用Biolog-ECO板分析動(dòng)物籠舍環(huán)境微生物

王興金 薩家祺 李冠惠 黎繪宏 成世清

(廣州動(dòng)物園，廣州市野生動(dòng)物研究中心，廣州，510070)

動(dòng)物的生活環(huán)境，包括微生物環(huán)境，與動(dòng)物健康的關(guān)系非常密切，不僅因?yàn)橹虏∥⑸镂：?dòng)物健康，環(huán)境微生物群落還可能通過影響動(dòng)物腸道菌群而對(duì)動(dòng)物健康產(chǎn)生間接影響。研究表明，圈養(yǎng)和野生大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)腸道微生物群落存在一定差異，與其棲息環(huán)境、食物資源、活動(dòng)節(jié)律等的影響密切相關(guān)[1]。為探討動(dòng)物籠舍環(huán)境微生物，分別從廣州動(dòng)物園靈長(zhǎng)類(Primates)、爬行類(Reptilia)動(dòng)物籠舍收集了15個(gè)環(huán)境樣本，并采用Biolog-Eco方法進(jìn)行分析，以期了解動(dòng)物園動(dòng)物籠舍環(huán)境微生物活性及其影響因素，為更好地養(yǎng)護(hù)野生動(dòng)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品及處理

樣本采集和處理：在動(dòng)物籠舍的四周及中央部位無菌采集5處墊材樣本，共約10 g，按m(樣本)∶V(滅菌蒸餾水)=1 g∶9 mL的比例處理樣品后，置恒溫振蕩箱中，4℃振蕩1 h，取上清液用滅菌蒸餾水稀釋10倍后接種ECO板，150 μL/孔，37℃培養(yǎng)，每24 h分別讀取OD590和OD750值。樣本來源見表1。

表1 動(dòng)物籠舍墊材樣本來源

1.2 數(shù)據(jù)分析

微生物代謝活性用平均顏色變化率(average well color development，AWCD，量符號(hào)為DAWC)表示，其計(jì)算方法為：

DAWC=∑(C-R)/n

式中：C為每個(gè)碳源孔在590 nm下的吸光度值減去750 nm下的吸光度值；R為對(duì)照孔的吸光度值；n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。當(dāng)C-R的數(shù)值小于0.06時(shí)矯正為0處理[2-3]。

對(duì)得到的AWCD數(shù)據(jù)分別采用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析、vegan v2.5-6進(jìn)行主成分分析、flashClust v1.01-2進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣本對(duì)ECO板碳源的利用情況

AWCD值反映了樣本中微生物的代謝活性，即對(duì)碳源的利用能力。15個(gè)樣本中微生物利用全部31種碳源的AWCD變化曲線如圖1A所示。大部分樣本在24—48 h的AWCD曲線斜率最大，此前、后曲線斜率均較低，在96—120 h基本穩(wěn)定。但來自墊材C的S11、S15、S13樣本的AWCD曲線斜率在24 h內(nèi)最大，此后變化趨于平緩；S1的AWCD絕對(duì)值雖然較低，但上升趨勢(shì)明顯。

選擇培養(yǎng)96 h的各樣本的AWCD值進(jìn)行方差分析，結(jié)果15個(gè)樣品對(duì)碳源的利用存在極顯著的差異(P<0.01，表2)；對(duì)各樣本的AWCD值進(jìn)行多重比較(multiple comparisons)，發(fā)現(xiàn)S11除與S1沒有顯著差異(P>0.05)外，均極顯著低于其他各樣本(P<0.01)；而S1除了與S3、S9、S11、S13、S15無顯著差異(P>0.05)外，均極顯著低于其他樣本(P<0.01，表3)。從絕對(duì)數(shù)值看，AWCD值排在最低的5個(gè)樣本依次為S11、S1、S15、S3、S13，其中S11、S13、S15均為墊材C，S1、S3為墊材A。

表2 動(dòng)物籠舍墊材樣本對(duì)碳源利用的AWCD的方差分析結(jié)果

為了進(jìn)一步分析各樣本微生物對(duì)ECO板中不同類型碳源的利用情況，將ECO板的31種碳源分為6大類[4]，分別計(jì)算各樣本利用每類碳源的AWCD值，并進(jìn)行方差分析(表2)。結(jié)果，15個(gè)樣本對(duì)碳水化合物、氨基酸、胺類等3類碳源的利用存在極顯著差異(P<0.01)，而對(duì)羧酸、多聚物、酚酸類等碳源的利用差異不顯著(P>0.05)。

對(duì)存在差異的碳水化合物、氨基酸、胺類3類碳源利用的AWCD值進(jìn)行樣本間多重比較(表3)。結(jié)果，在對(duì)碳水化合物的利用上，S11除與S1、S9、S15無顯著差異(P>0.05)外，極顯著低于其他各樣本(P<0.01)，S15的AWCD值也極顯著低于S4、S6、S14(P<0.01)；在對(duì)氨基酸的利用上，S1極顯著低于S4、S5、S7、S10、S12、S14(P<0.01)，S11極顯著低于S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14(P<0.01)，S13極顯著低于S14(P<0.01)；對(duì)胺類的利用上，S1極顯著低于S2、S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14、S15(P<0.01)。整體上，S11、S1、S15、S13對(duì)碳源的利用活性較低，除S1外其他3個(gè)都是墊材C樣本。

表3 動(dòng)物籠舍墊材樣本對(duì)碳源利用的AWCD的post hoc檢驗(yàn)結(jié)果(僅顯示P<0.05)

存在樣本間差異的碳水化合物、氨基酸、胺類3類碳源的AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線顯示：對(duì)碳水化合物的利用，來自墊材C的S11、S13、S15樣本在24 h內(nèi)曲線斜率最大，此后較明顯地變平緩或下降，而其他樣本在48 h前的曲線斜率均較大(圖1B)；對(duì)氨基酸的利用，S11、S13、S15樣本的曲線斜率在24 h內(nèi)最大，而其他樣本的曲線斜率最大值出現(xiàn)在24—48 h，且曲線向上的趨勢(shì)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)(圖1C)；對(duì)胺類的利用，S11和S15的曲線斜率在24 h達(dá)到最大值，S13則在24—48 h達(dá)到最大值，但隨后的曲線斜率均下降較快，而其他樣本的曲線向上的持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，S1的絕對(duì)值雖然較低，卻呈現(xiàn)持續(xù)向上的趨勢(shì)(圖1D)。

將培養(yǎng)72、96、120 h AWCD較高的前6個(gè)樣本從高到低進(jìn)行排序(表4)。結(jié)果可見，在對(duì)全部31種碳源利用活性較高的樣本中均出現(xiàn)了S4、S5、S7、S10、S14樣本，此外S2、S12各出現(xiàn)1次。其中，除S7為墊材B外，其余樣本均來自墊材A，而墊材C樣本沒有出現(xiàn)在其中。將碳源分為6大類后，在前述培養(yǎng)時(shí)間段，僅對(duì)酚酸類的利用中出現(xiàn)了1個(gè)墊材C樣本，對(duì)其余5類碳源的利用中均未出現(xiàn)墊材C樣本(即S11、S13、S15)。此外，S1和S3也未出現(xiàn)在表4中。

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間動(dòng)物籠舍墊材對(duì)碳源利用活性排名前6的樣本

2.2 相同環(huán)境樣本AWCD的差異性

在所有15個(gè)樣本中，4個(gè)來自黑猩猩的環(huán)境樣本(S6、S7、S8、S9)各種條件最為一致，即動(dòng)物種類相同、日常管理相同、墊材類型相同。4個(gè)樣本培養(yǎng)96 h后的AWCD僅對(duì)碳水化合物的利用上存在顯著差異(P<0.05)，即S6對(duì)碳水化合物的利用活性顯著高于S9(P<0.05)，其他樣本對(duì)各類碳源的利用均差異不顯著(P>0.05，表5)。提示，在動(dòng)物種類、墊材類型、日常管理方法等條件相似的情況下，環(huán)境微生物活性也比較相似。

表5 黑猩猩籠舍墊材樣本(S6、S7、S8、S9)AWCD的方差分析結(jié)果

2.3 主成分與聚類分析

為進(jìn)一步探究各樣本微生物對(duì)碳源利用的相互關(guān)系，對(duì)培養(yǎng)96 h后的各樣本的AWCD進(jìn)行了主成分分析(圖2)和聚類分析(圖3)。其中，圖2顯示S1與其他樣本存在比較明顯的分異現(xiàn)象，其他樣本間沒有明顯的規(guī)律可循，即動(dòng)物種類之間或籠舍墊材之間沒有明顯的相關(guān)性，聚類分析也得到類似的結(jié)果。

3 討論

Biolog方法是通過微生物對(duì)多種碳底物的不同利用類型來反映微生物群落的功能多樣性[5]，可以直接反映微生物群落的總體活性，在表征細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化的時(shí)空尺度上有顯著的優(yōu)勢(shì)[6-7]，且具有數(shù)據(jù)量大、方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于土壤、水體和環(huán)境等領(lǐng)域[8-9]。其中，生態(tài)板(ecology plate，ECO板)在土壤微生物群落功能多樣性研究中應(yīng)用更為廣泛[4]，也用于動(dòng)物的腸道微生物研究[10]，但在野生動(dòng)物籠舍環(huán)境微生物的研究方面未見報(bào)道。

本研究收集的樣本分別來自5種靈長(zhǎng)動(dòng)物和3種爬行動(dòng)物籠舍的3種不同類型的墊材，采用Biolog-ECO板對(duì)樣本的微生物活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，15個(gè)樣本的微生物活性存在極顯著差異(P<0.01)。為進(jìn)一步分析各樣本中微生物對(duì)ECO板中不同類型碳源的利用情況，將ECO板的31種碳源分為6大類。結(jié)果，15個(gè)樣本中微生物群落的差異主要表現(xiàn)為對(duì)碳水化合物、氨基酸、胺類3類碳源的利用上(P<0.01)，對(duì)羧酸、多聚物、酚酸類的利用差異不顯著(P>0.05)，提示這些動(dòng)物籠舍的環(huán)境微生物群落存在某種相似性。

將動(dòng)物種類、墊材類型、日常管理均一致的來自黑猩猩籠舍的4個(gè)樣本(即S6、S7、S8、S9)單獨(dú)進(jìn)行分析。培養(yǎng)96 h后的AWCD僅S6對(duì)碳水化合物的利用顯著高于S9(P<0.05)，其他樣本對(duì)全部31種碳源的利用，或?qū)⑻荚捶譃?大類后進(jìn)行比較，均差異不顯著(P>0.05)。提示同種動(dòng)物、籠舍環(huán)境相似、日常管理相同，環(huán)境微生物活性也比較一致。

將培養(yǎng)72、96、120 h的AWCD進(jìn)行排序。發(fā)現(xiàn)，AWCD較高的樣本主要來自墊材A，其次為墊料B，而AWCD較低的樣本則主要來自墊材C。此外，來自墊材A的S1和S3的AWCD也較低。考慮到S1和S3取樣時(shí)距離籠舍消毒的時(shí)間較近，推測(cè)消毒是影響環(huán)境微生物活性的重要因素，而墊材的類型相比動(dòng)物種類而言，對(duì)環(huán)境微生物的影響更大，本研究中微生物活性自高到低的墊材類型依次為墊材A、墊材B、墊材C。AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線也說明籠舍內(nèi)墊材類型與環(huán)境微生物活性有關(guān)，來自墊材C的樣本的曲線前期斜率最大，隨后迅速變緩甚至下降；而來自墊材A和墊材B的樣本的AWCD曲線向上的持續(xù)性則更為明顯。

對(duì)全部15個(gè)樣本的AWCD進(jìn)行主成分分析及聚類分析，結(jié)果S1與其他樣本存在比較明顯的分異現(xiàn)象，但其他樣本之間似乎沒有明顯的規(guī)律可循，提示消毒對(duì)S1微生物活性產(chǎn)生了明顯的影響。動(dòng)物籠舍環(huán)境微生物的組成比較復(fù)雜，可能的影響因素較多，有待進(jìn)一步研究。如，奶牛舍沙土墊料的鋪墊時(shí)間、環(huán)境溫度等對(duì)細(xì)菌數(shù)量都有顯著影響[11]。

致謝：承蒙廣東省微生物研究所李安章副研究員給予指導(dǎo)。