慢性氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生理生化指標(biāo)及血藍(lán)蛋白基因表達(dá)的影響

顧楠 戴習(xí)林

摘要：【目的】探究慢性氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）生理生化和血藍(lán)蛋白基因表達(dá)的影響，明確氨氮脅迫的毒性作用，為養(yǎng)殖戶在對(duì)蝦中后期健康養(yǎng)殖管理上提供技術(shù)參考，同時(shí)豐富凡納濱對(duì)蝦的毒理研究資料?！痉椒ā刻暨x540尾平均初始濕體重9.92±0.24 g/尾的健康凡納濱對(duì)蝦，隨機(jī)分成6個(gè)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，暴露于不同氨氮濃度[0（對(duì)照）、4、6、8、12和16 mg/L]的曝氣自來(lái)水中，分別于脅迫16、17、18、19和20 d時(shí)取樣測(cè)定凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮、尿素氮及血藍(lán)蛋白含量，脅迫結(jié)束后統(tǒng)計(jì)凡納濱對(duì)蝦的體長(zhǎng)增長(zhǎng)率、體重增長(zhǎng)率和存活率，同時(shí)取鰓組織和肝胰腺制作石蠟切片?！窘Y(jié)果】慢性氨氮脅迫16～20 d，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的存活率、體重增長(zhǎng)率和體長(zhǎng)增長(zhǎng)率均隨氨氮濃度的增加而依次降低，且顯著低于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦（P<0.05，下同）。隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦血淋巴氨氮和尿素氮含量均明顯高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，且二者的變化趨勢(shì)基本一致;各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量均顯著低于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，且血藍(lán)蛋白含量的變化趨勢(shì)總體上與水體氨氮濃度呈負(fù)相關(guān)，血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)水平與血藍(lán)蛋白含量變化趨勢(shì)基本相符，總體上表現(xiàn)為氨氮脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量越低。經(jīng)慢性氨氮脅迫后凡納濱對(duì)蝦鰓組織和肝胰腺嚴(yán)重受損，鰓絲腫脹，核固縮，血淋巴細(xì)胞增多，局部空泡化、結(jié)構(gòu)不完整，鰓呼吸上皮細(xì)胞大面積脫落;胰腺管腫大，空泡化嚴(yán)重，肝小管排列紊亂，管腔擴(kuò)大，邊界模糊，肝小管間隙和管腔中可觀察到破碎的細(xì)胞組織?！窘Y(jié)論】慢性氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)及生存有明顯影響，造成血淋巴氨氮和尿素氮含量增加，并下調(diào)血藍(lán)蛋白基因表達(dá)及阻礙血藍(lán)蛋白合成，凡納濱對(duì)蝦的鰓組織和肝胰腺嚴(yán)重受損。即慢性氨氮脅迫引起的呼吸功能障礙及肝胰腺代謝功能紊亂，是導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦應(yīng)激死亡的主要原因。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對(duì)蝦;慢性氨氮脅迫;尿素氮;血藍(lán)蛋白;組織損傷

中圖分類號(hào)： S9117.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）04-1098-10

Effects of chronic ammonia nitrogen stress on physiology and biochemistry indexes and hemocyanin gene expression of Litopenaeus vannamei

GU Nan1，2，3， DAI Xi-lin1，2，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Key Lad of Freshwater Aquatic Germplasm Resources of Ministry of Agriculture and Rural Affairs （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 3Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal

Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University）， Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】To investigate the effects of chronic ammonia nitrogen stress on the physiology， biochemistry and expression of hemocyanin gene of Litopenaeus vannamei，clarify the toxic effect of ammonia nitrogen stress，and provide reference for farmers in the middle and late stage of healthy culture management of shrimp， and enrich the toxicological research data of L. vannamei at the same time. 【Method】540 healthy L. vannamei with an average initial wet body weight of 9.92±0.24 g per shrimp were randomly divided into 6 groups， each group was set with 3 replicates，each of which was exposed to aerated tap water at different ammonia nitrogen concentrations（0， 4， 6， 8， 12 and 16 mg/L）. Samples were taken at 16， 17， 18， 19 and 20 d to determine the contents of ammonia nitrogen， urea nitrogen and hemocyanin of L. vannamei， respectively. After the stress， the growth rate of body length， the rate of weight gain and the survival rate were counted. At the same time， the gill tissue and hepatopancreas were taken for paraffin section. 【Result】From 16 to 20 d of chronic ammonia nitrogen stress，? the survival rate，the growth rate of weight gain and body length of L. vannamei in each stress group decreased in turn with the increase of ammonia nitrogen concentration，and significantly lower than that of the control group（P<0.05，the same below）. With the prolongation of ammonia nitrogen stress time， ammonia nitrogen and urea nitrogen in hemolymph of each stress group were higher than those of the control group，and the change trend of the two was basically consistent; the content of hemocyanin in each stress group was significantly lower than that of the control group，and the variation trend of hemocyanin content was negatively correlated with the concentration of ammonia nitrogen in water，the expression of hemocyanin gene was basically consistent with the change trend of hemocyanin content， which generally showed that the longer ammonia-nitrogen stress time was， the lower the relative expression level of hemocyanin gene was. After chronic ammonia nitrogen stress， the gill tissue and hepatopancreas of L. vannamei were ser-iously damaged， including gill filament swelling， nuclear pyknosis， increased blood lymphocytes， local vacuolation and incomplete structure， and large area of gill respiratory epithelial cells were exfoliated. Pancreatic ducts were enlarged with severe vacuolization， hepatic tubules were arranged disorderly， lumen was enlarged and the boundary was blurred， and broken cells and tissues could be observed in the space between the hepatic tubules and lumen. 【Conclusion】Chronic ammonia nitrogen stress has a great inhibition on the growth and survival rate of L. vanname. It will increase the content of ammonia nitrogen and urea nitrogen in hemolymph， decrease the relative expression level of hemocyanin mRNA， block the synthesis of hemocyanin，and cause serious damage to gill and hepatopancreas. Respiratory dysfunction and hepatopancreas metabolic dysfunction caused by chronic ammo nianitrogen stress are the main causes of stress death of L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vannamei; chronic ammonia nitrogen stress; urea nitrogen; hemocyanin; tissue damage

Foundation item： Shanghai Shrimp Industry Technology System Construction Special Project（HNKGZ〔2014〕7-1-11）

0 引言

【研究意義】凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）因具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)，可適應(yīng)不同鹽度、溫度及養(yǎng)殖密度環(huán)境，以及肉質(zhì)鮮美、食用率高等特點(diǎn)，在我國(guó)沿海地區(qū)已廣泛養(yǎng)殖，且在內(nèi)陸省份己成功進(jìn)行人工養(yǎng)殖（張彬等，2014;邱立國(guó)，2017）。在高度集約化養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖水體極易出現(xiàn)氨氮過(guò)量積累，進(jìn)而對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)、蛻殼、滲透調(diào)節(jié)、免疫及排泄等生理活動(dòng)產(chǎn)生重要影響（孫健，2017;范鵬程等，2019;熊大林等，2020）。氨氮是集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在的有害因子，因此探究慢性氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響，對(duì)促進(jìn)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，有關(guān)氨氮脅迫對(duì)水生動(dòng)物的影響已有較多研究報(bào)道。在生理生化方面，氨氮脅迫會(huì)顯著影響日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）血淋巴中的生化指標(biāo)（王國(guó)江，2008），可導(dǎo)致紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）的血細(xì)胞總數(shù)下降（潘訓(xùn)彬等，2017），對(duì)中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）的血淋巴氨氮含量、尿素氮含量及抗氧化能力造成顯著影響（王蕓等，2017），還會(huì)影響擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的血清免疫酶活力（彭軍輝等，2018）。在生長(zhǎng)性能方面，氨氮脅迫對(duì)水生動(dòng)物的攝食、消化及生長(zhǎng)均會(huì)產(chǎn)生不利影響（崔平和強(qiáng)俊，2018;胡煒等，2018;唐首杰等，2019）。在器官組織病理變化方面，氨氮脅迫通過(guò)損傷水生動(dòng)物的鰓組織及肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)，致使機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和非特異性免疫系統(tǒng)下降，呼吸功能及正常生理代謝受阻，進(jìn)而引起機(jī)體新陳代謝和解毒功能下降（許星鴻等，2014;王貞杰等，2017;陳思涵等，2018）。在基因表達(dá)方面，受氨氮脅迫后中國(guó)對(duì)蝦通過(guò)調(diào)控HSP90基因來(lái)保護(hù)細(xì)胞（王蕓等，2013），尼羅羅非魚(yú)通過(guò)調(diào)控鰓組織、肝臟和腎臟中的不同氨代謝基因共同參與調(diào)節(jié)氨代謝而提高機(jī)體對(duì)氨氮的耐受性（吳俊偉等，2016），大彈涂魚(yú)（Boleophthalmus pectinirostris）的TNF、IL-1、IL-6和IL-8等炎性反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量持續(xù)升高，故推測(cè)過(guò)度炎性應(yīng)激可能是導(dǎo)致魚(yú)類氨中毒死亡的主要原因之一（宋美澤等，2018）。【本研究切入點(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)氨氮脅迫凡納濱對(duì)蝦的影響研究主要屬于急性脅迫，脅迫時(shí)間較短，且對(duì)蝦規(guī)格較小，研究結(jié)果適用于養(yǎng)殖前期的凡納濱對(duì)蝦，而針對(duì)中等規(guī)格以上凡納濱對(duì)蝦長(zhǎng)時(shí)間處于氨氮脅迫下的毒性試驗(yàn)較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育、存活率、生理生化指標(biāo)、鰓組織和肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)及血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)水平等方面綜合探究凡納濱對(duì)蝦對(duì)氨氮脅迫的響應(yīng)，明確氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的毒性作用，以期為養(yǎng)殖戶在對(duì)蝦中后期健康養(yǎng)殖管理上提供技術(shù)參考，同時(shí)豐富凡納濱對(duì)蝦的毒理研究資料。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)動(dòng)物

供試凡納濱對(duì)蝦取自上海良星水稻種植專業(yè)合作社，在鹽度2‰且提前曝氣2 d的自來(lái)水中馴養(yǎng)1周;然后飼養(yǎng)于水泥池中，池水深度1 m。整個(gè)試驗(yàn)周期的養(yǎng)殖水體鹽度2‰，水溫（27.0±1.1）℃，pH 7.60±0.08，氣泡石24 h充氧。最初投餌量為初始體重的1.5%，每天投喂3次，并根據(jù)攝食情況及時(shí)調(diào)整投餌量。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選540尾平均初始濕體重9.92±0.24 g/尾的健康凡納濱對(duì)蝦，隨機(jī)分成6組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾對(duì)蝦，分別暴露于不同氨氮濃度（0、4、6、8、12和16 mg/L）的曝氣自來(lái)水中，脅迫周期20 d。以0 mg/L氨氮濃度為對(duì)照。參照孫國(guó)銘等（2002）的方法確定氨氮濃度，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行適度調(diào)整。

1. 3 養(yǎng)殖水體氨氮濃度測(cè)定

養(yǎng)殖水體氨氮濃度測(cè)定采用納氏試劑法（王華等，2013），每天測(cè)定2次，使用氯化銨調(diào)整水體氨氮濃度達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。根據(jù)溫度、pH、鹽度、總氨氮濃度換算養(yǎng)殖水體分子氨濃度（王琨和韓英，2007）。

1. 4 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

分別于脅迫16、17、18、19和20 d時(shí)，各脅迫處理組隨機(jī)選取凡納濱對(duì)蝦3尾，采用一次性1.0 mL無(wú)菌注射器吸取抗凝劑于凡納濱對(duì)蝦頭胸甲后緣插入圍心竇內(nèi)抽取血淋巴樣品，將抽取的血淋巴樣品混勻，用于測(cè)定凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮、尿素氮及血藍(lán)蛋白含量。脅迫16和20 d時(shí)隨機(jī)取樣置于冰盤內(nèi)，剖解取出肝胰臟，去除多余組織，以預(yù)冷超純水洗凈，濾紙吸干后置于裝有RNA Keeper的1.5 mL離心管中，-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆?。脅迫結(jié)束后統(tǒng)計(jì)凡納濱對(duì)蝦的體長(zhǎng)增長(zhǎng)率、體重增長(zhǎng)率和存活率;同時(shí)取鰓組織和肝胰臟制作石蠟切片，用于觀察其顯微結(jié)構(gòu)的損傷情況。

1. 4. 1 生長(zhǎng)指標(biāo)及存活率計(jì)算

體長(zhǎng)增長(zhǎng)率（%）=（終末體長(zhǎng)-初始體長(zhǎng)）/初始

體長(zhǎng)×100

體重增長(zhǎng)率（%）=（終末體重-初始體重）/初始

體重×100

存活率（%）=存活數(shù)/初始總數(shù)×100

1. 4. 2 血淋巴氨氮尿素氮含量測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所研發(fā)的血氨測(cè)定試劑盒和尿素氮測(cè)試盒進(jìn)行血淋巴氨氮和尿素氮含量測(cè)定。

1. 4. 3 血藍(lán)蛋白含量測(cè)定 采用紫外吸收法測(cè)定血藍(lán)蛋白含量，將抽取的血淋巴樣品稀釋至1%，移液槍吸取0.04 mL血淋巴稀釋液，以紫外分光光度計(jì)在334 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，參照王順昌和許立（2003）的方法換算血藍(lán)蛋白含量。

血藍(lán)蛋白含量（mmol/L）=2.69E[1%1 cm]

式中，E[1%1 cm]表示1%血淋巴稀釋液在光徑為1 cm石英比色皿中的吸光值。

1. 4. 4 血藍(lán)蛋白基因表達(dá)水平測(cè)定 采用UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒（B511321）抽提樣品RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否存在基因組污染，并使用核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度及純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并根據(jù)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白cDNA序列，以Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增特異性引物（表1），引物合成和cDNA樣品測(cè)序均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)后，采用2-△△Ct法換算凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白基因相對(duì)表達(dá)量。

1. 4. 5 鰓組織和肝胰腺石蠟切片制作 將鰓組織和肝胰腺放入中性甲醛溶液中固定24 h，以乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋后切片，HE染色，置于生物顯微鏡（XSP-BM-12CAV）下觀察并拍照。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan?s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 養(yǎng)殖水體總氨氮與分子氨的濃度變化

上午測(cè)定結(jié)果（圖1-A）顯示，對(duì)照組（0 mg/L）養(yǎng)殖水體總氨氮濃度維持在0.1～0.6 mg/L，4 mg/L組維持在3.0～5.0 mg/L，6 mg/L組維持在4.7～6.7 mg/L，8 mg/L組維持在6.4～10.2 mg/L，12 mg/L組維持在10.8～14.8 mg/L，16 mg/L組維持在14.3～16.5 mg/L。下午調(diào)整養(yǎng)殖水體氨氮濃度后的測(cè)定結(jié)果（圖1-B）顯示，對(duì)照組（0 mg/L）養(yǎng)殖水體總氨氮濃度維持在0.1～0.3 mg/L，4 mg/L組維持在3.1～4.7 mg/L，6 mg/L組維持在5.3～6.6 mg/L，8 mg/L組維持在7.1～8.8 mg/L，12 mg/L組維持在11.3～13.8 mg/L，16 mg/L組維持在15.1～16.7 mg/L。

上午測(cè)定結(jié)果（圖2-A）顯示，對(duì)照組（0 mg/L）養(yǎng)殖水體分子氨濃度維持在0.00～0.02 mg/L，4 mg/L組維持在0.07～0.12 mg/L，6 mg/L組維持在0.11～0.16 mg/L，8 mg/L組維持在0.15～0.24 mg/L，12 mg/L組維持在0.25～0.33 mg/L，16 mg/L組維持在0.34～0.39 mg/L。下午調(diào)整養(yǎng)殖水體氨氮濃度后的測(cè)定結(jié)果（圖2-B）顯示，對(duì)照組（0 mg/L）養(yǎng)殖水體分子氨濃度維持在0.00～0.01 mg/L，4 mg/L組維持在0.08～0.11 mg/L，6 mg/L組維持在0.13～0.16 mg/L，8 mg/L組維持在0.17～0.21 mg/L，12 mg/L組維持在0.27～0.31 mg/L，16 mg/L組維持在0.36～0.39 mg/L。

2. 2 凡納濱對(duì)蝦的存活率及其生長(zhǎng)狀況

由表2可知，脅迫15 d后各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦存活率隨氨氮濃度的增加而逐漸降低，且各脅迫處理組間差異顯著（P<0.05，下同）;至脅迫20 d，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦存活率均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)繼續(xù)降低，且顯著低于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦的存活率，隨氨氮濃度的增加凡納濱對(duì)蝦存活率依次降低?？梢?jiàn)，慢性氨氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦的生存受到顯著抑制，且氨氮濃度越高影響越大。由表3可知，脅迫20 d后各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的體重增長(zhǎng)率和體長(zhǎng)增長(zhǎng)率均隨氨氮濃度的增加依次降低，且各脅迫處理組間差異顯著，說(shuō)明慢性氨氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)也受到顯著影響。

2. 3 凡納濱對(duì)蝦血淋巴氨氮及尿素氮含量的變化

由圖3可看出，脅迫15 d后各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮含量均明顯高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦。脅迫16 d時(shí)，除4 mg/L組外，其他脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮含量均顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦;脅迫17 d時(shí)，8、12和16 mg/L組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮含量顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，且以8 mg/L組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮含量最高;脅迫18 d時(shí)也表現(xiàn)為除4 mg/L組外，其他脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮含量均顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，以16 mg/L組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮含量最高;脅迫19和20 d后，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴氨氮含量均顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦。在血淋巴尿素氮含量方面，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴尿素氮含量均隨氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且總體上與水體氨氮濃度呈正相關(guān)，高濃度（12和16 mg/L）脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴尿素氮含量顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦（圖4）。脅迫18 d時(shí)，8、12和16 mg/L組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴尿素氮含量顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，且各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴尿素氮含量均達(dá)最高值，與凡納濱對(duì)蝦血淋巴氨氮含量的變化趨勢(shì)基本吻合;至脅迫20 d時(shí)，除4 mg/L組外，其他脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦的血淋巴尿素氮含量均顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦。

2. 4 凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量的變化

由圖5可看出，經(jīng)氨氮脅迫15 d后，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量均顯著低于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，且凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量的變化趨勢(shì)總體上與水體氨氮濃度呈負(fù)相關(guān)，表明凡納濱對(duì)蝦在長(zhǎng)期的氨氮脅迫下其蛋白合成代謝受阻，進(jìn)而影響血藍(lán)蛋白的合成。血藍(lán)蛋白是含銅的呼吸蛋白，凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量降低可能會(huì)影響其呼吸作用。

2. 5 凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白基因表達(dá)水平的變化

由圖6可知，脅迫15和20 d時(shí)各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，且總體上表現(xiàn)為氨氮脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量越低，表明血藍(lán)蛋白基因表達(dá)受慢性氨氮脅迫的影響，進(jìn)而影響血藍(lán)蛋白的合成，以及與血藍(lán)蛋白相關(guān)的正常生理功能。

2. 6 凡納濱對(duì)蝦鰓組織和肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)的變化

2. 6. 1 鰓組織的病理變化 由圖7可看出，經(jīng)慢性氨氮脅迫后凡納濱對(duì)蝦鰓組織嚴(yán)重受損，鰓呼吸作用及其正常代謝均受到影響，具體病理變化表現(xiàn)為：鰓絲腫脹，核固縮，血淋巴細(xì)胞增多，局部空泡化、結(jié)構(gòu)不完整;鰓呼吸上皮細(xì)胞大面積脫落，鰓膜碎化，有大量酸性物質(zhì)分泌，經(jīng)HE染色呈紅色;鰓葉末端的亞幾丁質(zhì)層結(jié)構(gòu)破碎，亞幾丁質(zhì)空間被破壞。

2. 6. 2 肝胰腺的病理變化 由圖8可看出，經(jīng)慢性氨氮脅迫后凡納濱對(duì)蝦胰腺管腫大，空泡化嚴(yán)重;星狀管腔變形，空泡間的結(jié)締組織被損壞，多個(gè)空泡融合為一個(gè)大的空泡;肝小管排列紊亂，管腔擴(kuò)大，邊界模糊;肝小管出現(xiàn)破裂，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞大量解體，肝小管間隙和管腔中可觀察到破碎的細(xì)胞組織。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體氨氮濃度經(jīng)每天調(diào)整與設(shè)計(jì)濃度基本一致，偶有升高，其原因可能是剩余餌料及代謝產(chǎn)生的糞便等所引起（吳堃等，2017）。在水體中，氨主要以離子化（NH4+）和非離子化形式（NH3）存在（Dutra et al.，2016），且其濃度變化與水溫、鹽度及pH均有關(guān)（Barbieri，2010;Frisk et al.，2013）。甲殼動(dòng)物的氨氮排泄也受養(yǎng)殖水體pH影響。于敏等（2007）研究證實(shí)，當(dāng)養(yǎng)殖水體pH≤9.0時(shí)，中華絨螯蟹的氨氮排泄變化不明顯，但養(yǎng)殖水體pH升高至10.5后，其氨氮排泄急劇下降，且排泄過(guò)程具有不連續(xù)性。

隨著水體NH3含量的升高及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)類攝食量開(kāi)始減少，生長(zhǎng)速度減慢，嚴(yán)重者生長(zhǎng)開(kāi)始停滯（唐首杰等，2019）。胡煒等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水體氨氮濃度超過(guò)2 mg/L后，刺參的末體重和特定生長(zhǎng)率均隨氨氮濃度的升高呈顯著下降趨勢(shì)。管敏等（2019）研究表明，在慢性氨氮脅迫下，F(xiàn)2代中華鱘的生長(zhǎng)受到顯著抑制，其抗氧化能力及免疫能力也同步降低。本研究結(jié)果表明，經(jīng)慢性氨氮脅迫后，凡納濱對(duì)蝦的體長(zhǎng)增長(zhǎng)率、增重增長(zhǎng)率和存活率均隨氨氮濃度的升高而呈遞減趨勢(shì)，說(shuō)明氨氮脅迫濃度升高對(duì)凡納繽對(duì)蝦的生長(zhǎng)及生存有明顯影響。此外，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦血淋巴氨氮不斷積累，至脅迫19和20 d時(shí)其含量均顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，與王蕓等（2017）的研究結(jié)果相似，即隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，中國(guó)明對(duì)蝦血淋巴氨氮含量逐漸積累。甲殼類動(dòng)物的尿素氮生成主要來(lái)源于鳥(niǎo)苷酸循環(huán)及尿酸分解，而后者的形成主要源于核苷酸降解。本研究結(jié)果表明，慢性氨氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦血淋巴中的尿素氮和氨氮含量變化趨勢(shì)基本一致，可能是隨著凡納濱對(duì)蝦血淋巴氨氮含量的升高，凡納濱對(duì)蝦會(huì)啟動(dòng)自身的解毒機(jī)制，將毒性較強(qiáng)的氨氮轉(zhuǎn)化為相對(duì)較弱的尿素氮（于敏等，2008）。

血藍(lán)蛋白是位于節(jié)肢動(dòng)物（螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛類）和軟體動(dòng)物（腹足類和頭足類）血淋巴中的含銅呼吸蛋白，除了具有輸氧功能外，還可通過(guò)多種方式參與機(jī)體免疫防御，是蝦蟹等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物重要的多功能免疫因子（張澤蕙等，2016;竇全偉，2018）。王國(guó)江（2008）研究表明，氨氮和亞硝態(tài)氮對(duì)日本沼蝦血淋巴中的血細(xì)胞數(shù)量、生理生化指標(biāo)、酚氧化酶活性及血藍(lán)蛋白含量均產(chǎn)生顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性氨氮脅迫15 d后，各脅迫處理組凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量均顯著低于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦，且凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白含量的變化趨勢(shì)總體上與水體氨氮濃度呈負(fù)相關(guān)，血藍(lán)蛋白基因的表達(dá)水平與血藍(lán)蛋白含量變化趨勢(shì)基本相符，總體上表現(xiàn)為氨氮脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量越低?？梢?jiàn)，慢性氨氮脅迫通過(guò)下調(diào)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白基因表達(dá)，而阻礙血藍(lán)蛋白合成，進(jìn)而影響凡納濱對(duì)蝦的呼吸功能及免疫功能等，可能是導(dǎo)致其死亡的主要原因。

氨氮是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在的污染因子，可通過(guò)水生動(dòng)物的鰓組織而滲入其血淋巴中，從而引起血淋巴氨氮含量升高，同時(shí)對(duì)鰓組織結(jié)構(gòu)造成損傷。鰓組織與外界水環(huán)境直接接觸，當(dāng)水環(huán)境中存在不利因子如重金屬時(shí)，極易對(duì)鰓組織造成損傷（王權(quán)等，2012）。已有研究表明，長(zhǎng)期氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的鰓組織和肝胰腺均會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p傷（趙衛(wèi)紅等，2014;Liu et al.，2014）。此外，水環(huán)境變化會(huì)影響甲殼類動(dòng)物肝胰腺中B細(xì)胞和R細(xì)胞的組成比例（趙柳蘭，2012;韓曉琳等，2014）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)慢性氨氮脅迫后凡納濱對(duì)蝦鰓組織嚴(yán)重受損，鰓絲腫脹，核固縮，血淋巴細(xì)胞增多，局部空泡化、結(jié)構(gòu)不完整，鰓呼吸上皮細(xì)胞大面積脫落，有大量酸性物質(zhì)分泌，鰓葉末端的亞幾丁質(zhì)層結(jié)構(gòu)破碎，亞幾丁質(zhì)空間被破壞;胰腺管腫大，空泡化嚴(yán)重，肝小管排列紊亂，管腔擴(kuò)大，邊界模糊，肝小管間隙和管腔中可觀察到破碎的細(xì)胞組織。可見(jiàn)，慢性氨氮脅迫引起的呼吸功能障礙及肝胰腺代謝功能紊亂，是導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦應(yīng)激死亡的主要原因。

4 結(jié)論

慢性氨氮脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)及生存有明顯影響，造成血淋巴氨氮和尿素氮含量增加，并下調(diào)血藍(lán)蛋白基因表達(dá)及阻礙血藍(lán)蛋白合成，凡納濱對(duì)蝦的鰓組織和肝胰腺嚴(yán)重受損。即慢性氨氮脅迫引起的呼吸功能障礙及肝胰腺代謝功能紊亂，是導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦應(yīng)激死亡的主要原因。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）