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    羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿的包合工藝優(yōu)化

    2021-08-02 12:23:17梁浩錢璽丞杜曉靜郁建生
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:工藝優(yōu)化環(huán)糊精

    梁浩 錢璽丞 杜曉靜 郁建生

    摘要:為研究羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿的包合作用,對(duì)影響白屈菜紅堿包合率的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比、包合溫度、包合時(shí)間等3個(gè)因子進(jìn)行研究。在單因素基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken響應(yīng)面法的3因素3水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),以白屈菜紅堿包合率為響應(yīng)值,優(yōu)化包合工藝。結(jié)果表明,影響包合率的因素表現(xiàn)為包合比>包合溫度>包合時(shí)間,最終確定最佳試驗(yàn)條件:包合反應(yīng)溫度為61 ℃,包合反應(yīng)比例為10 ∶1,包合反應(yīng)時(shí)間為190 min,在此條件下包合率為72.75%,與軟件預(yù)測(cè)值(72.88%)接近(相對(duì)誤差0.178%)。

    關(guān)鍵詞:羥丙基-β-環(huán)糊精;白屈菜紅堿;響應(yīng)面分析法;包合作用;工藝優(yōu)化

    中圖分類號(hào): R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2021)12-0135-05

    收稿日期:2020-09-01

    基金項(xiàng)目:西部地區(qū)創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào):發(fā)改辦高技[2016]2195號(hào));貴州省科技支撐計(jì)劃(編號(hào):黔科合支撐[2019]2363號(hào));銅仁市科技計(jì)劃(編號(hào):銅市科研[2019]113號(hào)、銅市科研[2019]109號(hào))。

    作者簡(jiǎn)介:梁 浩(1987—),男,河北保定人,博士,副教授,主要從事藥用植物有效成分開發(fā)及應(yīng)用研究。E-mail:249672111@qq.com。

    白屈菜紅堿(chelerythrine)是從博落回、白屈菜、血水草以及飛龍掌血等藥用植物中提取得到的苯并菲啶型生物堿[1-3]。研究表明,白屈菜紅堿具有抗菌、抗炎、抗腫瘤和抗肝纖維化等多種藥理作用[4-5],對(duì)農(nóng)作物病蟲害的防治也有較好的效果[6]。因此,白屈菜紅堿被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、獸藥和飼料添加劑以及生物農(nóng)藥中。尤其是在動(dòng)物生產(chǎn)過程中,白屈菜紅堿具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、改善動(dòng)物健康、預(yù)防動(dòng)物疾病等多種功能[7],由于白屈菜紅堿的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn),生物利用度較低,所以有必要通過制劑技術(shù)改進(jìn)或提高白屈菜紅堿的溶解度和生物利用度[8]。

    在提高難溶性藥物的水溶性和增加穩(wěn)定性方面,環(huán)糊精包合技術(shù)顯示出較大的優(yōu)勢(shì)[9],而且藥物經(jīng)β-環(huán)糊精包合后可減輕口服后對(duì)胃腸道的刺激,提高療效,降低藥物毒性,并能保持藥物原有的性質(zhì)和作用[10]。在眾多的β-環(huán)糊精衍生物中,羥丙基-β-環(huán)糊精( HP-β-CD)顯示出較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值,主要體現(xiàn)在水溶性更好,常溫下它在水中的溶解程度超過50%;人體中耐受性好,在體內(nèi)基本上不累積,也不被分解代謝;低毒、安全、無腎毒性、較好的藥物增溶性等。目前由于其優(yōu)良的性質(zhì),在醫(yī)藥和食品等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[11]。

    目前,關(guān)于環(huán)糊精及其衍生物對(duì)白屈菜紅堿的包合研究較少,本研究采用飽和水溶液法,以羥丙基-β-環(huán)糊精為包合材料,對(duì)白屈菜紅堿進(jìn)行包合,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化白屈菜紅堿包合物的制備工藝,采用紫外光譜法對(duì)白屈菜紅堿和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物和兩者的混合物以及羥丙基-β-環(huán)糊精的紫外光譜進(jìn)行測(cè)定,并驗(yàn)證白屈菜紅堿-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物是否形成。本研究旨在將白屈菜紅堿制備成 HP-β-CD包合物,以期改善其在水溶性和穩(wěn)定性方面的缺陷,從而為拓寬其適用范圍提供試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑

    白屈菜紅堿原料(高效液相色譜檢測(cè)純度為94.3%),參照文獻(xiàn)[12]自制;羥丙基-β-環(huán)糊精(純度99%)、白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),均購自上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸等試劑(分析純),均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    超聲波清洗機(jī)(KQ-218),購自昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(T10CS),購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;超高效液相色譜儀(Agilent1290),購自安捷倫科技有限公司;十萬分之一分析天平(CPA225D),購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;千分之一分析天平(AE223),購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;真空干燥箱(DZF6030A),購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫集熱式磁力攪拌器(DF-101S),購自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9013A),購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 白屈菜紅堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備 稱取一定量HP-β-CD,加入5 mL蒸餾水,水浴加熱攪拌至溶解,緩慢加入0.1 g白屈菜紅堿,避光攪拌,攪拌結(jié)束后將反應(yīng)液在40 ℃進(jìn)行真空干燥,粉碎后即得包合物粉末。

    1.3.2 白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品11.74 mg,用1.0%鹽酸-甲醇溶液(體積比為50 ∶50)溶解于容量瓶(100 mL)中,并定容,配制得到白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)品母液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL于容量瓶(25 mL)中,并定容。液相色譜條件:選擇檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm,C18色譜柱,采用乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相,控制流速為0.5 mL/min;保持柱溫25 ℃,進(jìn)樣量為2 μL。

    1.3.3 樣品溶液的配制及含量測(cè)定 按單因素試驗(yàn)方案和響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案制備白屈菜紅堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物,準(zhǔn)確稱取10 mg白屈菜紅堿包合物,采用1.0%鹽酸-甲醇溶液(體積比為50 ∶50)溶解,超聲1 min,置于容量瓶(25 mL)中,稀釋定容,搖勻,采用有機(jī)溶劑微孔濾膜(0.45 μm)過濾,得待測(cè)包合物樣品溶液。采用高效液相色譜法(檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm)測(cè)定包合物中白屈菜紅堿含量。

    1.3.4 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物制備單因素試驗(yàn)

    對(duì)影響白屈菜紅堿包合率的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比、包合溫度、包合時(shí)間等3個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn),進(jìn)而確定各因素響應(yīng)面試驗(yàn)取值范圍。包合率=1-(濾液中白屈菜紅堿質(zhì)量+包合物中未反應(yīng)的白屈菜紅堿質(zhì)量)/稱量白屈菜紅堿質(zhì)量×100%。

    1.3.4.1 包合比對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響 在包合溫度為60 ℃,包合時(shí)間為1 h的條件下,研究不同包合比(1 ∶1、2 ∶1、4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1)對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響,篩選最佳包合比。

    1.3.4.2 包合溫度對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響 在包合時(shí)間為1 h,包合比為6 ∶1的條件下,選取30、40、50、60、70、80 ℃ 6個(gè)包合溫度,篩選不同溫度下HP-β-CD 對(duì)白屈菜紅堿的包合效果,得到最佳包合溫度。

    1.3.4.3 包合時(shí)間對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響 在包合比為6 ∶1,包合溫度為60 ℃的條件下,篩選1、2、3、4、5、6 h反應(yīng)時(shí)間下 HP-β-CD對(duì)白屈菜紅堿的包合效果,篩選最佳包合時(shí)間。

    1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響較大的3個(gè)因素,包合比(X1)、包合溫度(X2)和包合時(shí)間(X3)進(jìn)行試驗(yàn),采用3因素3水平的響應(yīng)面法(RSM) 設(shè)計(jì),采用多元回歸設(shè)計(jì)方法,以白屈菜紅堿包合率(Y)為響應(yīng)值,通過優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面分析確定最佳的白屈菜紅堿包合參數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    單因素試驗(yàn)均重復(fù)3次,取平均值,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析,響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1軟件統(tǒng)計(jì)與分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

    以白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品含量(x)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為豎坐標(biāo),所繪制的白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,回歸方程為y=0.741 59+17.113 87x,r2=0.999 95,在 0~46.96 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 HP-β-CD與白屈菜紅堿的配比對(duì)包合率的影響

    由圖2可知,白屈菜紅堿包合率隨著包合比的增大而增大,當(dāng)包合比達(dá)到10 ∶1時(shí)包合率達(dá)到44.1%,當(dāng)包合比繼續(xù)增大,白屈菜紅堿包合率開始減小,因此選擇10 ∶1為較佳條件。

    2.2.2 包合溫度對(duì)包合率的影響

    由圖3可知,白屈菜紅堿包合率隨包合溫度的升高不斷增大,當(dāng)達(dá)到60 ℃時(shí),白屈菜紅堿包合率達(dá)到44.1%,之后隨包合溫度的升高,包合率開始下降,可能是60 ℃時(shí)包合過程已到達(dá)平衡,溫度降低不利于白屈菜紅堿進(jìn)入羥丙基-β-環(huán)糊精當(dāng)中,溫度升高由于分子運(yùn)動(dòng)加劇,導(dǎo)致形成的包合物脫包合,因此選擇 60 ℃ 為較佳包合溫度。

    2.2.3 包合時(shí)間對(duì)白屈菜紅堿包合率的影響

    由圖4可知,白屈菜紅堿包合率隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,攪拌3 h時(shí)包合率達(dá)到71.6%,之后隨包合時(shí)間的延長(zhǎng)包合率下降,可能由于包合時(shí)間較短時(shí)白屈菜紅堿尚未完全進(jìn)入羥丙基-β-環(huán)糊精當(dāng)中,時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致已形成的包合物脫包合。因此選擇包合時(shí)間3 h為較佳條件。

    2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.1 數(shù)學(xué)模型方程

    選取對(duì)包合反應(yīng)影響較大的3個(gè)因素[包合比(X1)、包合溫度(X2)和包合時(shí)間(X3)]進(jìn)行分析,包合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。將表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析,以白屈菜紅堿包合率(Y)為固定量,以包合比(X1)、包合溫度(X2)和包合時(shí)間(X3)為因變量,建立數(shù)學(xué)模型

    方程為Y=71.46+8.14X1+1.95X2+0.31X3-2.66X1X2-0.17X1X3+0.39X2X3-12.76X21-4.35X22-0.45X23。對(duì)此模型方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

    由表3可知,通過對(duì)模型方程顯著性檢驗(yàn),該模型P<0.000 1,達(dá)到極顯著水平(P<0.01),說明該模型高度顯著,失擬項(xiàng)(P=0.412 0>0.05)不顯著,

    說明方程與試驗(yàn)擬合度較好,可用于羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合反應(yīng)的分析與預(yù)測(cè)。模型方差分析結(jié)果表明,各影響因素對(duì)白屈菜紅堿包合率影響大小的順序?yàn)榘媳?包合溫度>包合時(shí)間。

    2.3.2 包合工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

    圖5 為羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合工藝的響應(yīng)面分析圖。圖5-a顯示包合時(shí)間為3 h時(shí),羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比與包合溫度對(duì)包合率的影響,包合初始,包合率隨包合溫度的增大而增大,當(dāng)包合溫度達(dá)到一定值后,白屈菜紅堿包合率又略有下降。

    圖5-b顯示包合溫度為60 ℃時(shí),羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比與包合時(shí)間對(duì)包合率的影響,當(dāng)包合時(shí)間較短時(shí),白屈菜紅堿包合率隨包合比的增大而增大,但隨包合時(shí)間的延長(zhǎng),包合率先增大后減少。

    圖5-c顯示當(dāng)羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的包合比為10 ∶1時(shí),包合反應(yīng)溫度和包合反應(yīng)時(shí)間對(duì)包合率的影響,在不同包合反應(yīng)溫度下,包合率隨包合時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),在不同包合時(shí)間下,白屈菜紅堿包合率隨包合溫度的升高也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),在等高線圖橢圓中心和響應(yīng)面3D圖的最高點(diǎn)處存在極大值。

    2.3.3 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物包合最優(yōu)工藝條件確定

    通過對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析得到的理論最佳工藝條件:包合比為10.30 ∶1,包合溫度為60.74 ℃,包合時(shí)間為3.17 h。在此條件下,羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合率理論最大值為72.88%。但考慮到實(shí)際操作性,將包合參數(shù)進(jìn)一步修訂,最終確定羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿的配比為10 ∶1,包合溫度為61 ℃,包合時(shí)間為 190 min,將此條件重復(fù)3次取平均值,得到包合率為72.75%,與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.178%。證明擬合模型比較可靠,說明采用響應(yīng)面分析的 Box-Behnken 組合設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的白屈菜紅堿包合工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

    2.4 HP-β-CD-白屈菜紅堿包合物形成的驗(yàn)證分析

    通過對(duì)4種相同濃度的不同溶液(包括羥丙基-β-環(huán)糊精甲醇溶液、白屈菜紅堿甲醇溶液、白屈菜紅堿與羥丙基-β-環(huán)糊精混合物的甲醇溶液以及羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合物的甲醇溶液)進(jìn)行紫外掃描后,其紫外光譜如圖6所示。由于不同物質(zhì)的紫外吸收光譜與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有特定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,因此不同物質(zhì)的紫外吸收曲線波峰和波谷的位置均有差異。由圖6可知,白屈菜紅堿和白屈菜紅堿-羥丙基-β-環(huán)糊精混合物(混合物)的波峰分別位于318、266.5 nm,羥丙基-β-環(huán)糊精-白屈菜紅堿包合物(包合物)的紫外光譜吸收曲線波峰位于314、266 nm,因此可判定得到的物質(zhì)并不是白屈菜紅堿與羥丙基-β-環(huán)糊精兩者的物理混合物,而是包合物。

    3 結(jié)論

    近年來環(huán)糊精包合技術(shù)的研究和應(yīng)用越來越多,主要原因是其在提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性以及降低藥物毒性方面有很好的效果,從而拓寬藥物的適用范圍[13],由于羥丙基-β-環(huán)糊精比母體 β-環(huán)糊精的水溶性更好、且毒性更低,所以選擇羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿進(jìn)行包合。

    本試驗(yàn)研究了羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)白屈菜紅堿的包合作用,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化了白屈菜紅堿的包合工藝,最后確定最佳工藝條件:包合比為10 ∶1,包合溫度為61 ℃,包合時(shí)間為190 min,在此條件下白屈菜紅堿包合率達(dá)到72.75%。通過對(duì)因素的交互作用進(jìn)行分析,對(duì)白屈菜紅堿包合率影響的大小順序?yàn)榘媳?包合溫度>包合時(shí)間。經(jīng)紫外光譜驗(yàn)證,包合物已經(jīng)形成。本試驗(yàn)得到的羥丙基-β-環(huán)糊精與白屈菜紅堿包合物的制備工藝穩(wěn)定、可靠,為白屈菜紅堿新制劑的研究開發(fā)以及拓寬白屈菜紅堿的應(yīng)用領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。

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