廣西北部灣入侵植物互花米草內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及促生防病活性分析

李慧穎 申乃坤 吳家法 楊立芳 吳宛容 鄧禮霞 姜明國

摘要：【目的】探究不同入侵程度互花米草（Spartina alterniflora）根、莖和葉內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，并分析其對植物的防病促生活性，為互花米草入侵研究提供新思路，同時為后續(xù)的農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供菌種資源?！痉椒ā恳圆煌肭殖潭鹊幕セ撞轂檠芯繉ο螅捎?種選擇培養(yǎng)基，通過稀釋涂布法分離內(nèi)生細(xì)菌;利用16S rRNA序列相似性及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹確定內(nèi)生細(xì)菌的分類地位。通過平板對峙法檢測內(nèi)生細(xì)菌拮抗香蕉枯萎病病原菌活性;通過功能培養(yǎng)基分析內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、溶磷和固氮等促生活性?！窘Y(jié)果】從互花米草的根、莖和葉中共分離出269株內(nèi)生細(xì)菌，根據(jù)菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征去重復(fù)后獲得82株細(xì)菌;對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測序及比對分析，82株細(xì)菌分屬于6綱16目19科31屬，其中包括固氮細(xì)菌21株（占25.61%）、產(chǎn)IAA細(xì)菌21株（占25.61%）、溶磷菌11株（占13.41%），可拮抗香蕉枯萎病病原菌14株（占17.07%），并發(fā)現(xiàn)潛在新種13株（占15.85%）?；セ撞萑肭殖潭炔煌瑑?nèi)生細(xì)菌多樣性也發(fā)生變化，隨著入侵程度的增加，γ變形菌占據(jù)優(yōu)勢，而放線菌和芽孢桿菌多樣性增加。【結(jié)論】互花米草內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性，且多具有促生活性和生防功能，在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有潛在應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞： 入侵植物;互花米草;內(nèi)生細(xì)菌;多樣性;促生活性;生防功能

中圖分類號： S459;Q938.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-1012-10

Diversity of culturable endophytic bacteria in invasive plant Spartina alterniflora of Guangxi Beibu Gulf and their biocontrol effect and plant-growth-promoting activity

LI Hui-ying1，2， SHEN Nai-kun1，2， WU Jia-fa1，2， YANG Li-fang3， WU Wan-rong1，2，

DENG Li-xia1，2， JIANG Ming-guo1，2*

（1Guangxi Key Laboratory for Polysaccharide Materials and Modifications， Nanning? 530008， China; 2School of Marine Sciences and Biotechnology， Guangxi University for Nationalities， Nanning? 530008， China; 3School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi University for Nationalities， Nanning? 530008， China）

Abstract：【Objective】To study diversity of culturable endophytic bacteria in the roots， stems and leaves in different degrees of invasion of Spartina alterniflora，and analyze their biocontrol and plant-growth-promoting activity，provide new research ideas for S. alterniflora invasion research and provide microbial resources for subsequent agricultural applications. 【Method】S. alterniflora with different invasion degrees were used as the research object， and six selective media were used to isolate microorganisms by dilution coating method. 16S rRNA? sequence similarity and construction of phylogenetic trees were used to determine the classification status of microorganisms. The plate confrontation method was used to detect the antagonistic activity of the bacterial strain against the pathogen of banana fusarium wilt; and the indole acetic acid production（IAA）， phosphorus solubilization and nitrogen fixation were analyzed through functional plate analysis.【Result】A total of 269 endophytic bacteria were screened from the roots， stems and leaves of S. alterniflora. After deduplication according to the colony morphology and culture characteristics， the 16S rRNA sequencing and comparison of 82 strains were performed， and they belonged to 6 classes， 16 orders， 19 families and 31 genera， including 21 strains of nitrogen-fixing bacteria（25.61%）， 22 strains of IAA-producing bacteria（25.61%）， 11 strains of phosphate solubilizing bacteria（13.41%）， 14 strains（17.07%） could antagonize the pathogen of banana fusarium wilt， and discovered potential 13 new strain species（15.85%）. The degree of invasion of S. alterniflora was different， and the diversity of endophytic bacteria also changed. As the degree of invasion increased， γ-proteobacteria dominated， while the diversity of actinomycetes and bacillus increased. 【Conclusion】The endophytes of S. alterniflora are rich in diversity， and mostly have life-promo-ting and biological control functions. They have potential application value in future agricultural production.

Key words： invasive plant; Spartina alterniflora; endophyte; diversity; plant-growth-promoting activity; biocontrol effect

Foundation item： Science and Technology Major Project of Guangxi（Guike AA18242026）; Specific Research Pro-ject of Guangxi for Research Bases and Talents（AD18281066，AD18126005）; Innovation Project of Guangxi Graduate Education（gxun-chxzs2019037）

0 引言

【研究意義】互花米草（Spartina alterniflora）原產(chǎn)于大西洋沿岸，1979年由南京大學(xué)徐國萬教授等為了替代大米草保灘護(hù)岸、改良土壤引入我國（楊東和萬福緒，2014）。由于互花米草耐鹽、耐淹、繁殖力極強(qiáng)（Prasanta and Niranjan，2011），已擴(kuò)散至除海南省外北起遼寧南至廣西的全部沿海省份（宮璐等，2017）?；セ撞萑肭衷斐缮锒鄻有越档图吧鷳B(tài)系統(tǒng)退化，對生態(tài)環(huán)境和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等造成嚴(yán)重危害和巨大經(jīng)濟(jì)損失（Li et al.，2008）。2003年國家環(huán)保總局公布首批16種外來入侵物種名單，互花米草作為唯一的海岸鹽沼植物被列入其中（謝寶華等，2019）。因此，開展互花米草內(nèi)生菌多樣性及其防病促生活性研究，對了解互花米草入侵機(jī)制和擴(kuò)大農(nóng)業(yè)菌種資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】內(nèi)生菌廣泛分布于各植物組織中，且在各組織中存在差異。植物內(nèi)生菌可增加植物的抗逆性，促進(jìn)植物生長（Baldan et al.，2014;陳利云等，2020）。隨著科學(xué)研究的不斷深入，植物內(nèi)生細(xì)菌在生物防治及生理生態(tài)方面的作用逐步被挖掘，成為國內(nèi)外農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點（何珊和田志宏，2020）。遲惠榮等（2019）采用平板對峙法從多花黃精中篩選生防菌，發(fā)現(xiàn)1株對尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)抑菌作用和促生作用的芽孢桿菌。鄧振山等（2019）、陽湖榮等（2019）采用稀釋涂布法對巨菌草和白術(shù)內(nèi)生菌進(jìn)行分離并鑒定其促生活性，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生菌具有固氮、溶磷、解鉀和合成吲哚乙酸（IAA）的潛力。付思遠(yuǎn)等（2020）采用IS-PCR指紋圖譜對泓森槐固氮內(nèi)生菌進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)其菌株多具有固氮、溶磷、解鉀等促生活性。目前，已有部分科學(xué)家關(guān)注入侵植物內(nèi)生菌對入侵植物的影響，將內(nèi)生菌與植物入侵機(jī)制相聯(lián)系，以探尋內(nèi)生菌對植物入侵的作用機(jī)理。Rout等（2013）通過抗生素抑制入侵植物石茅內(nèi)生菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石茅生長速度和生物量明顯下降，根莖明顯減少，從側(cè)面證明入侵植物內(nèi)生菌對植物入侵起重要作用。Dai等（2016）構(gòu)建入侵植物南美蟛蜞菊接種其內(nèi)生菌的完全無菌純培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生菌可較明顯地促進(jìn)南美蟛蜞菊的生長。侯曉杰等（2018）利用平板對峙法從入侵植物黃頂菊內(nèi)生細(xì)菌中篩選出對蘋果輪紋病菌具有良好抑制效果的生防菌。程丹丹等（2019）利用16S rRNA序列的高通量測序技術(shù)和后續(xù)分析，探索入侵植物小蓬草內(nèi)生菌群落的組成和多樣性，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬和根瘤菌屬等優(yōu)勢菌株為植物益生菌?！颈狙芯壳腥朦c】已有研究表明植物內(nèi)生菌多具有促生和生防功能，且植物入侵可能與其內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在關(guān)聯(lián)，但關(guān)于不同入侵程度互花米草內(nèi)生細(xì)菌多樣性差異及其功能分析至今未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用分離培養(yǎng)法對不同入侵程度的互花米草內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多樣性差異分析，探究內(nèi)生細(xì)菌在互花米草入侵過程中發(fā)揮的作用，為從微生物學(xué)角度解釋互花米草入侵機(jī)制提供參考，同時篩選獲得具有防病促生功能菌株，為后續(xù)的農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供菌種資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 樣品采集 于廣西北海市鐵山港區(qū)（東經(jīng)108°18′9.76″～109°47′80.46″，北緯21°26′46.88″～21°47′0.78″）采樣時選取剛?cè)肭郑ɑセ撞輪畏N蓋度≤30%的入侵群落）和大范圍入侵（互花米草單種蓋度≥70%的入侵群落）的互花米草健康植株各5株，保存在無菌密封袋中，置于冰盒帶回實驗室，24 h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離。

1. 1. 2 供試病原菌 香蕉枯萎病病原真菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）由廣西多糖材料與改性重點實驗室提供。

1. 1. 3 分離培養(yǎng)基 （1）YIM171培養(yǎng)基：甘油10.00 g，天冬酰胺1.00 g，磷酸氫二鉀1.00 g，七水硫酸鎂0.50 g，碳酸鈣0.30 g，復(fù)合維生素0.03 g，微量元素溶液（七水硫酸亞鐵0.10 g，四水氯化錳0.10 g，七水硫酸鋅0.10 g，溶于100 mL水）1 mL，海鹽25.00 g，瓊脂15.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2±0.2。（2）R2A培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.500 g，蛋白胨0.500 g，酪蛋白水解物0.500 g，葡萄糖0.500 g，可溶性淀粉0.500 g，磷酸二氫鉀0.300 g，硫酸鎂0.024 g，丙酮酸鈉0.300 g，瓊脂15.000 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2±0.2。（3）LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，氯化鈉10.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2±0.2。（4）Zobell 2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5.00 g，酵母膏1.00 g，磷酸高鐵0.01 g，瓊脂15.00 g，陳海水1000 mL，pH 7.2±0.2。（5）NBRIP培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，磷酸三鈣 5.00 g，氯化鎂 5.00 g，七水硫酸鎂0.25 g，氯化鉀0.20 g，硫酸銨1.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.0。（6）Ashby無氮培養(yǎng)基（g/L）：甘露醇10.00 g，磷酸二氫鉀0.20 g，七水硫酸鎂0.20 g，氯化鈉0.20 g，石膏0.10 g，碳酸鈣 5.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2±0.2。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品處理 分別取不同入侵程度互花米草植株的根、莖和葉，去除表面附著土壤顆粒并用無菌水沖洗3次后，取根、莖和葉組織各1 g，以75%酒精消毒根組織3 min、莖和葉組織1 min;1% NaClO溶液浸泡根組織5 min、莖和葉組織3 min;最后以無菌水進(jìn)行反復(fù)沖洗，并吸干水分。吸取最后1次漂洗的無菌水100 μL涂布于配置好的培養(yǎng)基上，驗證消毒效果。將處理后的各樣品加入9 mL無菌水研磨至勻漿后，分別用無菌水稀釋3次，得到濃度為10-2、10-3和10-4稀釋液，取200 μL涂布于配置好的培養(yǎng)基上（劉魯峰等，2019）。

1. 2. 2 菌株分離及保存 將涂布好的培養(yǎng)基于30 ℃倒置培養(yǎng)3～7 d，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基斜面上，根據(jù)菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征去重復(fù)后，純化菌株，轉(zhuǎn)入斜面4 ℃短期保存，轉(zhuǎn)入20%（v/v）甘油管 -20 ℃長期保藏。

1. 2. 3 DNA提取與菌株鑒定 基因組DNA提取參考周雙清等（2010）的方法。采用細(xì)菌通用引物27F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）和1492R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系50.0 μL：2×Taq MasterMix 25.0 μL ，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行32個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果輸入EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲取分離菌株最相似菌株及其相似性，16S rRNA序列相似度小于98.65%定義為潛在新種（Kim et al.，2014），根據(jù)比對結(jié)果判斷分離菌株的分類地位。使用MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 4 促生菌株篩選 通過功能培養(yǎng)基分析內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、溶磷和固氮等促生活性。

1. 2. 4. 1 固氮能力菌株篩選 將篩選出的互花米草內(nèi)生細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中活化1 d，分別接種于Ashby無氮固體培養(yǎng)基和Ashby無氮液體培養(yǎng)基，以清水為對照，3次重復(fù)，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～7 d，觀察固體培養(yǎng)基中有菌落和液體培養(yǎng)基渾濁為陽性，則有固氮活性（姚玉玲等，2014）。

1. 2. 4. 2 溶磷能力菌株篩選 將篩選出的互花米草內(nèi)生細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中活化1 d，接種于NBRIP培養(yǎng)基，以清水為對照，3次重復(fù)，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～7 d，出現(xiàn)透明圈則該菌株具有溶磷活性（趙龍飛等，2015）。

1. 2. 4. 3 產(chǎn)IAA能力菌株篩選 采用Salkowski比色法，將待測菌株接種于加有色氨酸的LB液體培養(yǎng)基，30 ℃下180 r/min培養(yǎng)3 d，離心取上清液100 μL，加入等體積Salkowskis試劑混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，觀察顏色變化，紅色或粉紅色為陽性，即產(chǎn)生IAA（Glickmann and Dessaux， 1995）。

1. 2. 5 抑制病原真菌能力菌株篩選 采用平板對峙法測定。使用滅菌打孔器（r=0.5 cm）從PDA培養(yǎng)基中獲取已培養(yǎng)完成的香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌接種于PDA培養(yǎng)基正中心，并將分離得到的互花米草內(nèi)生細(xì)菌接種于PDA培養(yǎng)基四周，以不接種內(nèi)生細(xì)菌的PDA培養(yǎng)基為對照。30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，篩選得到具有抑菌效果的內(nèi)生細(xì)菌，再接種于病原菌的四周，重復(fù)3次，進(jìn)行復(fù)篩，測定病原菌直徑，計算抑菌率（徐亞軍等，2013）。抑菌率（%）=（對照菌落直徑-測定菌落直徑）/對照菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2. 1 互花米草內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析結(jié)果

從互花米草植株中共分離出269株菌株，根據(jù)菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征去重復(fù)后獲得82株菌株。對82株菌株進(jìn)行16S rRNA序列測序，經(jīng)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對，82株菌株分屬于6綱16目19科31屬，6個綱分別為放線菌綱（Actinobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、異常球菌綱（Deinococci）和黃桿菌綱（Flavobacteriia）。選取各個屬中模式菌株以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖1所示，γ-變形菌綱和α-變形菌綱為優(yōu)勢類群，分別包括雷伯氏菌屬（Klebsiella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等11個屬26株菌株（占31.71%）和Tistrella、Martelella等9個屬14株菌株（占17.07%）。此外，還分離出與已發(fā)現(xiàn)菌株相似性在96.13%～98.63%的潛在新種13株（占15.85%）（表1），表明互花米草存在大量可挖掘的新的微生物資源。

2. 2 互花米草不同組織內(nèi)生可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性差異分析結(jié)果

從互花米草根、莖和葉中分別分離得到107、93和69株內(nèi)生菌，通過16S rRNA測序及EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對，分屬于6綱16目19科31屬，屬的差異如圖2所示。根的內(nèi)生細(xì)菌分屬于13屬：異常球菌屬（Deinococcus）、微小桿菌屬、櫻桃樣芽孢桿菌屬（Cerasibacillus）、庫特氏菌屬（Kurthia）、腸桿菌屬（Enterobacter）、產(chǎn)微球莖菌屬（Microbulbifer）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、雷伯氏菌屬（Klebsiella）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、Tistrella、赤桿菌屬（Erythrobacter）、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。莖的內(nèi)生細(xì)菌分屬于19屬：虛構(gòu)芽孢桿菌屬（Fictibacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）、分枝桿菌屬（Mycolicibacterium）、纖維菌屬（Cellulomonas）、Leeuwenhoekiella、拉布倫茨氏菌（Labrenzia）、深海海旋菌屬（Thalassospira）、Stakelama、Salinicola、橙單胞菌屬（Aurantimonas）、假海源菌屬（Pseudidiomarina）、類芽孢桿菌屬、雷伯氏菌屬、希瓦氏菌屬、Tistrella、赤桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和莫拉氏菌屬（Moraxella）。葉的內(nèi)生細(xì)菌分屬于13屬：鏈霉菌屬（Streptomyces）、瓊斯氏菌屬（Jonesia）、雷伯氏菌屬、Gallaecimonas、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、Yangia、依格納季氏菌屬（Ignatzs-chineria）、假單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、赤桿菌屬、芽孢桿菌屬和莫拉氏菌屬?；セ撞莶煌M織內(nèi)生細(xì)菌分布差異明顯，根和莖有7個共有屬（類芽孢桿菌屬、希瓦氏菌屬、Tistrella、赤桿菌屬、 假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和雷伯氏菌屬），莖和葉有5個共有屬（赤桿菌屬、雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和莫拉氏菌屬），根和葉有4個共有屬（赤桿菌屬、雷伯氏菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬），根、莖和葉有4個共有屬（赤桿菌屬、雷伯氏菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬）。從菌株數(shù)量上看，表現(xiàn)為根>莖>葉。

2. 3 不同入侵程度互花米草內(nèi)生細(xì)菌差異分析結(jié)果

分別從互花米草剛?cè)肭趾痛蠓秶肭种仓牦w內(nèi)分離得到141和128株內(nèi)生細(xì)菌，通過16S rRNA測序及EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對，141和128株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于19和25個屬，其中9個屬為共有屬。通過對比發(fā)現(xiàn)，互花米草大范圍入侵后，其內(nèi)生細(xì)菌群落較剛?cè)肭謺r發(fā)生明顯改變，放線菌綱中分枝桿菌屬被替換為瓊斯氏菌屬、纖維菌屬和鏈霉菌屬，芽孢桿菌中增加了微小桿菌屬、櫻桃樣芽孢桿菌屬、Kurthia和虛構(gòu)芽孢桿菌屬等;α變形菌多樣性降低，深海海旋菌屬、Yangia、Stakelama、赤桿菌屬和鞘脂單胞菌屬等消失;γ變形菌多樣性則呈增加趨勢，檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、Gallaecimonas、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬、Salinicola和依格納季氏菌屬等出現(xiàn)。表明入侵程度不同導(dǎo)致互花米草內(nèi)生細(xì)菌的種屬差異明顯，隨著入侵程度的增加，γ變形菌占據(jù)優(yōu)勢，而放線菌和芽孢桿菌多樣性增加。

2. 4 互花米草內(nèi)生細(xì)菌促生性分析結(jié)果

對互花米草內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行菌株促生活性分析，結(jié)果分別獲得21株固氮菌和產(chǎn)IAA菌，分別占分離菌株總數(shù)的25.61%，溶磷菌11株（占13.41%），分屬于4綱7目10科17屬中（表2）。

2. 5 互花米草內(nèi)生細(xì)菌抑菌功能分析結(jié)果

通過平板對峙法篩選到對供試香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌具有抑制作用的菌株14株（占17.07%），抑菌率為15.46%～68.31%，其中抑菌活性最高的為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），抑菌率為68.31%（表3）。部分菌株對香蕉枯萎病病原菌的抑制效果見圖3。

3 討論

3. 1 互花米草內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

從互花米草根、莖和葉中分別分離得到內(nèi)生細(xì)菌107、93和69株，分屬于放線菌綱、芽孢桿菌綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱、異常球菌綱及黃桿菌綱?；セ撞輧?nèi)生細(xì)菌種類較多，變形菌為主要優(yōu)勢菌，占48.78%，其中γ-變形菌綱和α-變形菌綱分別占31.71%和17.07%，與李虎等（2014）報道互花米草的內(nèi)生細(xì)菌及程亮（2019）發(fā)現(xiàn)矮火絨草的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢菌均為變形菌的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)潛在新種13株，與已發(fā)現(xiàn)菌株相似性在96.13%～98.63%，表明互花米草存在大量可挖掘的生物資源。

本研究結(jié)果顯示，從互花米草根、莖和葉組織中分離的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量表現(xiàn)為根>莖>葉，與劉魯峰等（2019）對甘蔗不同組織內(nèi)生菌的研究結(jié)果一致。大量研究表明，內(nèi)生菌在植物組織的分布存在差異，可能是由于植物各組織結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致供給內(nèi)生菌營養(yǎng)成分有所差異（方珍娟等，2018）。

隨著互花米草入侵程度的增加，其體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌種類發(fā)生變化，互花米草內(nèi)生放線菌瓊斯氏菌屬、纖維菌屬和鏈霉菌屬增加。瓊斯氏菌屬被發(fā)現(xiàn)來源于海洋（Zeynab et al.，2020），鏈霉菌屬被發(fā)現(xiàn)廣泛來源于紅樹林土壤中（候師師等，2020）。γ變形菌多樣性增加，檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、Gallaecimonas、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬、Salinicola和依格納季氏菌屬等出現(xiàn)。Gallaecimonas屬在紅樹林沉積物和海水中被分離得到（Wang et al.，2013;Zhang et al.，2018），嗜冷桿菌屬和希瓦氏菌屬廣泛存在于紅樹林根內(nèi)和海洋中（孫靜等，2014;聶唱等，2020; Maxim et al.，2020）。因此，隨著入侵程度的增加，互花米草內(nèi)生細(xì)菌種類的增加可能是來源于紅樹林土壤及海洋中。這符合內(nèi)生菌來源的假說之一，根際菌進(jìn)入植物，經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化作用，與植物建立了一種和諧的內(nèi)生關(guān)系，形成內(nèi)生菌（徐亞軍，2011）。

3. 2 可培養(yǎng)細(xì)菌促生活性及生防功能

植物內(nèi)生菌是一類種類及功能多樣的微生物。植物內(nèi)生菌多對宿主產(chǎn)生有益作用，包括直接分泌生長素促進(jìn)植物生長，溶磷解鉀作用、固氮作用和抑制病原菌等間接促進(jìn)植物生長，以及增加植物的抗逆作用等（Raheem et al.，2017; Charlie et al.，2018;Xu et al.，2019;龐發(fā)虎等，2020），探究內(nèi)生菌功能活性已成為研究熱點之一（Borah et al.，2019;Khan et al.，2020）。

鄧振山等（2019）從巨菌草（Pennisetum giganteum）中分離出具有溶磷、固氮、抑制病原菌能力，以及產(chǎn)鐵載體的內(nèi)生菌;陽湖榮等（2019）從白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz）中分離得到較多具有促生能力的芽孢桿菌以及1株兼具固氮、溶磷、解鉀能力且吲哚乙酸合成能力較強(qiáng)的內(nèi)生芽孢桿菌屬內(nèi)生菌;付思遠(yuǎn)等（2020）從泓森槐（Robinia pseudoacacia ‘Hongsen）中分離得到的類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）內(nèi)生菌具有固氮能力，而分離出的克雷伯氏菌屬兼具解鉀、溶磷、產(chǎn)生長素、產(chǎn)鐵載體和聯(lián)合固氮等多種促生長特性。本研究獲得抑菌活性最高的菌株與貝萊斯芽孢桿菌的相似性達(dá)100.00%。遲惠榮等（2019）研究發(fā)現(xiàn)多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌有較強(qiáng)的抑制作用;程亮（2019）從青藏高原矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到的芽孢桿菌屬拮抗細(xì)菌的拮抗能力強(qiáng)、種類多，本研究結(jié)果與之一致。

隨著互花米草入侵程度的加深，γ變形菌多樣性增加，檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和依格納季氏菌屬等屬出現(xiàn)，其中檸檬酸桿菌屬篩選得到具有溶磷活性的菌株，腸桿菌屬篩選出具有溶磷、固氮和產(chǎn)IAA活性的菌株;依格納季氏菌屬中篩選出具有固氮和產(chǎn)IAA活性的菌株;放線菌、芽孢桿菌和α變形菌中被保留的微桿菌屬、類芽孢桿菌屬、拉布倫茨氏菌屬均篩選出具有固氮活性的菌株。因此，隨著入侵程度的增加，內(nèi)生菌種類更加趨向于對植株產(chǎn)生有益活性的菌株，與Cheng等（2019）的研究結(jié)果類似，為探究植物—細(xì)菌相互作用在植物入侵中的作用提供參考。

4 結(jié)論

互花米草內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性，且多具有促生活性和生防功能，可為后續(xù)相關(guān)研究及應(yīng)用提供微生物資源。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）