈結合，根據免疫受體酪氨酸激活基序（immunore‐ceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）或免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM）介導細胞激活和抑制，起雙向調節(jié)作用。同時，ITAM還存在抑制性ITAM（in‐hibitory ITAM，ITAMi）構型，可阻斷炎癥引起的鈣內流、ROS 產生、內吞作用、白細胞浸潤等作用，這使得FcγRⅢA具有靶向治療炎癥性疾病的潛力［9-10］。

外周單核細胞根據CD14 和CD16 分為經典型單核細胞（CD14++CD16-），中間型單核細胞（CD14++CD16+）以及非經典型單核細胞（CD14+CD1 6+）。儲備在髓外部位的經典型單核細胞可聚集到感染組織中，在控制感染、限制炎癥損傷方面起重要作用；非典型單核細胞被招募到非炎癥組織中，負責清除細胞碎片和修復內皮［11］。在敗血癥、艾滋病毒、炎癥性腸病以及代謝性疾病及心血管疾病中，中間和∕或非經典型單核細胞亞群的細胞數或比例增加，CD16+單核細胞可產生大量TNF-a 和IL-1b 導致促炎環(huán)境［12］，并維持炎癥因子的高水平狀態(tài)，被稱為“促炎癥亞群CD16+單核細胞”。研究［13］顯示，CD16+單核細胞在SARS-CoV-2 感染患者中與疾病嚴重程度相關，可能與該細胞群在CO‐VID-19 患者肺部富集及其在維持血管內環(huán)境穩(wěn)定方面的功能等相關。本研究發(fā)現用藥后經典型單核細胞比例明顯上調，CD16+單核細胞群比例下調，提示UNC1999 可能抑制CD16 表達，可能有利于減緩細胞因子的產生，減輕炎癥反應。

NK 細胞通過多個方面發(fā)揮免疫調節(jié)作用，抑制過度的免疫應答以避免病理損傷，一些腫瘤也可利用這些生理調節(jié)功能導致免疫耐受和腫瘤逃逸［14］。NK 細胞分成CD56bri和CD56dimNK 細胞群，CD56briNK 細胞代表相對年輕的、不成熟的NK 細胞，在成熟的過程中獲得表達CD16 的能力，成為CD56dimNK 細胞，CD16 受體可介導直接細胞毒作用和抗體依賴性細胞毒作用［15］。在體外，PBMC 分離出來的CD56briNK 細胞與滑膜成纖維細胞接觸后上調CD16，分化為CD56dimNK 細胞，產生大量的細胞因子，具有更強的細胞溶解能力［16］。淋巴結和扁桃體中的CD56briNK 細胞能夠在IL-2 刺激下上調CD16分化為CD56dimNK細胞［17］。有研究［18］表明EZH1∕2抑制劑促進CD56+前體細胞增殖，使前體細胞譜系向3 型固有淋巴樣細胞傾斜，揭示了參與NK細胞成熟調節(jié)的表觀遺傳機制。本實驗用藥組CD56dimCD16+，CD56domCD16+細胞亞群比例下調，但該藥物改變NK細胞表型的作用機制及對感染免疫的影響仍需進一步的深入研究。

B 細胞中的EZH2 失活將B 細胞阻斷在增殖和不成熟階段，構成淋巴瘤發(fā)展的關鍵因素［19-20］。套細胞淋巴瘤中EZH1 表達下調，EZH2∕EZH1 比值的失衡可能在淋巴瘤的發(fā)病機制中起作用［21］。相比對照組，用藥后初始B細胞比例上調，記憶B細胞、過渡B細胞、漿細胞比例下調，藥物可能阻滯了B細胞的分化，其中EZH1或者EZH1∕EZH2比值的失衡是否也影響了外周B細胞的分化，值得深入探討。

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）分為漿細胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）和髓樣DC（myeloid∕con‐ventional DC，mDC）。pDC 通過感知病毒感染快速產生大量干擾素和細胞因子，可減緩病毒復制并導致炎癥環(huán)境；mDC 可限制病毒復制，促進T 細胞免疫［22-23］。實驗結果顯示用藥組DC 總比例以及mDC∕DC 上調，UNC1999 可能促進DC 的表達，有利于發(fā)揮抗原提呈作用。

T 細胞根據CD45RA 和CCR7 分成初始T 細胞（CD45RA+CCR7+na?ve，TN），中樞記憶T細胞（CD45RA-CCR7+Central memory，TCM），效應記憶T細胞（CD45RA-CCR7-effector memory，TEM），終末效應記憶T 細胞（CD45RA+CCR7-effector memory re-expressing CD45RA，TEMRA）。CD8+TN，CD8+TCM具有自我更新能力，在慢性感染中，TCM 可被重新激活以清除或抑制病原體［24］。程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）是活化T 細胞的負調節(jié)因子，是T 細胞耗竭的標志［25-27］。CD27屬于腫瘤壞死因子受體超家族，其在癌癥細胞的表達使其成為抗癌選擇之一，抗CD27 單克隆抗體的激動劑與阻斷PD-1配體的協同作用可增強衰竭的CD8+T 細胞的增殖和功能［28］。本研究顯示該藥物影響了T 細胞的部分亞群比例，但其對T 細胞功能的影響需進一步探索。

UNC1999是具有潛力的抗腫瘤藥物，研究發(fā)現該藥物可能具有抗病毒作用［8］，因此研究UNC1999對免疫系統(tǒng)影響十分必要。我們的結果顯示UNC1999 改變了PBMC 的細胞表型，在合并其他病原體感染的情況下，使用UNC1999 導致上述細胞表型的改變可能影響正常的免疫功能，導致免疫應答的低效或延遲反應。