基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討華蟾素抗腫瘤的作用機制

★ 羅飛鳳 侯恩存 鄭景輝 唐友明 吳競 熊佳惠 盧岳虹（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南寧 53000；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 南寧 5300）

華蟾素（Cinobufotalin）為我國傳統(tǒng)中藥中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等干皮提煉出的有效成分。蟾蜍作為藥物治療疾病由來已久，其藥性理論記載，首見于我國第一部藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》“蝦蟆，味辛、寒，主邪氣，破癥堅血，癰腫，陰瘡，服之不患熱病”。蟾皮單獨入藥，始見于《木經(jīng)逢原》“蟾皮，辛、涼，微毒”。“蟾蜍”之名，首見于《名醫(yī)別錄》，陶弘景注云，螟蟆“一名蟾蜍”。蟾蜍藥性辛、涼，歸心、肝、脾、肺經(jīng)。當(dāng)代本草學(xué)巨著《中華本草》記載：蟾蜍“味辛、性涼，有毒。歸心、肝、脾、肺經(jīng)”，能“解毒散結(jié)，消積利水，殺蟲消疳。主治癰疽、療瘡、發(fā)背、瘰疬、惡瘡、癥瘕癖積、臌脹、水腫、小兒疳積、破傷風(fēng)、慢性咳喘”，并進一步指出“蟾蜍還被應(yīng)用于腫瘤治療，對胃癌、食管癌、膀膚癌、肝癌、白血病有一定療效”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)華蟾素的主要生物活性成分為蟾毒內(nèi)酸類，如蟾酥毒素、脂蟾蜍配基、華蟾素毒基等［1］。華蟾素因其具有低毒、高效，并且對多種腫瘤都具有良好的治療效果而受到國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，構(gòu)建“成分-靶點-通路-疾病”之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系探討藥物的作用機制［2］。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以多成分-多靶點-多通路調(diào)控的思維為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建“成分-靶點-通路-”網(wǎng)絡(luò)研究華蟾素對腫瘤的作用機制，為臨床工作提供一定的指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫檢索本研究涉及到的數(shù)據(jù)庫包括：Drugbank（www.drugbank.ca/）；Batman（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；CTD（http：//ctdbase.org/）；uniprot（https：//www.uniprot.org/）；STRING（https：//string-db.org/）；Omicshare（http：//www.omicshare.com/）；cytoscape3.7.0（http：//www.cytoscape.org/）。

1.2 華蟾素藥物活性成分及相關(guān)蛋白的收集在CTD（http：//ctd.mdibl.org/)、Drugbank（www.drugbank.ca/） 以 及Batman（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫，并篩選出符合條件的藥物活性成分，并收集合并去重。再通過CTD（http：//ctdbase.org/）數(shù) 據(jù) 庫、OMIM（http：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫輸入相關(guān)檢索式檢索得到華蟾素藥物活性成分的相關(guān)蛋白，即該藥物的潛在抗腫瘤靶點。

1.3 制作華蟾素藥物活性成分蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖將1.2中收集到的相關(guān)蛋白利用STRING（https：//stringdb.org/）在線平臺制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并以tsv格式導(dǎo)入cytoscape3.7.0（http：//www.cytoscape.org/）對該蛋白互作圖進行可視化處理及分析。

1.4 華蟾素抗腫瘤相關(guān)通路圖為了解華蟾素發(fā)揮抗腫瘤功效的作用機理，利用京都基因與基因組百科全書（the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http：//www.genome. jp/kegg/）通路數(shù)據(jù)庫以及KOBAS3.0平臺軟件制作通路圖，并篩選出具有抗腫瘤作用的相關(guān)通路，然后進行通路注釋和分析。

1.5 制作成分-靶點-通路圖將上述步驟中得到的藥物活性成分、相關(guān)蛋白靶點以及信號通路共同 導(dǎo) 入cytoscape3.7.0（http：//www.cytoscape.org/）軟件，以節(jié)點（node）表示成分、靶點和通路，邊（edge）表示兩者之間的相互作用，構(gòu)建并繪制出成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素藥物活性成分及相關(guān)蛋白靶點的收集結(jié)果 通過CTD數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“Cinobufotalin”，并將Drugbank、Batman數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果進一步篩選合并，得到華蟾素藥物活性成分共30個，再利用CTD數(shù)據(jù)庫進一步預(yù)測出華蟾素潛在抗腫瘤相關(guān)靶點蛋白，BAX、BID、CASP2、CASP3、CASP8、CASP9、FAS共7個。成分及蛋白靶點，見表1。

表1 華蟾素藥物活性成分及相關(guān)蛋白靶點

2.2 華蟾素抗腫瘤相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分析為進一步說明華蟾素相關(guān)蛋白靶點的相互作用機制，通過STRING在線平臺，設(shè)定為人源相關(guān)性（Homo sapiens），導(dǎo)入上述相關(guān)蛋白靶點制作蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。然后利用cytoscape3.7.0軟件對該網(wǎng)絡(luò)互作圖進行可視化處理和分析。分析結(jié)果顯示，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中共有7個 節(jié) 點（Node），BAX、BID、CASP2、CASP3、CASP8、CASP9以及FAS，即7個相關(guān)蛋白靶點，有42條邊（Edge），即42條相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)各相關(guān)蛋白靶點之間均具有緊密的聯(lián)系，見圖1。

圖1 華蟾素相關(guān)蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 華蟾素抗腫瘤相關(guān)通路圖制作與分析將上述7個相關(guān)蛋白靶點導(dǎo)入KOBAS3.0在線平臺軟件，即可得出華蟾素相關(guān)KEGG通路信息，進一步篩選出具有抗腫瘤作用的生物信號通路，見表2。結(jié)果顯示華蟾素潛在抗腫瘤相關(guān)通路共計15條，主要涉及p53信號通路、癌癥通路、結(jié)直腸癌信號通路、非小細胞肺癌信號通路、前列腺癌信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等。其中，有6個蛋白靶點作用于p53信號通路（p53 signaling pathway）、6個蛋白靶點作用于癌癥通路（Pathways in cancer），另外，有3個蛋白靶點作用于結(jié)直腸癌信號通路（Colorectal cancer signaling pathway），見圖2。

圖2 各通路圖

表2 華蟾素抗腫瘤相關(guān)通路信息

利用Omicshare分析平臺制作高級氣泡圖，圖中氣泡從綠色到紅色表示P由大到小，氣泡面積大小反應(yīng)基因數(shù)量的多少。由富集分析結(jié)果可知，共有15條與腫瘤相關(guān)的KEGG通路，其中，富集程度最高的前三條通路分別是p53信號通路（p53 signaling pathway）、結(jié)直腸癌信號通路（Colorectal cancer signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）。見圖3。

圖3 華蟾素抗腫瘤作用相關(guān)信號通路的高級氣泡圖

2.4 華蟾素的“成分-靶點-通路”圖構(gòu)建與分析將上述步驟中收集到的華蟾素藥物活性成分、蛋白靶點以及相關(guān)腫瘤信號通路信息，共同列入Excel表格，并設(shè)定對應(yīng)關(guān)系及屬性，分別導(dǎo)入cytoscape3.7.0軟件制作“成分-靶點-通路”圖，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)性質(zhì)，選取度值（Degree）較高藥物活性成分節(jié)點（Node）進行分析，連線（Edge）較多的節(jié)點在該網(wǎng)絡(luò)中可能起到主要抗腫瘤作用，利用 Network Analyzer插件對結(jié)果進行分析。分析結(jié)果顯示，節(jié)點連線數(shù)量最多，即起到關(guān)鍵作用的蛋白靶點是促細胞凋亡蛋白BAX（Degree 17）,另外，p53信號通路（p53 signaling pathway，Degree 4）是最主要的腫瘤相關(guān)通路。所得結(jié)果見圖4。

圖4 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進行的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析來預(yù)測不同節(jié)點關(guān)聯(lián)性的一門學(xué)科。其打破了“一個藥物、一個靶點、一種疾病”的傳統(tǒng)理念，為中藥多成分、多靶點、多途徑效應(yīng)研究提供了可量化的數(shù)據(jù)，有助于實現(xiàn)單味藥多成分或復(fù)方藥作用機制的整體化、系統(tǒng)化探索［3］。此次研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對華蟾素有效成分抗腫瘤的作用機制進行了探討。

華蟾素成分、作用機制較復(fù)雜。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出華蟾素中 30 個活性成分和 7個相關(guān)蛋白靶點。此次研究中，從KEGG通路注釋圖分析結(jié)果顯示，與華蟾素有效成分抗腫瘤的潛在作用靶點相關(guān)的信號通路共有15條，其中，富集程度最高的前三條通路分別是p53信號通路（p53 signaling pathway）、結(jié)直腸癌信號通路（Colorectal cancer signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）。血管內(nèi)皮生長因子信號通路與細胞的增殖與凋亡有關(guān)［4-7］；非小細胞肺癌信號通路與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)有關(guān)［8-9］等。張應(yīng)龍［10-13］等研究表明，p53信號通路可作用DNA損傷修復(fù)的多個過程，激活后可調(diào)控細胞凋亡及細胞周期。本研究網(wǎng)絡(luò)分析和核心靶點分析結(jié)果顯示，華蟾素有效成分抗腫瘤的作用主要與細胞的增殖與凋亡、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、調(diào)控細胞凋亡及細胞周期等靶點密切相關(guān)。

綜上所訴，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對華蟾素抗腫瘤的多成分、多靶點、多途徑的潛在作用機制進行了分析。結(jié)果表明，華蟾素有效成分可能通過血管內(nèi)皮生長因子信號通路、非小細胞肺癌信號通路、p53信號通路、結(jié)直腸癌信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等作用于相應(yīng)靶點，進而發(fā)揮抗腫瘤的作用，為華蟾素防治腫瘤的開發(fā)利用提供了一定的參考依據(jù)。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要依賴現(xiàn)有文獻和生物數(shù)據(jù)庫及在藥物有效成分及作用靶點的分布差異等生物網(wǎng)絡(luò)分析和定量檢測方面還有所欠缺［14-15］，所以可用數(shù)據(jù)源具有一定的局限性和一定的片面性，研究結(jié)果有待進一步探討。