基因編輯技術(shù)及其水稻中的發(fā)展和應(yīng)用

任俊 曹躍炫 黃勇 董慧榮 劉慶 王克劍

（中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；#共同第一作者：82101172206@caas.cn；*通訊作者：wangkejian@caas.cn）

水稻是世界上的主要糧食作物之一，全球大約一半以上的人口以大米為主食[1]。然而，傳統(tǒng)育種策略周期長(zhǎng)，人力、物力投入多，嚴(yán)重限制了水稻新品種的開(kāi)發(fā)。序列特異性核酸酶（Sequence specific nucleases,SSNs）的出現(xiàn)則大大加快了育種進(jìn)程，其可以精確地靶向基因組的特定位點(diǎn)。到目前為止，主要的序列特異性核酸酶包括：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases, ZFNs）[2]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）[3]，以及成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat -associated protein，CRISPR/Cas）[4]。科學(xué)家們?cè)趯?duì)細(xì)菌的免疫系統(tǒng)及作用機(jī)理有了較深的認(rèn)識(shí)后，開(kāi)始對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行改造并逐步應(yīng)用到動(dòng)植物上。其中，CRISPR/Cas 系統(tǒng)因其設(shè)計(jì)和構(gòu)建簡(jiǎn)單、成本低、突變效率高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。因此，本文也主要就CRISPR/Cas 系統(tǒng)在水稻中的發(fā)展和應(yīng)用來(lái)進(jìn)行綜述討論。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)介紹

1.1 依賴DSB 的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是普遍存在于古細(xì)菌及原核生物細(xì)菌的一種獲得性免疫機(jī)制[5]，可以在1 個(gè)引導(dǎo)RNA（single guide RNA, sgRNA）的引導(dǎo)下特異性地識(shí)別外源DNA 或RNA，并對(duì)其進(jìn)行切割以達(dá)到沉默外源基因的目的。目前，在水稻中使用最多的是Type II型的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)[6-7]，該系統(tǒng)僅需 1 個(gè) Cas9 蛋白和sgRNA 元件參與，機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單。在sgRNA 的引導(dǎo)下，Cas9 蛋白靶向基因組特定位置，并且其2 個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC 和HNH 分別切割基因組的靶標(biāo)鏈（target strand）和非靶標(biāo)鏈（non-target strand），產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂（Double strand break，DSB），進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源重組（homologous recombination, HR）修復(fù)途徑，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組序列的插入缺失（insertions/deletions, indel）、替換等精準(zhǔn)修飾[8]（圖1a）。然而CRISPR/Cas 系統(tǒng)中靶位點(diǎn)的選取受限于一段短的前間隔臨近基序（Protospacer adjacent motif，PAM）序列[4]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)特異性識(shí)別 3’端一段 NRG（R=A/G））PAM 序列[6,9]。

圖1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)及衍生技術(shù)的工作模式

另一個(gè)使用廣泛的是Type V 型的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)（也叫CRISPR/Cpf1），其特異性識(shí)別5’端連續(xù)2個(gè)或3 個(gè)胸腺嘧啶（T）的 PAM 序列[10-11]。并且與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas12a[12]系統(tǒng)只需在crRNA（CRISPR RNA）引導(dǎo)下即可對(duì)DNA 雙鏈進(jìn)行切割，無(wú)需反式激活crRNA（trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA） 參與；Cpf1 的 crRNA 較 sgRNA 更短，且其蛋白也比Cas9 蛋白更小，有助于構(gòu)建裝載量小和多基因編輯的載體；Cas9 蛋白切割基因組產(chǎn)生平末端，而Cas12a 切割目標(biāo)序列產(chǎn)生粘性末端。Cas9 和Cas12a均是靶向 DNA 序列，而 VI 型CRISPR/Cas 效應(yīng)體Cas13a（亦稱 C2c2）[13]在一個(gè) crRNA 引導(dǎo)下，可以切割與crRNA 互補(bǔ)配對(duì)的RNA 靶標(biāo)。并且C2c2 還具有臨近效應(yīng)（collateral effect），即當(dāng) C2c2 特異性靶向 RNA靶標(biāo)時(shí)，也會(huì)切割臨近的RNA 單鏈。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)靶向基因組受限于一段短的PAM 序列，通過(guò)開(kāi)發(fā)SpCas9 蛋白的同源蛋白，例如SaCas9（NNGRRT PAM）[14]、ScCas9（NNG PAM）[15]；以及人工改造變體，如 VQR（NGA PAM）[16-17]、VRER（NGCG PAM）[17]、xCas9 （NG, GAA 和 GTA PAM）[18-19]、SpCas9-NG（NG PAM）[18,20-21]、SpG（NG PAM）[22-23]等，CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯范圍獲得了極大地拓展，甚至幾乎沒(méi)有PAM 序列的限制，如 SpRY 變體[22-23]。

1.2 不依賴DSB 的CRISPR/Cas 系統(tǒng)

1.2.1 堿基編輯器

除DSB 介導(dǎo)的基因編輯外，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)發(fā)展起來(lái)的堿基編輯技術(shù)成為動(dòng)植物精準(zhǔn)基因修飾的重要支撐。目前水稻中常用的堿基編輯系統(tǒng)主要有兩類：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor, CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor, ABE）（圖 1b）。這兩類堿基編輯系統(tǒng)利用胞嘧啶脫氨酶或人工進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶與Cas9 缺口酶（nicking Cas9, nCas9）進(jìn)行融合，融合蛋白在sgRNA 介導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的堿基編輯，最終可以分別實(shí)現(xiàn)C-T（G-A）或A-G（TC）的堿基轉(zhuǎn)換[24-31]。雖然CBEs 和ABEs 能夠精確的實(shí)現(xiàn)基因組編輯，但是，這兩種堿基編輯器只能實(shí)現(xiàn)嘧啶對(duì)嘧啶、嘌呤對(duì)嘌呤的轉(zhuǎn)換，即C-T、T-C、G-A 和A-G的改變，而不能實(shí)現(xiàn)堿基之間的顛換，如C-G、C-A、AT 和A-C 的轉(zhuǎn)變。最近，有研究報(bào)道了一種能同時(shí)編輯C 和A 兩種堿基的雙堿基編輯器，它是由nCas9（D10A）與胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶融合而成，能同時(shí)使C-G 和A-T 轉(zhuǎn)變?yōu)門-A 和G-C[32-33]。雙堿基編輯器的開(kāi)發(fā)能夠進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的堿基編輯，解決了同時(shí)表達(dá)兩個(gè)單堿基編輯器效率低的問(wèn)題，也進(jìn)一步拓寬了堿基編輯器的功能。

1.2.2 引導(dǎo)編輯器

為了實(shí)現(xiàn)堿基間的任意顛換和短片段的精準(zhǔn)插入和缺失，ANZALONE 等[34]開(kāi)發(fā)了引導(dǎo)編輯器（prime editors，Pes），可以實(shí)現(xiàn)全部12 種類別的堿基替換和小片段的插入缺失突變。PEs 系統(tǒng)由nSpCas9（H840A）、pegRNA（prime editing extended guide RNA）和逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV（moloney murine leukemia virus reverse transcriptase）組成，其中 pegRNA 是在 gRNA 序列的 3’末端添加引物結(jié)合位點(diǎn)（prime binding sites，PBS）和攜帶編輯信息的逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription, RT）模板（圖1c）。PEs 系統(tǒng)的主要工作機(jī)制是：nSpCas9（H840A）與工程化改造的逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 的融合蛋白在pegRNA 的引導(dǎo)下在非靶標(biāo)鏈上引入切口，切口的末端與pegRNA 上的 PBS 結(jié)合并在與 nSpCas9（H840A）蛋白融合表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將pegRNA 的RT 模板攜帶的編輯信息直接反轉(zhuǎn)錄到目標(biāo)DNA 鏈上，隨后在生物體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制的作用下，將編輯信息引入基因組上。nSpCas9 在非編輯鏈上引入第二切口，誘導(dǎo)細(xì)胞以編輯鏈為模板對(duì)非編輯鏈進(jìn)行修復(fù)，可以進(jìn)一步提高對(duì)靶位點(diǎn)的精準(zhǔn)編輯效率。目前，PEs 已經(jīng)被成功應(yīng)用于水稻中[35-38]，但是由于PEs 的編輯效率受到細(xì)胞類型、Cas9 活性以及 pegRNA 等多種因素的影響[39-42]，故其在植物中的編輯效率偏低且不穩(wěn)定，但是PEs 可以實(shí)現(xiàn)其他編輯工具無(wú)法實(shí)現(xiàn)的多種精準(zhǔn)突變，因此需要進(jìn)一步的優(yōu)化和探索PEs 系統(tǒng)。

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在水稻品種改良和分子育種中的應(yīng)用

多種基因編輯體系，包括堿基編輯器、引導(dǎo)編輯等的相繼建立，為作物功能基因組研究和品種改良提供了強(qiáng)大的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，可以迅速地在1~2 代內(nèi)獲得穩(wěn)定的性狀改良的水稻材料（圖2）。

圖2 傳統(tǒng)育種與基因編輯育種技術(shù)比較

2.1 提高水稻產(chǎn)量

水稻是100 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)30 多億人的主要糧食[43]。隨著世界人口的急劇增長(zhǎng)和生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，全球糧食的可持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)面臨巨大的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提高水稻產(chǎn)量，保障糧食安全刻不容緩。水稻產(chǎn)量主要由有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重決定。近年來(lái)利用基因編輯技術(shù)已經(jīng)改善了大量與產(chǎn)量性狀相關(guān)的調(diào)控基因。

近幾十年來(lái)，水稻中的主效粒形數(shù)量性狀基因（quantitative trait locus，QTL）已經(jīng)相繼被克隆[44-53]，并且通過(guò)基因編輯技術(shù)靶向這些QTLs 對(duì)水稻粒形產(chǎn)生了一定影響。例如，通過(guò)CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的多重基因組編輯技術(shù)，同時(shí)編輯日本晴中2 個(gè)粒形調(diào)控因子GS3和GL3.1，gs3 突變體的T1代種子籽粒較細(xì)，而gs3gl3.1雙突變體產(chǎn)生的籽粒較大[54]。此外，對(duì)另一個(gè)調(diào)控水稻千粒重的基因TGW6 進(jìn)行敲除，獲得的純合突變株系的種子粒長(zhǎng)粒重增加，水稻千粒重提高約5%[48]。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)靶向每穗粒數(shù)主效基因OsGn1a，其純和突變株系的每穗粒數(shù)增加，單株產(chǎn)量增加[7]。在OsTB1 的多種突變類型中，TGTG 插入的株系，株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)均比野生型十分顯著的增加，同時(shí)莖稈變粗而且抗折[55]。LV 等[56]利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除OsPAO5，顯著增加了水稻籽粒大小、提高水稻產(chǎn)量，同時(shí)也顯著地促進(jìn)了水稻中胚軸伸長(zhǎng)，可以促進(jìn)水稻直播出苗。MIAO 等[57]利用CRISPR/Cas9 靶向一個(gè)影響粒型和株型的關(guān)鍵調(diào)控因子miR396。在其所有的突變體中，mir396e/f 突變體的籽粒長(zhǎng)度和寬度明顯增加，穗長(zhǎng)和穗分支數(shù)目增加。并且mir396e/f 突變體還可以提高植物體的耐低氮逆境脅迫，在低氮條件下仍表現(xiàn)出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的特性。

在干旱脅迫下，脫落酸（ABA）可以促進(jìn)根系的生長(zhǎng)，但是整體上ABA 對(duì)植物的生長(zhǎng)具有抑制作用[58]。利用CRISPR/Cas9 靶向ABA 受體蛋白家族成員PYL[pyrabactin resistance 1（PYR1）/PYR1-like]發(fā)現(xiàn) pyl1/4/6 突變體在自然水田條件下水稻長(zhǎng)勢(shì)最好，并且產(chǎn)量提高，同時(shí)保持正常的種子休眠[59]。

2.2 改善稻米品質(zhì)

稻米品質(zhì)主要包括加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮和食用品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和衛(wèi)生品質(zhì)等幾個(gè)方面[60]。其中稻米外觀品質(zhì)在很大程度上影響了市場(chǎng)的接受度，稻米堊白是衡量稻米品質(zhì)的一個(gè)重要性狀，堊白率高的稻米會(huì)嚴(yán)重影響其外觀品質(zhì)和人們的食用烹調(diào)，因此，堊白率高的水稻品種在市場(chǎng)的接受度很小。近年來(lái)，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)生成的純合gs9 （Grain Shape Gene on Chromosome 9）無(wú)義突變體的籽粒堊白率顯著降低，并且粒形較野生型細(xì)長(zhǎng)，但是千粒重與野生型沒(méi)有明顯差異[61]。

水稻食用和蒸煮品質(zhì)（eating and cooking quality，ECQ）主要由直鏈淀粉含量（amylose content，AC）、凝膠稠度和糊化溫度決定，其中AC 是ECQ 最重要的決定因素[62]。蠟質(zhì)（Waxy、Wx）基因決定了水稻 AC 含量，該基因編碼顆粒結(jié)合淀粉合成酶I（granule-bound starch synthase I），控制胚乳中直鏈淀粉的合成[63-64]。近幾十年來(lái)，在Wx 位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的多個(gè)等位基因（如Wxlv、Wxa、Wxb、Wxin、Wxop/hp、Wxmp、Wxmq、Wxmw和 wx）在不同程度上影響了水稻AC 含量，并進(jìn)一步增加了消費(fèi)者的選擇。FEI 等[65]用 CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)水稻W(wǎng)x 基因進(jìn)行敲除，培育出了優(yōu)良的糯稻品種，其AC 含量降到僅為2.6%~3.2%，而稻米其他品質(zhì)無(wú)明顯變化。除了直接敲除Wx 基因改良稻米品質(zhì)外，也有多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)采用了不同的策略編輯Wx 基因，獲得了不同AC 含量的新軟米種質(zhì)資源。XU 等[66]利用CBE 單堿基編輯器對(duì)水稻品種日本晴Wxb基因N 端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行功能位點(diǎn)突變，獲得了AC 含量分布在1.4%~11.9%的水稻新種質(zhì)。HUANG 等[67]利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì) Wxb啟動(dòng)子TATA box 區(qū)域進(jìn)行編輯，AC 含量從野生型的16.80%下降到10.66%~14.85%。ZENG 等[68]則利用CRISPR/Cas9 對(duì)Wxa啟動(dòng)子區(qū)及其5’UTR 內(nèi)含子剪接點(diǎn)進(jìn)行編輯，AC 含量分別下降到 17.0%~18.0%和 9.0%~10.0%。

香稻品種因其獨(dú)特的香氣和口感而越來(lái)越受歡迎。香稻中香味的主要成分是2-乙?；?1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP），而它的合成前體4-氨基丁醛主要被OsBADH2 蛋白氧化失活[69]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得OsBADH2 的功能缺失突變體，其2AP 積累增加，水稻香味增強(qiáng)[70-71]。通過(guò)編輯OsBADH2 外顯子和內(nèi)含子交接處而引起外顯子的跳躍，從而導(dǎo)致了其閱讀框的移位也得到了類似的結(jié)果[72]。

2.3 增強(qiáng)對(duì)生物脅迫的抗性

植物病原菌和害蟲對(duì)糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅，據(jù)估計(jì)，它們每年造成20%~40%的全球糧食生產(chǎn)損失[73]。利用CRISPR/Cas 技術(shù)敲除病蟲害易感基因可以減少病蟲害對(duì)水稻發(fā)育和產(chǎn)量的影響。

水稻白葉枯病和稻瘟病是稻作生產(chǎn)中的主要病害，會(huì)直接影響水稻產(chǎn)量，一般減產(chǎn)10%~20%，嚴(yán)重的達(dá)40%~50%，局部田塊甚至顆粒無(wú)收[74]。水稻白葉枯病是由水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起的。目前對(duì)白葉枯病具有廣譜抗性的水稻品種就是通過(guò)編輯SWEET 基因啟動(dòng)子區(qū)域降低其表達(dá)而獲得的[75]。相同的策略也編輯了白葉枯病抗性基因Xa13，從而提高了水稻白葉枯病抗性[76]。稻瘟病是由稻瘟病原菌引起的。WANG 等[77]在水稻中靶向OsERF922基因，提高了水稻對(duì)稻瘟病的抵抗能力。同樣，通過(guò)CRISPR/Cas9 靶向誘變獲得的 OsSEC3A、Pi21 基因的突變體植株，對(duì)稻瘟病的抗性也得到一定增強(qiáng)[78-79]。

相較于水稻抗病種質(zhì)的突破性研究進(jìn)展，基因編輯技術(shù)在抗蟲方面的研究進(jìn)展較為緩慢，這可能與水稻害蟲抗性機(jī)制更為復(fù)雜有關(guān)，只有少數(shù)的抗蟲基因被克隆。并且，已克隆的褐飛虱抗性基因BPHs 正向調(diào)控水稻對(duì)褐飛虱的抗性，并不能簡(jiǎn)單的利用CRISPR/Cas 技術(shù)獲取功能缺失突變體來(lái)增強(qiáng)水稻對(duì)褐飛虱的抗性。

2.4 增強(qiáng)對(duì)非生物脅迫的抗性

近年來(lái)，氣候的不斷惡化使水稻生長(zhǎng)面臨越來(lái)越嚴(yán)重的逆境脅迫。雜草、重金屬污染、干旱等逆境脅迫越來(lái)越嚴(yán)重，培育抗逆性強(qiáng)的水稻品種越來(lái)越迫切。

雜草危害是制約水稻生產(chǎn)的重要因素。除草劑的使用雖然在很大程度上可以抑制雜草的生長(zhǎng)，但是也會(huì)對(duì)水稻生長(zhǎng)和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定影響，不適宜直接用于實(shí)際生產(chǎn)[80]。因此培育除草劑抗性增強(qiáng)的水稻不僅可以提高除草效率，節(jié)約大量人力成本，還可以更好地保護(hù)生物穩(wěn)態(tài)。SUN 等[81]利用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的同源重組修復(fù)技術(shù)將W548L 和S627I 這2 個(gè)氨基酸替換，成功引入水稻ALS 基因，獲得了耐碘酰脲類和嘧啶羧酸類除草劑水稻新種質(zhì)。此外，EPSPS 蛋白的T102I 和 P106S 氨基酸突變[82]以及 TubA2 中的 M268T[83]突變，分別賦予水稻對(duì)草甘膦和氟樂(lè)靈的抗性。綜上所述，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)產(chǎn)生的這些抗除草劑等位基因具有加速水稻種質(zhì)創(chuàng)新的巨大潛力。

隨著工業(yè)化進(jìn)程的不斷發(fā)展，重金屬污染也逐漸加劇。其中鎘是一種毒性很大的重金屬，且可在生物體內(nèi)富集。因此，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除鎘攝取相關(guān)蛋白（OsNramp5）和鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OsLCT1）可以減少鎘在水稻中的積累[84]。

鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)非常重要的非生物脅迫因素。目前的研究表明，主要是一些植物轉(zhuǎn)錄因子家族基因參與響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)[85]。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子OsNAC041，敲除后植株高度高于野生型并且突變體鹽敏感性增加[86]。

2.5 單倍體育種和無(wú)融合生殖

1987 年，袁隆平先生提出雜交水稻育種分三個(gè)發(fā)展階段的戰(zhàn)略：從“三系法”到“兩系法”再到“一系法”，朝著程序由繁到簡(jiǎn)而效率越來(lái)越高的方向發(fā)展[87]。水稻育種“一系法”即以無(wú)融合生殖為遺傳基礎(chǔ)的雜種優(yōu)勢(shì)固定的育種研究。無(wú)融合生殖（Apomixis）是一種通過(guò)種子進(jìn)行無(wú)性繁殖的生殖方式，由于其不經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂或受精就可以產(chǎn)生種子，因此不會(huì)改變雜交品種的雜合基因型，從而實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)的固定[88]。雖然無(wú)融合生殖在400 多個(gè)物種中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是在一些主要農(nóng)作物中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象[89]。

近期，有研究表明，精細(xì)胞特異表達(dá)基因OsBBM1在卵細(xì)胞中異位表達(dá)可以繞過(guò)受精過(guò)程產(chǎn)生孤雌生殖，獲得單倍體[90]。并且此前有研究報(bào)道，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)同時(shí)敲除3 個(gè)將減數(shù)分裂轉(zhuǎn)換為有絲分裂（Mitosis instead of Meiosis，MiMe） 的相 關(guān)基因（O－sPAIR1、OsREC8、OsOSD1），可以消除水稻中的重組事件，使卵細(xì)胞加倍[91]。因此，在水稻中同時(shí)敲除MiMe 相關(guān)基因，并且利用卵細(xì)胞特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)OsBBM1 在卵細(xì)胞異位表達(dá)，就可以使二倍體卵細(xì)胞直接發(fā)育成胚進(jìn)而完成無(wú)融合生殖過(guò)程[90]。

幾乎同時(shí)，WANG 等[92]利用基因編輯技術(shù)同時(shí)編輯 4 個(gè)基因（OsPAIR1、OsREC8、OsOSD1、OsMTL），將無(wú)融合生殖特性引入到雜交稻中，獲得了雜種優(yōu)勢(shì)固定的克隆種子。前期研究表明，玉米MTL 基因的無(wú)義突變可以誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體[93-94]。WANG 等[92]首先利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除了秈粳雜交稻品種春優(yōu)84 中與玉米MTL 同源的OsMTL 基因，在其F1代成功產(chǎn)生了水稻單倍體。隨后繼續(xù)利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在春優(yōu)84 中同時(shí)敲除MiMe 相關(guān)基因和OsMTL 共4 個(gè)水稻內(nèi)源基因，獲得了可以發(fā)生無(wú)融合生殖的雜種優(yōu)勢(shì)固定（Fixation of hybrids, Fix）材料。Fix植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表現(xiàn)正常，表型也與其F1代雜交稻高度相似。但是上述兩種策略單倍體誘導(dǎo)率均較低（5%左右），并且育性也明顯下降（10%左右），還不能完全投入實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

2.6 人工定向進(jìn)化

遺傳和變異是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)。長(zhǎng)期以來(lái)，研究人員通過(guò)物理（例如紫外線）或化學(xué)（例如乙基磺酸乙酯，EMS）等方法來(lái)創(chuàng)制突變體，進(jìn)一步改善植物性狀。但是這些方法產(chǎn)生的突變是隨機(jī)的，并且往往會(huì)產(chǎn)生大量的植株生長(zhǎng)或者某種性狀受到抑制的突變體，后續(xù)對(duì)這些突變體的篩選和鑒定非常耗時(shí)耗力?；贑RISPR/Cas 技術(shù)的高效性和特異性，研究人員通過(guò)創(chuàng)制目標(biāo)基因的突變文庫(kù)，并在相應(yīng)選擇壓力下，可以快速且定向獲得目標(biāo)性狀改良的作物品種。

LI 等[33]設(shè)計(jì)了200 個(gè)獨(dú)立的sgRNA 靶向水稻乙酰輔酶A 羧化酶（OsACCase）的羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（Carboxyltransferase, CT domain）。隨后對(duì)再生苗噴灑高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）進(jìn)行篩選，對(duì)長(zhǎng)勢(shì)正常的秧苗進(jìn)行測(cè)序以確定突變類型，共發(fā)現(xiàn)4 個(gè)除草劑抗性突變 位 點(diǎn) ：P1927F、W2125C、S1866F 和 A1884P。 除W2125C 以外，其余3 個(gè)抗性位點(diǎn)未曾在植物中有過(guò)報(bào)道。另外兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也利用類似的策略分別對(duì)水稻ACCase 的CT domain[95]及內(nèi)源靶標(biāo)基因OsALS[96]實(shí)現(xiàn)近似飽和突變，均發(fā)現(xiàn)一些新的有生產(chǎn)應(yīng)用潛能的除草劑抗性位點(diǎn)，并且研究人員[96]進(jìn)一步將鑒定到的OsALS 中的P171F 氨基酸替換引入到了水稻生產(chǎn)品種南粳46 中，使南粳46 升級(jí)為“潔田稻”。

2.7 野生稻從頭馴化

當(dāng)前種植的所有栽培稻都是經(jīng)過(guò)數(shù)千年的時(shí)間從野生稻馴化而來(lái)的。隨著時(shí)間的推移，在提高作物產(chǎn)量和獲得理想性狀的同時(shí)，也導(dǎo)致了遺傳多樣性的減少以及一些抗逆性的減弱。許多主要作物的野生近親比栽培作物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性更強(qiáng)，因此野生植物的直接馴化是一個(gè)非常有前景的策略[97]。YU 等[98]利用CRISPR/Cas 技術(shù)首次建立了野生四倍體水稻快速?gòu)念^馴化的技術(shù)體系，并進(jìn)一步利用基因編輯技術(shù)對(duì)異源四倍體水稻基因組與二倍體栽培稻中重要農(nóng)藝性狀的同源基因進(jìn)行編輯，成功創(chuàng)制了一系列具有不同表型的突變體，為創(chuàng)制和培育新的作物以滿足未來(lái)的糧食需求和安全提供了一個(gè)切實(shí)可行的策略。

3 討論

截至2021 年1 月，全球230 個(gè)國(guó)家人口總數(shù)為75.85 億。聯(lián)合國(guó)最新發(fā)布的《世界人口展望：2015 年修訂版》報(bào)告預(yù)計(jì)，世界人口將在2050 年達(dá)到97 億，2100 年達(dá)到112 億。面對(duì)如此急劇增長(zhǎng)的人口數(shù)量和人口壓力，如何能夠保證未來(lái)的糧食生產(chǎn)和安全是我們現(xiàn)在面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。并且隨著全球氣候環(huán)境不斷惡化、耕地資源不斷縮小等，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和可持續(xù)利用帶來(lái)了更大壓力。因此，迫切需要科技創(chuàng)新來(lái)進(jìn)行作物的性狀改善和品種改良，來(lái)適應(yīng)不斷惡化的自然環(huán)境。

植物基因組編輯技術(shù)的發(fā)展為植物育種提供了很大的便利。通過(guò)基因組編輯的高效和精確的誘變可以在1~2 代內(nèi)獲得性狀穩(wěn)定的作物種質(zhì)，這是傳統(tǒng)育種技術(shù)無(wú)可比擬的。同時(shí)，基因編輯技術(shù)也存在兩方面的限制。一是其編輯范圍受限制，雖然目前CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯范圍已經(jīng)獲得極大拓展，甚至于幾乎不受PAM 的限制，但是SpRY 變體對(duì)PAM 的識(shí)別具有偏好性，即 NRN>NYN（Y=C/T），在攜帶 NYN PAM 的靶位點(diǎn)的編輯活性較低，還需要進(jìn)一步的優(yōu)化，使其在這些靶位點(diǎn)的編輯效率都得到進(jìn)一步提高。另一方面是其突變類型受限制，雖然現(xiàn)在CRISPR/Cas 系統(tǒng)已可以獲得多種類型的突變，如基因功能喪失、基因氨基酸替換以及調(diào)控基因表達(dá)等。但是這些類型的突變均是通過(guò)CRISPR/Cas 系統(tǒng)不同類型的衍生技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，不同類型的突變不能通過(guò)一種類型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)同時(shí)獲得。PE 系統(tǒng)的出現(xiàn)打破了這些衍生技術(shù)之間的鴻溝，其可以產(chǎn)生插入缺失突變以及全部12 種類型的堿基替換，但是其在植物中的編輯效率很低，不能滿足基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用的需求。近日，LIN 等[99]通過(guò)調(diào)整PBS 的熔解溫度（Melting Temperature, Tm）為 30℃以及在DNA 位點(diǎn)的正負(fù)鏈上各設(shè)計(jì)1 個(gè)pegRNA，將PEs系統(tǒng)的編輯效率平均提高約3 倍。并且其還發(fā)現(xiàn)PE 系統(tǒng)在全基因組范圍內(nèi)具有很高的特異性。進(jìn)一步將SpRY 變體與PEs 系統(tǒng)相結(jié)合，可以使CRISPR/Cas 系統(tǒng)獲得極大拓展，為植物品質(zhì)改良和分子育種提供更簡(jiǎn)捷高效的工具。

基因編輯技術(shù)可以特異地將多個(gè)遺傳性狀組合，從而精確高效地獲得多個(gè)性狀同時(shí)改良的作物種質(zhì)。并且還可以通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè)gRNA 同時(shí)靶向一個(gè)基因，在后期的選擇壓存在的條件下加速作物的馴化進(jìn)程。利用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了植物的無(wú)融合生殖構(gòu)成，成功實(shí)現(xiàn)了雜種優(yōu)勢(shì)的固定，避免了繁瑣的雜交種制種流程，節(jié)省了大量人力物力，減少了農(nóng)民的種植成本。當(dāng)前，針對(duì)基因編輯產(chǎn)品的安全性問(wèn)題世界各國(guó)的態(tài)度也存在一定差別。除了歐盟中部分國(guó)家將基因編輯作物視為轉(zhuǎn)基因作物，受轉(zhuǎn)基因生物管理?xiàng)l例規(guī)定的約束外，大多數(shù)國(guó)家，如美國(guó)、加拿大、澳大利亞、日本、阿根廷、巴西等已將基因編輯（沒(méi)有導(dǎo)入外源基因）作物視為非轉(zhuǎn)基因生物，開(kāi)放了基因編輯產(chǎn)品流入市場(chǎng)。近期開(kāi)發(fā)的一種外源成分檢測(cè)器（Foreign Element Detector, FED）可在外源成分信息未知的情況下，對(duì)全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，一次性完成對(duì)46 695 種不同外源成分序列的檢測(cè)，同時(shí)FED 還可以精確鑒定出外源成分的片段長(zhǎng)度及在基因組上的插入位置，為全球基因組編輯產(chǎn)品的應(yīng)用和安全監(jiān)管提供了一個(gè)重要工具平臺(tái)[100]。同時(shí)也有望為我國(guó)基因編輯產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供安全保障，將基因編輯技術(shù)研發(fā)的領(lǐng)先優(yōu)勢(shì)盡快地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)，以有效應(yīng)對(duì)外來(lái)基因編輯產(chǎn)品的沖擊，保障國(guó)家糧食安全。