磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯導(dǎo)致小鼠神經(jīng)毒性結(jié)局的潛在靶點(diǎn)研究

朱亭，嚴(yán)驍，鄒忠杰，王美歡，唐斌，許榕發(fā)，鄭晶,*，麥碧嫻，于云江

1. 中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，有機(jī)地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640 2. 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510655 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 4. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006

近年來隨著各國(guó)對(duì)溴系阻燃劑的逐步禁用和淘汰，有機(jī)磷系阻燃劑(organophosphate flame retardants, OPFRs)作為替代品其生產(chǎn)量和使用量快速增長(zhǎng)[1]。磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate, TDCPP)是目前使用量最大的OPFRs之一，被廣泛用于家具、兒童塑料玩具和汽車的內(nèi)飾中[1-2]。作為添加型助劑，TDCPP以非化學(xué)結(jié)合的方式添加到材料中[3]，使用過程中極易釋放到環(huán)境中，研究顯示，在世界各地的大氣、室內(nèi)灰塵、飲用水和生物體樣本中，以及電腦和手機(jī)等電子設(shè)備表面均檢測(cè)出一定濃度的TDCPP[4-6]，生活環(huán)境中的高檢出率增加了人體暴露風(fēng)險(xiǎn)，TDCPP在人體尿液、血液和頭發(fā)等樣品中也被廣泛檢出[7-8]。多項(xiàng)研究證實(shí)，TDCPP可能具有神經(jīng)毒性、生殖發(fā)育毒性、內(nèi)分泌干擾毒性和致癌性等[2,9-10]。由于TDCPP與具有較強(qiáng)神經(jīng)毒性的有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphate pesticides, OPs)氯吡硫磷(chlorpyrifos, CPF)結(jié)構(gòu)相似，其潛在的神經(jīng)毒性尤其值得關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，TDCPP能改變PC12細(xì)胞的神經(jīng)元分化，從而影響神經(jīng)發(fā)育[11]；此外，TDCPP能下調(diào)成年斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)以及破壞神經(jīng)元功能，引起神經(jīng)毒性[2]；也有研究表明，TDCPP引起大鼠腦組織氧化損傷和炎癥反應(yīng)[12]。然而目前關(guān)于TDCPP對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)毒性及其作用機(jī)制的相關(guān)研究依然很缺乏。

代謝組學(xué)是一種研究生物體液或組織中的小分子代謝物整體變化情況的組學(xué)分析方法[13]。利用代謝組學(xué)尋找生物效應(yīng)標(biāo)志物可以明確環(huán)境污染物對(duì)生物代謝途徑的影響，為揭示毒性機(jī)制提供新思路。血液運(yùn)輸是生物體內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的主要方式，因此血液代謝組學(xué)在機(jī)體損傷和疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物篩選上也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前，已有不少研究利用血液代謝組學(xué)探討神經(jīng)功能改變或帕金森病(Parkinson’s disease, PD)[14]、阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)[15]和重度抑郁癥(major depressive disorder, MDD)[16]等神經(jīng)疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。此外，也有研究通過血液代謝組學(xué)探討空氣污染與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)[17]。

本研究使用基于1H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合腦組織神經(jīng)因子基因表達(dá)量分析了TDCPP對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的潛在毒性作用，篩選早期毒性標(biāo)志物，為TDCPP的污染防治和毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

TDCPP(純度>95%，J&K Scientific百靈威科技，中國(guó))；SV Total RNA Isolation Kit試劑盒(Promega公司，美國(guó))；PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMKit試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成生物工程研究所；氘水(D2O)、Na2HPO4、NaH2PO4購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

NanoDrop One微量核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，美國(guó))；高速冷凍離心機(jī)5424R(Eppendorf公司，德國(guó))；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，奧地利)。AVANCE Ⅲ 500 MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀(Bruker公司，瑞士)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、染毒及樣品采集

4周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠16只，體質(zhì)量15～18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院SPF級(jí)動(dòng)物房中，保持12 h/12 h的日/夜光照循環(huán)，室內(nèi)溫度20～24 ℃，濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水和攝食。將小鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組(給予等體積的玉米油)和TDCPP染毒組(300 mg·kg-1·d-1)，每組8只。染毒方式為灌胃染毒，灌胃體積0.1 mL，每日灌胃1次，連續(xù)染毒35 d。每3 d準(zhǔn)確稱取并記錄小鼠體質(zhì)量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道的雄性小鼠經(jīng)口攝入TDCPP的LD50為2 670 mg·kg-1[18]，本研究所選用劑量約為1/10 LD50。

末次染毒24 h后，使用3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g)腹腔注射麻醉動(dòng)物，待小鼠翻正反射消失且無(wú)疼痛反應(yīng)后，用眼眶靜脈取血法采集血液樣品，全血室溫靜置30 min后3 500 r·min-1離心30 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存。隨后將小鼠脫頸椎處死，取全腦在冰上分離大腦皮層，稱量質(zhì)量后放入樣品凍存管，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 神經(jīng)炎癥關(guān)鍵基因表達(dá)的檢測(cè)

將小鼠大腦皮層組織在液氮中研磨后提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)的基因包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(Ntf3)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-22，-23(fgf-22、fgf-23)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。設(shè)計(jì)引物序列如表1所示，采用20 μL體系，每個(gè)樣本進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

表1 qPCR基因引物序列Table 1 Gene primer sequences for qPCR

1.4 5-HT含量和AChE活性檢測(cè)

小鼠大腦皮層中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，AChE活性采用化學(xué)比色法，均使用南京建成試劑盒測(cè)定。

1.5 血清樣品處理

小鼠血清室溫解凍，混勻后取200 μL加至5 mm的NMR測(cè)試管中，再加入150 μL磷酸緩沖液(含0.2 mol·L-1Na2HPO4和0.2 mol·L-1NaH2PO4，pH 7.4)和150 μL D2O，振蕩混勻，待上機(jī)測(cè)試。

1.6 1H-NMR測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

小鼠血清樣品的1H-NMR試驗(yàn)在500 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)溫度為24.85℃；采用Carr-Purcell-Meibom-Gill(CPMG)脈沖序列抑制血清中蛋白質(zhì)及脂蛋白較寬的共振信號(hào)，總回波時(shí)間2nτ=100 ms，弛豫延遲時(shí)間4 s，采樣時(shí)間3.28 s。

采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅里葉變換。運(yùn)用軟件MestReNova 6.1(Mestrelab Research S.L，Santiago de Compostela，西班牙)對(duì)所獲譜圖進(jìn)行手動(dòng)相位和基線校正后，參照乳酸的甲基共振雙重峰(δ 1.33)進(jìn)行定標(biāo)。切除δ 4.68～5.22范圍內(nèi)的譜圖，在δ 0.5～9.5區(qū)域按δ 0.01等間隔分段積分，對(duì)各分段積分值進(jìn)行歸一化處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及通路分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間差異使用單因素方差分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異。歸一化的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)使用SIMCA-P 12.0(Umetrics AB，Umea，瑞典)進(jìn)行基于多變量統(tǒng)計(jì)的模式識(shí)別分析，經(jīng)Pareto標(biāo)度化預(yù)處理后，進(jìn)一步進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。根據(jù)變量重要性因子(VIP值)>1來篩選潛在特征代謝物，并進(jìn)行t檢驗(yàn)獲得差異代謝物，顯著性水平設(shè)為P<0.05。用MetaboAnalyst在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.Metaboanalyst.ca)對(duì)差異代謝物進(jìn)行功能分析和通路定位，尋找顯著影響的關(guān)鍵代謝通路。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠一般體征

小鼠在研究過程中體質(zhì)量變化如圖1所示。試驗(yàn)期間對(duì)照組和TDCPP染毒組小鼠體質(zhì)量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。TDCPP染毒組小鼠在研究過程中未出現(xiàn)肉眼可見畸變或行為異常。染毒35 d后，對(duì)照組與TDCPP染毒組小鼠體質(zhì)量分別為(25.55±0.61) g和(23.56±1.26) g。

圖1 對(duì)照組與磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)染毒組小鼠體質(zhì)量Fig. 1 Body mass of mice from control group and tris (1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCPP) exposed group

2.2 大腦皮層5-HT含量及AChE活性

5-HT和AChE作為大腦中調(diào)節(jié)活動(dòng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵性酶，是神經(jīng)系統(tǒng)功能變化的重要標(biāo)志物，常用于污染物神經(jīng)毒性評(píng)價(jià)[19-20]。如圖2所示，經(jīng)TDCPP持續(xù)染毒35 d后，TDCPP染毒組與對(duì)照組小鼠大腦皮層5-HT含量和AChE活性沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 小鼠大腦皮層5-HT含量和AChE活性Fig. 2 Concentration of 5-HT and activity of AChE in mice cerebral cortex

2.3 大腦皮層神經(jīng)毒性相關(guān)基因表達(dá)

促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Ntf3、GDNF、fgf-22和fgf-23，以及一氧化氮合酶iNOS在大腦皮層中mRNA相對(duì)表達(dá)量如圖3所示。研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)TDCPP持續(xù)染毒35 d后，TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和GDNF的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，其表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.6倍、4.1倍、2.9倍、1.3倍和2.0倍。而Ntf3的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，其表達(dá)水平僅為對(duì)照組的53%。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子fgf-22和fgf-23的基因表達(dá)水平在對(duì)照組與TDCPP染毒組小鼠之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖3 小鼠大腦皮層神經(jīng)毒性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量注：*P<0.05、**P<0.01，與對(duì)照組相比。Fig. 3 Relative expression of genes for nervous toxic effect in mice cerebral cortexNote: *P<0.05, ** P<0.01, compared with control group.

2.4 小鼠代謝表型的改變

采用OPLS-DA研究對(duì)照組與TDCPP染毒組小鼠的代謝物圖譜差異，結(jié)果如圖4(a)所示。TDCPP染毒組小鼠血清中的代謝物與對(duì)照組在PC1維度上完全區(qū)分開，表明TDCPP染毒后小鼠機(jī)體的生理狀態(tài)和物質(zhì)代謝發(fā)生了明顯變化。同時(shí)，采用置換檢驗(yàn)(permutation test)驗(yàn)證OPLS-DA模型的過擬合程度和可靠性(圖4(b))。OPLS-DA的主要參數(shù)為：R2X=0.83，R2Y=0.97，Q2=0.88。模型置換得到的R2、Q2點(diǎn)均低于原始點(diǎn)，且Q2回歸線與縱坐標(biāo)軸的截距均小于零，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況，且如有新樣本加入對(duì)原有分布情況影響不大，可以充分解釋兩組樣本間的差異。

圖4 小鼠血清1H-NMR譜的OPLS-DA得分圖(a)和置換檢驗(yàn)驗(yàn)證圖(b)Fig. 4 OPLS-DA score plot (a) and permutation test (b) derived from 1H-NMR spectra of mice serum

2.5 TDCPP誘導(dǎo)的差異代謝物與代謝通路分析

采用OPLS-DA模型，篩選同時(shí)滿足VIP值>1和和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P<0.05的代謝物作為TDCPP誘導(dǎo)的差異代謝物(表2)。結(jié)果顯示，小鼠在TDCPP持續(xù)染毒35 d后，血清中多種代謝物水平發(fā)生顯著變化，包括氨基酸、生物堿、羧酸、糖類、生長(zhǎng)因子和脂質(zhì)。進(jìn)一步應(yīng)用MetaboAnalyst對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析(Pathway Analysis)，結(jié)果如表3所示。在TDCPP顯著影響的小鼠關(guān)鍵代謝通路中，3條通路與氨基酸代謝相關(guān)，2條通路與糖代謝相關(guān)。根據(jù)差異代謝通路繪制TDCPP誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)代謝紊亂的通路圖如圖5所示。

圖5 TDCPP誘導(dǎo)小鼠代謝紊亂的代謝通路圖注：紅色和綠色標(biāo)記分別表示TDCPP染毒后小鼠血清中上調(diào)和下調(diào)的代謝物。Fig. 5 TDCPP induced metabolic pathway disturbance in miceNote: Metabolite names marked with red and green represent up-regulated and down-regulated in mice serum after TDCPP exposure, respectively.

表2 對(duì)照組與TDCPP染毒組小鼠血清中的差異代謝物Table 2 Potential biomarkers in mice serum between control group and TDCPP exposed group

表3 與TDCPP暴露相關(guān)的關(guān)鍵代謝通路Table 3 Key metabolism pathways related to TDCPP exposure

3 討論(Discussion)

廣泛使用的有機(jī)磷系阻燃劑TDCPP在多種環(huán)境介質(zhì)和生物體中被檢出且具有較高濃度，其潛在的慢性神經(jīng)毒性引起研究者們的高度關(guān)注。研究顯示，TDCPP能夠引起禽類步態(tài)模式和翼瓣反射等行為學(xué)異常[21]，改變斑馬魚孵化率、存活率和游動(dòng)速率并誘導(dǎo)自噬[22]，并且影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力[12]。代謝組學(xué)是研究機(jī)體代謝產(chǎn)物變化的一種系統(tǒng)生物學(xué)方法，可通過揭示代謝產(chǎn)物變化規(guī)律來解釋機(jī)體物質(zhì)代謝途徑改變。本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)研究TDCPP對(duì)機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，并結(jié)合神經(jīng)毒性指標(biāo)相互驗(yàn)證和補(bǔ)充，為探索TDCPP的潛在神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供依據(jù)。

AChE是重要的中樞神經(jīng)酶，作為生物標(biāo)志物常用來評(píng)估環(huán)境物質(zhì)的神經(jīng)毒性。AChE活性受到抑制也是OPs的常見神經(jīng)毒性作用機(jī)制之一。5-HT作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)和外周調(diào)質(zhì)，參與多項(xiàng)重要的生理和病理過程。本研究中小鼠經(jīng)300 mg·kg-1·d-1的TDCPP持續(xù)染毒35 d后，未觀察到腦組織中AChE活性和5-HT含量的顯著改變(P>0.05)。以往研究也獲得了類似的結(jié)果，鰷魚[23]和斑馬魚[2]經(jīng)急性或慢性TDCPP暴露后，大腦中AChE活性和神經(jīng)遞質(zhì)水平均沒有顯著變化。提示與CPF等OPs不同，TDCPP可能并不是典型的乙酰膽堿酯酶抑制毒物，或許其對(duì)生物體的神經(jīng)毒性存在其他作用機(jī)制[2,23]。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的抵御感染和損傷的復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)，長(zhǎng)期的慢性炎癥反應(yīng)可誘發(fā)或加重重度抑郁障礙(MDD)、阿爾茲海默癥(AD)、帕金森病(PD)等神經(jīng)退行性疾病的病變[17,24-25]。TNF-α、IL-6和IL-1β是3類重要的促炎性細(xì)胞因子，iNOS則是一類可被促炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮(NO)合酶，TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS均在慢性神經(jīng)炎癥發(fā)展過程中積聚，對(duì)神經(jīng)元造成損傷，其在腦組織中的表達(dá)量可反映機(jī)體炎癥水平和組織的損傷程度[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，TDCPP染毒組小鼠大腦皮層中TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，提示TDCPP暴露可能誘導(dǎo)小鼠腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，而iNOS基因的過度表達(dá)可導(dǎo)致NO增加，進(jìn)一步加重腦組織損傷。NTF、FGF和GDNF是3類重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、減輕神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)損傷的修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[28]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TDCPP染毒組小鼠大腦皮層中GDNF基因表達(dá)量顯著升高，Ntf3基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，fgf-22和fgf-23基因表達(dá)量無(wú)顯著改變(P>0.05)，提示TDCPP對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)錄水平的影響可能具有選擇性。相似的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因表達(dá)水平的改變也在TDCPP慢性暴露的鰷魚腦組織中被報(bào)道[23]。研究結(jié)果顯示，神經(jīng)炎癥與神經(jīng)損傷可能在TDCPP誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)毒性中發(fā)揮作用。

血清代謝組學(xué)研究顯示，TDCPP暴露顯著干擾了小鼠的代謝過程，主要表現(xiàn)為氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝和糖類代謝的改變。多項(xiàng)代謝組學(xué)研究均證實(shí)，谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸等氨基酸和葡萄糖是包括MDD、PD在內(nèi)的等多種神經(jīng)性疾病的生物標(biāo)志物，在患者血清中含量發(fā)生顯著改變[29]。異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生具有重要作用，且與5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的含量關(guān)系密切，其缺乏可能引發(fā)抑郁[30]。谷氨酸作為興奮性中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)，過量可引發(fā)“興奮性毒性”，導(dǎo)致受體過度激活和iNOS酶活性增加，破壞神經(jīng)元完整性[31]。甘氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中谷氨酸及其N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)節(jié)劑，過度積累也和抑郁癥的病理生理有關(guān)[29]。肌酸是磷酸肌酸前體，磷酸肌酸作為高能磷酸化合物，能刺激突觸囊泡對(duì)谷氨酸的攝取和過度釋放，誘導(dǎo)神經(jīng)毒性[32]。在本研究中，TDCPP染毒組小鼠血清中異亮氨酸顯著降低，谷氨酸、甘氨酸、肌酸和β-葡萄糖顯著升高(P<0.05)，表明TDCPP可能通過影響氨基酸代謝中神經(jīng)功能相關(guān)因子，誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)，增加神經(jīng)性疾病患病風(fēng)險(xiǎn)。

Sethi等[33]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)、膽堿和肌醇等脂質(zhì)代謝相關(guān)因子是精神分裂癥患者血清中主要差異代謝物。TDCPP染毒組小鼠血清中脂質(zhì)水平顯著升高(P<0.05)，提示脂質(zhì)代謝可能受到干擾。在脂質(zhì)代謝中，磷酸膽堿、鯊肌醇和甜菜堿均發(fā)揮重要作用。磷酸膽堿是細(xì)胞膜磷脂的前體并且與紋狀體脂質(zhì)周轉(zhuǎn)相關(guān)[34]，膽堿代謝的改變引起神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂[29]；鯊肌醇不僅能代謝脂肪和膽固醇，還能減少大腦中β-淀粉樣蛋白濃度和斑塊損傷，改善大腦學(xué)習(xí)障礙和認(rèn)知缺陷[35]；甜菜堿能通過提高脂肪分解酶的活性促進(jìn)脂肪分解，并且能降低血漿中的半胱氨酸濃度，從而減輕由半胱氨酸引起的神經(jīng)混亂癥狀如抑郁、沮喪等[36]。本研究結(jié)果中經(jīng)TDCPP染毒的小鼠血清中磷酸膽堿和鯊肌醇水平顯著降低(P<0.05)而甜菜堿水平顯著升高(P<0.01)，表明TDCPP染毒引起小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝失衡，可能導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)紊亂和障礙。

綜上所述，小鼠經(jīng)300 mg·kg-1·d-1的TDCPP持續(xù)染毒35 d對(duì)腦組織中AChE活性和5-HT含量無(wú)顯著影響，但可引起小鼠大腦皮層中神經(jīng)炎癥和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)基因表達(dá)量改變，成為大腦神經(jīng)炎癥發(fā)生和神經(jīng)元損傷的潛在誘因；同時(shí)TDCPP持續(xù)染毒顯著干擾了小鼠的氨基酸代謝、糖類代謝和脂質(zhì)代謝，引起異亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸和葡萄糖等多種神經(jīng)性疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的改變，進(jìn)一步影響神經(jīng)系統(tǒng)功能，增加疾病風(fēng)險(xiǎn)。

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