14種觀賞植物葉片和花瓣揮發(fā)性物質(zhì)抑菌效果分析

謝久鳳 秦章元 張寒蕾 閆睢豪 郭陽(yáng)陽(yáng) 楊亞昕 李海霞

摘要：選取14種園林植物的葉片和花瓣作為試驗(yàn)材料，通過(guò)離體方法對(duì)大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行揮發(fā)性成分抑制效果分析。結(jié)果表明，不同物種之間的抑菌效果差異顯著。碧桃葉片、花瓣對(duì)4種供試菌的抑制率幾乎均達(dá)到了100%，櫻花、紫玉蘭、金鐘、紫丁香和貼梗海棠對(duì)4種供試菌也有很好的抑制作用;草本植物葉片、花瓣對(duì)4種供試菌的抑制效果明顯低于木本植物，長(zhǎng)壽花、菊花葉片、花瓣對(duì)金黃色葡萄球菌均無(wú)抑制作用，鳳仙花葉片對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率最高為75.6%。此外，供試植物葉片的抑菌率普遍高于其花瓣，其中西府海棠葉片對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的抑制率是其花瓣的65倍，而草本植物葉片與花瓣抑菌率的差異沒(méi)有木本植物明顯，但也存在一定差異，如長(zhǎng)壽花、菊花葉片與花瓣對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的抑制率相差10.8倍。對(duì)抑菌率達(dá)100%的木本植物進(jìn)行最大抑菌強(qiáng)度試驗(yàn)，結(jié)果表明，紫玉蘭葉片的抑菌強(qiáng)度最高，達(dá)到7.156×106CFU/（mL·cm2）。研究結(jié)果為優(yōu)選園林植物美化和凈化室內(nèi)外環(huán)境提供了依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步探討園林植物抗菌活性成分提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：園林植物;葉片;花瓣;揮發(fā)性物質(zhì);抑菌強(qiáng)度

中圖分類(lèi)號(hào)：S184 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）12-0100-05

收稿日期：2020-10-21

基金項(xiàng)目：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)工程項(xiàng)目（編號(hào)：KF201913）。

作者簡(jiǎn)介：謝久鳳（1983—），女，遼寧阜新人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事微生物學(xué)與植物學(xué)研究。E-mail：xiejiufeng@henau.edu.cn。

通信作者：李海霞，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物生理生化研究和實(shí)驗(yàn)教學(xué)與管理工作。E-mail：lihaixia@henau.edu.cn。

園林植物是生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者，是維持生態(tài)系統(tǒng)平衡的天然寶庫(kù)，也是提取生物活性物質(zhì)的最佳材料。同時(shí)，園林植物也為人們提供良好的戶(hù)外及室內(nèi)景觀。如果在發(fā)揮園林植物景觀美化作用的同時(shí)，還能夠使其莖葉等組織分泌物達(dá)到清除空氣致病菌、提高空氣質(zhì)量的效能，那么園林植物將顯示出更高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[1]。李濤等研究了宿根花卉葉片揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)6種植物對(duì)供試微生物都有不同程度的抑制作用[2];張國(guó)帥等研究了5種常綠園林樹(shù)種葉片揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)真菌、細(xì)菌的抑制能力，發(fā)現(xiàn)供試樹(shù)種葉片都有一定的抑菌活性，而且不同樹(shù)種之間的抑菌率有明顯差異[3]。沈鑫等選取華南地區(qū)22種常見(jiàn)園林植物，采用水蒸氣蒸餾法提取葉片中的揮發(fā)油進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同植物之間的抑菌效果差異顯著，香樟精油產(chǎn)生的抑菌圈最大，直徑為22.5 mm，黃蘭最小，為5.56 mm[4]。馬海旭等比較興安落葉松、銀中楊2種園林植物葉片水提液、醇提液和鮮汁液對(duì)5種菌種的抑制能力，同時(shí)進(jìn)行最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡(jiǎn)稱(chēng)MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，簡(jiǎn)稱(chēng)MBC）的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同植物葉片的不同處理方式對(duì)不同種類(lèi)微生物的抑制作用存在差異[5]。

目前，國(guó)內(nèi)研究者對(duì)園林植物抑菌試驗(yàn)的研究基本都是基于葉片，而植物花瓣的抑菌能力尚不清楚，關(guān)于園林植物抑菌強(qiáng)度的試驗(yàn)也未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)選取我國(guó)北方常見(jiàn)的9種園林木本植物和5種草本植物進(jìn)行葉片、花瓣抑菌試驗(yàn)的比較研究，同時(shí)對(duì)抑菌能力強(qiáng)的植物葉片、花瓣進(jìn)行抑菌強(qiáng)度測(cè)定。本研究對(duì)園林植物葉片、花瓣抑菌能力差異的探究，可以更好地闡明園林植物的抑菌作用和生態(tài)價(jià)值，為合理配置良好的人居植物景觀類(lèi)型提供理論依據(jù)[6-7]。

1 材料與方法

1.1 供試植物

本研究選取我國(guó)北方地區(qū)廣泛應(yīng)用于城市園林綠化的9種木本植物及室內(nèi)景觀價(jià)值較高的5種草本植物。9種木本植物分別為紫荊（Bauhinia blakeana Dunn.）、榆葉梅（Amygdalus triloba）、西府海棠（Malus micromalus）、金鐘（Forsythia viridissima Lindl.）、紫丁香（Syringa oblata Lindl.）、貼梗海棠（Chaenomeles speciosa）、碧桃（Prunuspersica Batsch.var.duplex Rehd.）、櫻花（Prunus serrulata）和紫玉蘭（Magnolia denudata Desr.），均于4月中旬采集于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)文化路校區(qū)。草本植物分別為瓜葉菊（Pericallis hybrida）、長(zhǎng)壽花（Kalanchoe blossfeldiana Poelln.）、菊花（Dendranthema morifolium）、鳳仙花（Impatiens balsamina）和矮牽牛（Petunia integrifolia），均采購(gòu)于河南省鄭州市陳寨花卉市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)菌種

選擇具有致病性的3種細(xì)菌及1種常見(jiàn)的芽孢桿菌作為供試菌種，分別為大腸桿菌（Escherichia coli ）、傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）、枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.3 菌懸液的制備

按照常規(guī)方法配制牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基，其中牛肉粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，pH值7.2～7.4（固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不加），于121 ℃下滅菌30 min備用。用接種環(huán)挑取分離純化好的菌種接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶?jī)?nèi)，于37 ℃、100 r/min下培養(yǎng)12 h，制成菌懸液。用10倍稀釋法稀釋菌懸液，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選取適宜的濃度作為試驗(yàn)菌懸液。

1.4 葉片和花瓣處理

采集健康、完整的植物葉片和花瓣，用自來(lái)水清洗3次以除去表面的灰塵與異物，再用無(wú)菌水清洗3次，最后用75%乙醇浸泡10 s消毒，取出后平鋪在無(wú)菌吸水紙上，吸干水分后放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，正反面分別紫外照射20 min。

1.5 抑菌試驗(yàn)

在無(wú)菌環(huán)境下，將活化好的菌種用接種環(huán)接入液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、100 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng) 12 h，用無(wú)菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋至適宜濃度，用移液槍吸取0.1 mL稀釋好的菌液，加入準(zhǔn)備好的固體平板上，用三角涂布棒均勻涂布、倒置，靜置 20 min 后備用。

稱(chēng)取1.0 g葉片，加入液氮，用研缽快速研磨成粉末，將粉末全部移入皿蓋中均勻分散，蓋上皿底，用封口膜封口，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種葉片設(shè)3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組不加葉片，花瓣的試驗(yàn)過(guò)程同葉片。大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)24 h，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)48 h，觀察平板上細(xì)菌的生長(zhǎng)情況并計(jì)算菌落數(shù)，與對(duì)照組進(jìn)行比較，用以下公式計(jì)算抑菌率：

抑菌率=（對(duì)照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析。

1.6 最大抑菌強(qiáng)度試驗(yàn)

選取試驗(yàn)中對(duì)細(xì)菌抑制率為100%的木本植物葉片和花瓣，處理方式同“1.4.1”節(jié)。用無(wú)菌水對(duì)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6，吸取0.1 mL各梯度菌液并涂布在牛肉膏蛋白胨平皿上，稱(chēng)取1.0 g供試植物葉片或花瓣，粉碎研磨，均勻加入皿蓋中，蓋上涂過(guò)菌液的皿底，用封口膜封嚴(yán)，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)所用平皿的直徑為9 cm，面積為63.585 cm2，將平皿上完全不長(zhǎng)菌落的濃度設(shè)為葉片或花瓣的最大抑菌濃度，由此計(jì)算單位面積內(nèi)受抑制的最大菌落數(shù)，即為最大抑菌強(qiáng)度（maximum bacteriostatic strength，簡(jiǎn)稱(chēng)MAS），計(jì)算公式：最大抑菌強(qiáng)度[CFU/（mL·cm2）]=最大抑菌濃度（CFU/mL）/平板面積（cm2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 木本植物對(duì)供試菌種的抑制作用

分別取9種木本植物的新鮮葉片和花瓣各1 g，將其研磨成粉末，均勻鋪在皿蓋上，將事先涂過(guò)供試菌的皿底倒扣在皿蓋上，密封后于37 ℃培養(yǎng)24 h或48 h進(jìn)行抑菌率的測(cè)定。如表1所示，木本植物的葉片、花瓣對(duì)4種細(xì)菌有不同程度的抑制作用，且差異較大，抑制率為0～100%。碧桃葉片、花瓣對(duì)4種菌的抑制效果最突出，基本實(shí)現(xiàn)了完全抑制;櫻花、紫玉蘭的葉片、花瓣也有很好的效果，其中櫻花葉片對(duì)大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌等3種致病菌完全實(shí)現(xiàn)了抑制，花瓣能完全抑制金黃色葡萄球菌，紫玉蘭葉片對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌實(shí)現(xiàn)了完全抑制，花瓣的抑菌能力較差;金鐘、貼梗海棠葉片對(duì)枯草芽孢桿菌完全實(shí)現(xiàn)了抑制，紫丁香葉片對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌完全實(shí)現(xiàn)了抑制?？傮w看來(lái)，木本植物葉片的抑菌能力普遍高于其花瓣。

2.2 草本植物對(duì)供試菌種的抑制作用

采用上述同樣的方法，對(duì)5種草本植物的葉片、花瓣進(jìn)行抑菌率的測(cè)定。由表2可以看出，草本植物的抑菌能力普遍低于木本植物，草本植物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率較低，長(zhǎng)壽花、菊花葉片、花瓣的抑菌率均為0，對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的抑制率為3.0%～76.0%;其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果最不明顯，5種植物中對(duì)大腸桿菌抑制性最強(qiáng)的是長(zhǎng)壽花葉片，其抑菌率只有29.9%。

2.3 葉片與花瓣抑菌能力的比較

如圖1所示，不同植物葉片抑菌率/花瓣抑菌率的值差異顯著，說(shuō)明一些植物葉片的抑菌能力與花瓣的抑菌能力顯著不同，而另一些植物葉片和花瓣則具有相同水平的抑菌能力。圖1-A中，西府海棠葉片、花瓣對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的抑菌率相差近65倍，紫荊葉片對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力是花瓣的40倍，金鐘葉片、花瓣對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率比值為28，而碧桃的葉片、花瓣表現(xiàn)出相同的抑菌能力，葉片抑菌率/花瓣抑菌率的值均為1，榆葉梅、貼梗海棠和櫻花葉片、花瓣的抑制能力間的差異也較小。

對(duì)于草本植物而言，其葉片、花瓣抑菌能力的差異沒(méi)有木本植物明顯，如圖1-B所示， 草本植物葉片與花瓣抑菌率（對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌）的比值最高的是長(zhǎng)壽花、菊花，但檢測(cè)抑制金黃色葡萄球菌的效果時(shí)，這2種植物葉片、花瓣的抑菌能力相同，均為0，而其他植物葉片、花瓣的抑菌能力差異均不明顯。

2.4 抑菌能力強(qiáng)的園林植物最大抑菌強(qiáng)度的比較

挑選出對(duì)供試菌種具有完全抑制能力的植物葉片、花瓣進(jìn)行最大抑菌強(qiáng)度試驗(yàn)，即考察1 g葉片或花瓣對(duì)梯度稀釋的不同濃度的菌液所能表現(xiàn)出的最大抑菌濃度，計(jì)算其能夠抑制的單位面積的最大菌落數(shù)[CFU/（mL·cm2）]。如表3所示，對(duì)大腸桿菌抑制強(qiáng)度最大的是碧桃葉片、櫻花葉片，是碧桃花瓣的1 000倍;碧桃葉片、紫玉蘭葉片對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的抑菌強(qiáng)度最大，紫玉蘭葉片對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制強(qiáng)度最大，為碧桃花瓣、紫丁香葉片的105倍;櫻花葉片對(duì)金黃色葡萄球菌的最大抑菌強(qiáng)度是紫丁香的105倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同植物之間抑菌強(qiáng)度差異顯著，說(shuō)明不同植物所含抑菌物質(zhì)不同，為進(jìn)一步分析植物抗菌活性成分提供了理論依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

在本試驗(yàn)中，5種草本植物的葉片、花瓣對(duì)4種供試菌有較明顯的抑制作用，瓜葉菊葉片、花瓣對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的抑制率分別達(dá)到了62.1%、60.7%;長(zhǎng)壽花葉片對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的抑制率為76.0%，花瓣對(duì)大腸桿菌的抑制率為24.2%;矮牽牛花瓣對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率為46.6%。木本植物對(duì)4種供試菌的抑制率明顯高于草本植物，木本植物中有6個(gè)品種對(duì)4種菌的抑制率達(dá)到100.0%，之前從未有如此高的關(guān)于植物抑菌率的報(bào)道。在本研究中，木本植物花瓣對(duì)4種菌的抑制率較高，碧桃花瓣對(duì)4種菌幾乎實(shí)現(xiàn)了完全抑制，櫻花花瓣對(duì)4種菌的抑制效果也很顯著，貼梗海棠花瓣對(duì)金黃色葡萄球菌實(shí)現(xiàn)了100%抑制。在本研究中，植物葉片的抑菌率普遍高于花瓣，可能由于葉片的生長(zhǎng)周期比花瓣長(zhǎng)，積累的有機(jī)物質(zhì)較多。不同植物由于生長(zhǎng)條件不同、組織結(jié)構(gòu)不同，所含代謝物質(zhì)有差異，最終導(dǎo)致抑菌能力不同[8]。

已有的報(bào)道都是將菌液稀釋到一定濃度后，將活菌數(shù)控制在可計(jì)算的范圍內(nèi)，再將菌液涂布在培養(yǎng)基平板上，加碎葉計(jì)算被抑制菌的數(shù)量，以此得出抑菌率。此方法簡(jiǎn)單、快捷、易操作，但也存在明顯不足，因?yàn)槊看卧囼?yàn)菌液濃度都會(huì)有差異，導(dǎo)致同種植物不同批次的試驗(yàn)抑菌率有差異，目前關(guān)于抑菌試驗(yàn)中活菌數(shù)的濃度沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。劉洋等選取8種常見(jiàn)園林草本花卉植物葉片進(jìn)行抑菌研究，發(fā)現(xiàn)葉片揮發(fā)性物質(zhì)具有抑菌作用，1 g彩葉草碎葉對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制率最高，分別為53.13%、56.99%、44.44%[9]。孫雨珂等對(duì)四川省成都市16種園林植物葉片進(jìn)行抑菌作用進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)八角金盤(pán)對(duì)金黃色葡萄球菌12 h的抑制作用最大，對(duì)照組菌落數(shù)41個(gè)，試驗(yàn)組菌落數(shù)8個(gè)，12 h抑菌率為80.5%;南天竹對(duì)大腸桿菌12 h的抑制率最高，對(duì)照組菌落數(shù)69個(gè)，試驗(yàn)組菌落數(shù)15個(gè)，12 h抑菌率為78.2%[10]。針對(duì)本研究中抑菌率為100%的木本植物葉片，為了探究其抑菌能力，本研究提出了一個(gè)新的概念——最大抑菌強(qiáng)度（MAS），即1 g碎葉抑制單位面積的最大活菌數(shù)量。結(jié)果顯示，同樣是抑菌率為100%的植物葉片，MAS結(jié)果差異顯著，對(duì)于大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌，MAS最高值與最低值的比值分別為104、103、105、105。碧桃、櫻花對(duì)大腸桿菌的MAS可達(dá)到106數(shù)量級(jí)，碧桃、紫玉蘭對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌的MAS可達(dá)到105數(shù)量級(jí)，紫玉蘭對(duì)枯草芽孢桿菌的MAS可達(dá)到106數(shù)量級(jí)，櫻花對(duì)金黃色葡萄球菌的MAS可達(dá)到105數(shù)量級(jí)，如此強(qiáng)的抑菌能力使這些植物成為提取天然植物抑菌劑的最佳對(duì)象。

綠色植物不僅能美化環(huán)境、釋放氧氣，還能分泌揮發(fā)性物質(zhì)，抑制或殺死空氣中的微生物[11-12]。植物體內(nèi)抑菌化學(xué)成分通過(guò)揮發(fā)作用被釋放出來(lái)，使微生物結(jié)構(gòu)受損，阻礙代謝途徑，破壞細(xì)胞內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)，從而抑制其生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致植物死亡[13]。目前，植物抑殺菌作用已應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、食品防腐保鮮等方面，但在園林綠化、人居環(huán)境改善中還有較大的研究空間[14]。本試驗(yàn)選取的草本、木本植物葉片、花瓣都有很好的抑殺菌效果，可以在人口活動(dòng)密集場(chǎng)所如醫(yī)院周?chē)?、街道旁、鬧市區(qū)、工廠附近等大量種植，不僅美觀，還能凈化空氣，是城市園林綠化樹(shù)種的最佳選擇。草本植物不但能作為綠化的地被植物，還可在室內(nèi)種植。辦公區(qū)域、商場(chǎng)、超市、醫(yī)院病房等人員流動(dòng)場(chǎng)所，多放置一些此類(lèi)物種，既能營(yíng)造良好的氛圍，緩解人們疲勞，減輕壓力，又能有效阻止由細(xì)菌引起的疾病傳播。

本研究只是將供試植物對(duì)4種細(xì)菌抑制效果進(jìn)行了初步分析，關(guān)于植物抑菌物質(zhì)和抗菌活性成分尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

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