艾灸督脈改變AD轉(zhuǎn)基因小鼠事件相關(guān)電位P300的分析研究

★ 鐘倩 朱才豐 宋小鴿 楊駿 潘洪萍 賀成功 楊坤 秦曉鳳（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 合肥 008；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病三科 合肥 006；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸經(jīng)絡(luò)研究所 合肥 008；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸康復(fù)科 合肥 008）

老年性癡呆，即阿爾茨海默病（alzheimer’s disease，AD），是一種器質(zhì)性精神障礙疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能的下降，隨著全球人口老齡化步伐加快，本病的發(fā)病率迅速攀升，已經(jīng)日益成為醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的沉重負(fù)擔(dān)［1］。P300認(rèn)知電位是對(duì)認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)價(jià)的的一種客觀方法，是反映大腦對(duì)信息加工、處理的一項(xiàng)有用的指標(biāo)。從當(dāng)前研究來(lái)看運(yùn)用P300認(rèn)知電位來(lái)分析阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知電位變化的機(jī)制研究相對(duì)不足，因此本實(shí)驗(yàn)從P300事件相關(guān)電位出發(fā)來(lái)分析艾灸督脈對(duì)AD小鼠的認(rèn)知功能改善的是否有效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組實(shí)驗(yàn)采用雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠和同齡同背景的雄性野生型C57BL/6J小鼠，所有小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（軍）2012-0007，SPF級(jí)）。購(gòu)回后，在通風(fēng)條件良好的清潔級(jí)動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，溫度保持（24±2）℃，每日定時(shí)喂養(yǎng)專用飼料及清潔水，環(huán)境設(shè)置為晝夜明暗交替，交替時(shí)間為12 h/12 h，飼養(yǎng)1月。

動(dòng)物分組：購(gòu)入的雄性AD轉(zhuǎn)基因小鼠和健康野生型雄性C57BL/6J小鼠共計(jì)68只，經(jīng)過(guò)Morris水迷宮篩選實(shí)驗(yàn)剔除測(cè)試成績(jī)較差者，剩余健康野生型C57BL/6J小鼠10只，雄性AD轉(zhuǎn)基因小鼠40只。將健康小鼠設(shè)置為正常組，按完全隨機(jī)法將40只AD轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組、艾灸組、西藥I組、西藥II組，每組10只。

動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（參考編號(hào)：#AUCM-2017-0216）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，避免不必要的傷害或減輕痛苦。

1.2 治療方法正常組：采用同齡同背景健康野生型 C57BL/6J 雄性小鼠10只，常規(guī)飼養(yǎng)，作為空白對(duì)照組，不做特殊處理。

模型組：采用10只AD轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型組，常規(guī)飼養(yǎng)，作為空白對(duì)照組，不做特殊處理。

艾灸組：將AD轉(zhuǎn)基因小鼠固定于自制鼠板上，在保持其清醒狀態(tài)下，根據(jù)“十五”規(guī)劃《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［2］取督脈穴“百會(huì)”“天門(風(fēng)府)”“大椎”并參照模擬人體解剖學(xué)定位。在“百會(huì)”穴上放置直徑2 cm、厚4～6 mm的附子餅，予實(shí)按灸使灸火直接實(shí)按于附子餅上，待皮膚灼熱潮紅時(shí)迅速提起，反復(fù)灸20 min；“天門”“大椎”穴予溫和灸，灸至皮膚局部灼熱潮紅，時(shí)間為20min，施灸過(guò)程中避免燙傷小鼠。每日治療1次，周期為2周，每周休息1 d。

西藥I組：采用AD轉(zhuǎn)基因小鼠，予腹腔注射雷帕霉素2 mg·kg-1·d-1，1 次/d，療程與艾灸組平行。

西藥II組：采用AD轉(zhuǎn)基因小鼠，艾灸督脈治療的同時(shí)予腹腔注射抑制自噬藥物3-甲基腺嘌呤（3 - methlyadenine，3- MA）1.5 mg·kg-1·d-1，1 次/d，療程與艾灸組平行。

1.3 P300電位測(cè)定使用丹麥產(chǎn)CounterpointMK2型誘發(fā)電位儀捕捉小鼠頭皮的長(zhǎng)潛伏期電位，通過(guò) Neuroscan Nuamps 腦電記錄儀分析及記錄電位變化，Scan 4.3信號(hào)處理軟件離線分析腦電數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)中于基線、2周后檢測(cè)N2潛伏期、P3 潛伏期及P3波幅。正常組及模型組僅于基線時(shí)測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果運(yùn)用Spss 22.0軟件分析，各組數(shù)據(jù)方差齊時(shí)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)；組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；以P＜0.05記為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前各組事件相關(guān)電位比較治療前正常組與模型組、艾灸組、西藥I組、西藥II組的N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AD小鼠的N2潛伏期、P3潛伏期均是高于正常小鼠，P3波幅降低；模型組與艾灸組、西藥I組、西藥II組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 治療前各組小鼠N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅比較（n=10）

2.2 治療后各組事件相關(guān)電位比較艾灸組與西藥I組在治療后N2潛伏期較治療前無(wú)明顯變化（P＞0.05），P3潛伏期較治療前縮短，P3波幅升高（P＜0.05），說(shuō)明艾灸督脈與注射雷帕霉素的處理方法均能改善AD小鼠的認(rèn)識(shí)功能；西藥II組治療前后比較N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅均無(wú)差異（P＞0.05）；艾灸組與西藥I組在治療后P3潛伏期、P3波幅比較無(wú)差異（P＞0.05），說(shuō)明兩者在改善認(rèn)知功能方面無(wú)較大差別。見表2。

表2 治療后各組小鼠N2潛伏期、P3潛伏期、P3波幅比較（n=10）

3 討論

阿爾茨海默病主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降、精神癥狀和行為障礙、日常生活能力的逐漸下降，調(diào)查顯示60歲以上的老人隨著年齡的增長(zhǎng)，每往后年長(zhǎng)5歲，老年癡呆患者的百分?jǐn)?shù)將上升2倍，65歲以上老人患老年癡呆的概率是13 %，而85歲以上的老人患該病的概率達(dá)到45 %［3］。在古代文獻(xiàn)中，本病多記載為“健忘”“癡呆”，其病機(jī)關(guān)鍵是本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，多為心、肝、脾、腎等臟腑虧損，運(yùn)化無(wú)力使水濕、痰瘀停結(jié)，阻滯腦絡(luò)，使清空受擾，神機(jī)失用而致癡呆。中醫(yī)治療根據(jù)“髓海不足”“氣血虧虛”等虛證分型，“痰濁蒙竅”“瘀血內(nèi)阻”“心肝火旺”等實(shí)證分型各有治則治法。西醫(yī)學(xué)目前普遍認(rèn)為AD的發(fā)生與Aβ生成與清除機(jī)制失衡使Aβ沉積過(guò)多形成的細(xì)胞外老年斑息息相關(guān)，除此還認(rèn)為過(guò)度磷酸化的Tau蛋白也能影響神經(jīng)元及突觸的正常功能［4］。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療中尚無(wú)特效藥物可治愈或有效逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程，但可一定程度上減輕癥狀及延緩病情發(fā)展。在改善認(rèn)知功能上常用乙酰膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-門冬氨酸受體拮抗劑，并結(jié)合抗抑郁和抗精神病藥物來(lái)控制精神癥狀的發(fā)生。在中醫(yī)學(xué)的治療探索中，經(jīng)現(xiàn)代研究證明針刺在減少Aβ沉積、抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化、促進(jìn)中樞神經(jīng)傳遞等方面的具有一定作用，可改善認(rèn)知功能［5］。

ERP現(xiàn)在研究較多的是P300電位，按性質(zhì)特性歸屬為內(nèi)源性成分，因其不易受外界刺激的物理特性影響，與認(rèn)知關(guān)系最密切，也被稱為“認(rèn)知電位”。P300與特定的認(rèn)知活動(dòng)相關(guān)，其敏感性和客觀性較神經(jīng)心理學(xué)更高，可以反應(yīng)語(yǔ)言、記憶、執(zhí)行功能域的損害。P300的潛伏期反映了大腦對(duì)外界刺激的反映速度，難度大時(shí)反應(yīng)速度相應(yīng)增加；P300波幅表明大腦對(duì)信息加工時(shí)所匹配的有效資源的程度［6］。據(jù)研究表明在癡呆的早期階段，P300較量表而言更能準(zhǔn)確識(shí)別疾病的發(fā)生，同時(shí)也能區(qū)分與癡呆臨床表現(xiàn)相似的假性癡呆患者，且對(duì)認(rèn)知功能藥物的療效也能做出可靠的評(píng)估，可作為臨床評(píng)估認(rèn)知功能的一種有效工具［7］。

本實(shí)驗(yàn)中艾灸組小鼠取穴“百會(huì)”“天門（風(fēng)府）”“大椎”，三穴選取思路來(lái)源于國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)蔡圣朝主任醫(yī)師學(xué)術(shù)思想，認(rèn)為治療癡呆應(yīng)從從“神-腦-督脈-腎-任脈”軸入手［8］。在治療癡呆時(shí)應(yīng)重視督脈取穴：腦為元神之府，督脈“入絡(luò)腦”，如張錫純所言“督脈者，腦髓神經(jīng)之所也”，調(diào)節(jié)督脈可起到安神定志的作用；督脈為“陽(yáng)脈之海”，任脈為“陰脈之?！保呔鹩诎?，為腎所主，上連與神明之府，在針刺督脈時(shí)易于調(diào)動(dòng)任脈之經(jīng)氣共同作用于腦；且腎“主骨生髓”，腦為“髓?！保矫}之別絡(luò)貫脊屬腎，腎充則髓充，從而補(bǔ)益于腦。督脈將腦、腎、任脈聯(lián)系起來(lái)共同作用來(lái)補(bǔ)益腦髓、調(diào)控神志的作用。百會(huì)穴為督脈要穴，《灸法秘傳》曰：“忘前失后，曰健忘也……病因雖異，皆當(dāng)灸百會(huì)一穴而記憶自強(qiáng)矣?！备舾阶语灳哂信嘣瘫?，益氣升陽(yáng)作用，與百會(huì)共奏益腦之效。大椎、風(fēng)府，配合百會(huì)取“腧穴所在，主治所在”之意，溫和灸輔之，三穴同用，加強(qiáng)醒腦開竅的作用?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為AD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元體積縮小，數(shù)量減少，而艾灸療法能改善海馬神經(jīng)細(xì)胞水腫，促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙［9］。而且在造模前對(duì)大鼠進(jìn)行艾灸預(yù)刺激的研究中也認(rèn)為預(yù)艾灸組在與模型組大鼠比較中能改善減少大鼠腦內(nèi)cyclin A 和 cyclinB 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，從而緩解AD的病理改變［10］。在本實(shí)驗(yàn)的前期研究結(jié)果顯示艾灸督脈改善小鼠認(rèn)知功能的作用機(jī)制與提升小鼠腦內(nèi)的細(xì)胞自噬水平有關(guān)，可改善因Aβ聚集形成的老年斑及神經(jīng)細(xì)胞毒性所導(dǎo)致的腦損傷，有效的阻斷Aβ過(guò)度表達(dá)引發(fā)的炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙［11］。

本實(shí)驗(yàn)中艾灸組小鼠隔附子餅灸“百會(huì)”，溫和灸“天門（風(fēng)府）”“大椎”，西藥I組用雷帕霉素腹腔注射給藥，西藥II組在艾灸組治療同時(shí)予以3-甲基腺嘌呤腹腔注射給藥；正常組和模型組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，不予特殊處理，僅進(jìn)行治療前的P300測(cè)定。結(jié)果顯示治療前正常組與模型組相比較：AD小鼠的N2潛伏期、P3潛伏期延長(zhǎng)，P3波幅則是較之更低，表明了AD小鼠認(rèn)知功能的下降，此結(jié)果與大多數(shù)學(xué)者對(duì)AD患者的研究結(jié)果是一致的［12-14］。而艾灸組在治療后在P300的測(cè)定中表現(xiàn)為P3潛伏期縮短，P3波幅上升，說(shuō)明艾灸對(duì)改善小鼠的認(rèn)知功能有作用。在西藥I組中雷帕霉素作為新型的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，具有高效免疫抑制作用，其通過(guò)增強(qiáng)自噬功能，顯著減少腦內(nèi)異常蛋白質(zhì)聚集體，維持腦內(nèi)功能物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，從而抑制神經(jīng)變性過(guò)程的發(fā)生來(lái)保護(hù)腦功能［15］，在P300的測(cè)定結(jié)果中與艾灸組結(jié)果相似，間接能推測(cè)艾灸發(fā)揮作用于誘導(dǎo)自噬有關(guān)。而3-MA作為經(jīng)典的自噬抑制劑，具有抑制細(xì)胞自噬激活的作用［16］，在艾灸的同時(shí)采用3-MA腹腔注射治療，兩相作用使艾灸自噬功能降低，從而P300測(cè)定表現(xiàn)為治療前后P3潛伏期與P3波幅無(wú)明顯改變。

總的來(lái)說(shuō)，艾灸對(duì)阿爾茨海默病的作用機(jī)理逐漸明朗，臨床運(yùn)用也越來(lái)越多。運(yùn)用P300事件相關(guān)電位對(duì)疾病進(jìn)行篩查及預(yù)后判斷的研究也逐漸豐富，研究認(rèn)為在P300測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病可與MCI、額顳葉癡呆、血管性癡呆相區(qū)別，說(shuō)明P300在認(rèn)知功能障礙患者診斷中對(duì)可以作為AD早期診斷的敏感性較高［17-19］。因此在臨床中可逐漸推廣P300電位研究，從而減少量表評(píng)估的單一性。本實(shí)驗(yàn)艾灸組與雷帕霉素組在治療后測(cè)定P300顯示能有效縮短AD小鼠P3潛伏期、升高P3波幅，說(shuō)明艾灸督脈與使用自噬劑雷帕霉素均能改善小鼠認(rèn)知功能。但本實(shí)驗(yàn)同樣存在樣本量不足的缺點(diǎn)，有待在今后實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)。