藏東南典型暗針葉林不同土壤剖面微生物群落特征

焦 克,張旭博,徐 夢,*,劉曉潔,安前東,張崇玉

1 貴州大學農(nóng)學院,貴陽 550025 2 中國科學院地理科學與資源研究所,生態(tài)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點實驗室, 北京 100101

土壤微生物是土壤的重要組成部分,在有機質(zhì)形成與分解、養(yǎng)分循環(huán)與轉(zhuǎn)化和能量流動等方面起著重要作用。土壤微生物多樣性和群落組成是微生物生態(tài)學研究的重要指標[1],對認識各種生態(tài)系統(tǒng)下土壤生物地球化學循環(huán)過程及其對環(huán)境變化的響應(yīng)有重要意義。土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化主要受土壤營養(yǎng)狀況、質(zhì)地、溫度、水分、通氣性、根系分泌物、植物殘體等眾多因子的綜合影響[2],而這些因子會隨著土壤深度發(fā)生變化,進而導致土壤微生物群落在土壤垂直空間上的差異性。已有研究表明,隨著深度的增加,土壤微生物的物種多樣性和功能多樣性都下降[3-4],并且土壤微生物群落的數(shù)量和組成也發(fā)生變化[5]。通常認為,微生物活性在土壤表層(0—20 cm)最高,但是更深層土壤中的微生物仍然在養(yǎng)分代謝、能量循環(huán)及土壤形成等過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。因此,對深層土壤微生物群落組成和功能的研究,有助于深入認識土壤微生物在驅(qū)動陸地生態(tài)系統(tǒng)關(guān)鍵過程中的核心作用。

土壤微生物不同物種(或種群)之間存在著異常復雜的相互作用關(guān)系,既包括捕食和寄生等對抗關(guān)系,也包括共生和共棲等互惠互利關(guān)系,而這些相互作用維系著微生物群落的穩(wěn)定性,進而有效保障生態(tài)系統(tǒng)過程和功能的穩(wěn)定性[8]。生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)最先應(yīng)用于大型生物物種(或群落)之間的相互作用研究[9-10],近年來隨著微生物分子生物學技術(shù)的發(fā)展,也開始應(yīng)用于探索土壤微生物之間的微觀相互作用關(guān)系(即微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò))[11]。Deng等[12]研發(fā)了一種新的基于隨機矩陣理論的構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的方法,能提高傳統(tǒng)方法的可靠性和敏感性,可用于高通量數(shù)據(jù)的模塊化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能預測[12-13]。對微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的研究能夠深入了解土壤微生物群落構(gòu)建的多樣性和復雜性,并有助于更加準確的預測微生物群落構(gòu)建和功能對環(huán)境變化的響應(yīng)。例如,Lu等[14]通過構(gòu)建健康和發(fā)病連作土壤的真菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)健康土壤中的真菌網(wǎng)絡(luò)比發(fā)病土壤更加高效和組織有序化。Zhou等[15]對我國西北毛烏素沙地生物結(jié)皮的研究揭示,隨著生物結(jié)皮的發(fā)展,土壤微生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵種群發(fā)生顯著變化,進而導致微生物群落生態(tài)系統(tǒng)功能隨之發(fā)生改變。

青藏高原作為主要的高寒生態(tài)系統(tǒng)區(qū)域之一,其生態(tài)系統(tǒng)對于氣候變暖以及降水格局的改變十分敏感,因此研究該區(qū)域不同生態(tài)類型下土壤微生物群落特征對深入了解和預測全球變化的影響有重要意義。目前針對青藏高原土壤微生物的研究多關(guān)注在高寒草地草甸生態(tài)系統(tǒng)類型下土壤微生物群落組成、功能及相互作用關(guān)系[16-18],對其他生態(tài)系統(tǒng)類型的研究相對有限。西藏東南部地區(qū)植物類型十分豐富,其中暗針葉林帶是西藏東南部及橫斷山脈區(qū)山地植被垂直帶譜中的優(yōu)勢帶。藏東南暗針葉林帶具有較高的生物量和生產(chǎn)力[19],并且由于高海拔的低溫顯著抑制分解作用,是青藏高原東南部重要的碳庫,對該區(qū)域乃至全球陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)和收支平衡至關(guān)重要。西藏色季拉山是藏東南部典型的山地生態(tài)系統(tǒng),其暗針葉林帶主要分布在海拔3500—4200 m,主要建群種為急尖長苞冷杉(Abiesgeorgeivar.smithii)和林芝云杉(Picealikiangensisvar.linzhiensis),其土壤有機碳儲量和密度均處于較高水平[20]。近年來對色季拉山暗針葉林帶土壤微生物有一些報道,然而多集中于微生物量和表層土壤微生物群落組成特征[20-21],對深層土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)及種群之間的相互作用關(guān)系認識有限。本研究在西藏色季拉山暗針葉林帶采集表層土壤(0—20 cm)和底層土壤(40—60 cm),利用Illumina Miseq高通量測序分析和微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,系統(tǒng)揭示土壤真菌和細菌多樣性、群落組成及微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在土壤垂直剖面的變化特征,為深入了解高寒地區(qū)土壤微生物群落構(gòu)建特征及預測未來環(huán)境變化的影響提供科學依據(jù)。

1 研究方法

1.1 研究地區(qū)概況

色季拉山坐落于西藏自治區(qū)林芝市境內(nèi)(29°35′—29°57′N,94°25′—94°45′E),屬于念青唐古拉山脈,是尼洋河流域和帕隆藏布江的分水嶺,其主峰海拔高度為5200 m。色季拉山位于藏東南濕潤氣候區(qū)與半濕潤氣候區(qū)的過渡地帶,受印度洋暖濕季風影響,降雨量主要集中在夏秋兩季。據(jù)西藏林芝高山森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站(海拔3900 m)觀測,色季拉山年平均氣溫為-0.73℃,最高月為7月,其平均氣溫為9.23℃,最低月為1月,其平均氣溫為-13.98℃。年平均降水量為1134 mm,6—9月為雨季,占全年降水的75%—82%。年平均蒸發(fā)量為544 mm,年平均相對濕度為78.83%[22]。

1.2 樣品采集與處理

土壤樣品的采集于2013年6月,在色季拉山西坡典型暗針葉林分布區(qū)域(海拔3500—4200 m)隨機選取9個采樣樣方(10 m×10 m),每個樣方之間間隔不小于100 m。在每個樣方中隨機挖取3個土壤剖面(0—60 cm),先除去土壤表面的凋落物,之后分別采集剖面的表層(0—20 cm)和底層(40—60 cm)土壤樣品。每個樣方中三個剖面的表層土樣均勻混合為一個表層土樣,三個剖面的底層土樣均勻混合為一個底層土樣,即每個樣方獲得兩個樣品, 9個樣方共獲得18個樣品。采集的土壤樣品裝入封口袋中,保存在冰盒里運輸回實驗室進行后續(xù)分析。將土壤樣品過篩(2 mm),挑出可見的石塊、土壤動物和植物殘體。提取DNA的土壤樣品于-20℃下保存,剩余測定土壤其他指標的樣品風干于室溫下保存。

1.3 土壤基本理化性質(zhì)測定

土壤pH用1 mol/L KCl浸提(土水比為1∶2.5)并用電位法測定。土壤有機碳(SOC)用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定。土壤全氮含量使用元素分析儀測定(EA1108, Carlo Erba, Turin, Italy)。土壤含水量使用重量含水量表征,即將新鮮土樣于105℃烘干,根據(jù)烘干前后的質(zhì)量差計算土壤含水量。

1.4 高通量測序

使用PowerSoil DNA提取試劑盒(MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)進行土壤DNA的提取。使用NanoDrop ND-2000分光光度計(ThermoScientific, Wilmington, DE, USA)測定提取DNA的質(zhì)量。使用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)擴增細菌16S rRNA基因,使用引物1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增真菌ITS基因。擴增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進行高通量測序(Illumina MiSeq platform)。測序獲得的原始序列保存為FASTQ格式,使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology(QIIME)對序列進行優(yōu)化和數(shù)據(jù)質(zhì)控。之后使用Usearch軟件平臺(version 7.0, http://drive5.com/uparse/)對所有序列進行OTU(operational taxonomic units)在97%的相似度水平下進行劃分,生成OTU表格。為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,對比數(shù)據(jù)分別為SILVA細菌16S rRNA數(shù)據(jù)庫(Release 119, http://www.arb-silva.de),和UNITE真菌ITS數(shù)據(jù)庫(Release 6.0, http://unite.ut.ee/index.php)。使用Mothur 軟件(version v.1.30.1, http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)計算細菌和真菌群落的α-多樣性指數(shù),包括豐富度(Chao1指數(shù))和Shannon多樣性指數(shù)。

1.5 分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基于高通量測序獲得的OTU數(shù)據(jù)進行微生物分子生態(tài)學網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[12]。首先在MENA平臺(http://ieg4.rccc.ou.edu/MENA/)中通過原始OUT標準化篩選、OTU豐度計算各個OTU之間的相關(guān)性,之后基于隨機矩陣理論(Random matrix theory)構(gòu)建微生物網(wǎng)絡(luò),分析得到的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件使用Cytoscape 3.7.0進行可視化,具體操作步驟和參數(shù)的選擇參照Deng等[12]提供的方法。微生物網(wǎng)絡(luò)分析包括網(wǎng)絡(luò)特征分析、模塊檢測、網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)及特性分析等,不同網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)特征使用不同的指數(shù)如平均連接度(Average connectivity)、平均聚類系數(shù)(Average clustering coefficient)、平均距離(Average path distance)等進行表征。微生物生態(tài)學網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的功能通過模塊的內(nèi)連接度(Zi)和模塊間連接度(Pi)的值來表征。根據(jù)簡化網(wǎng)絡(luò)的閾值[23],網(wǎng)絡(luò)節(jié)點可劃分為四類：外圍節(jié)點(Peripherals nodes,Zi<2.5且Pi<0.62)、模塊樞紐(Module hubs,Zi≥ 2.5且Pi<0.62)、連接節(jié)點(Connectors,Zi<2.5且Pi≥ 0.62)和網(wǎng)絡(luò)樞紐(Network hubs,Zi≥ 2.5且Pi≥ 0.62)。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)表示為每個采樣深度的平均值±標準誤差。使用配對樣本T檢驗比較表層和底層下土壤理化性質(zhì)、細菌和真菌群落的α-多樣性指數(shù)以及主要種群相對豐度的差異。使用Pearson相關(guān)性分析分析細菌、真菌群落的α-多樣性指數(shù)及各種群相對豐度與土壤理化指標的關(guān)系。上述統(tǒng)計分析利用SPSS 22.0進行。不同剖面深度細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)的差異(即β-多樣性)在使用主坐標分析(PCoA)表征,基于Bray-Curtis距離構(gòu)建群落組成相似性矩陣,表層和底層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異用PERMANOVA進行檢驗,PCoA分析使用R軟件包vegan進行。微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)使用MENA分析和Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)特征

在色季拉山暗針葉林帶,土壤剖面深度顯著影響了土壤碳、氮含量。與表層土壤相比,底層土壤的SOC和TN含量顯著下降,分別降低了53.7%和53.3%,但是土壤碳氮比在表層和底層土壤無顯著性差異(表1)。此外,相比于表層土壤,底層土壤的pH上升了0.44,土壤含水量下降了30.5%,但是都沒有達到顯著水平。

表1 色季拉山暗針葉林帶表層和底層土壤理化性質(zhì)變化

2.2 土壤真菌和細菌多樣性

通過高通量測序,本試驗共獲得了2879個真菌OTU和 3013個細菌OTU。真菌和細菌的豐富度和Shannon指數(shù)的平均值在底層土壤均低于表層土壤,但是僅真菌豐富度和細菌Shannon多樣性指數(shù)在表層和底層的差異達到顯著(表2)。PCoA排序圖表明,細菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)在表層和底層土壤有明顯區(qū)分,且細菌群落結(jié)構(gòu)在表層和底層土壤的差異明顯高于真菌(圖1)。PERMAOVA檢驗表明,土壤剖面深度顯著影響了細菌(P<0.01)和真菌(P<0.01)的群落結(jié)構(gòu)。

表2 色季拉山暗針葉林不同深度土壤真菌和細菌的α-多樣性

2.3 真菌和細菌群落組成

在本研究采集的土壤樣品中,子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota) 是色季拉山暗針葉林土壤真菌的主要門類,其平均相對豐度分別為40.41%、 34.67%和 18.52%。在綱水平下,傘菌綱(Agaricomycetes,平均相對豐度23.60%)、接合菌門未分類綱(Zygomycota_incertae_sedis,18.52%)、座囊菌綱(Dothideomycetes,9.82%)和銀耳綱(Tremellomycetes,8.35%)等是土壤真菌群落的優(yōu)勢種群。不同真菌種群對剖面深度的響應(yīng)有明顯異同(圖2),例如子囊菌門未分類綱(Ascomycota_unclassified)、Dothideomycetes和Tremellomycetes表層土壤的相對豐度(4.10±0.98、15.90±2.47、14.58±4.61)均顯著高于底層土壤(2.59±0.52、3.75±1.08、2.12±0.72),而古菌根菌綱(Archaeorhizomycetes)和Zygomycota_incertae_sedis的相對豐度則在底層土壤(6.20±2.23、28.41±9.29)顯著高于表層土壤(1.21±0.40、8.64±2.24)。

圖2 土壤真菌(綱水平)和細菌(門水平)群落優(yōu)勢種群(平均相對豐度大于1%)的相對豐度隨剖面深度的變化特征Fig.2 Variations in the relative abundance of major taxonomic groups (> 1%) for fungal (at the class level) and bacterial (at the phylum level) community with profile depth圖中標注的*表示在不同土壤深度有顯著差異(* P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001)

在細菌群落中,變形菌門(Proteobacteria,平均相對豐度32.71%)、酸桿菌門(Acidobacteria,平均相對豐度31.91%)、綠彎菌門(Chloroflexi,平均相對豐度10.25%)和放線菌門(Actinobacteria,平均相對豐度9.0%)是主要的優(yōu)勢種群。土壤深度對不同細菌種群豐度的影響也存在差異,例如擬桿菌門(Bacteroidetes)和Proteobacteria表層土壤的相對豐度(5.11±0.94、36.31±1.98)顯著高于底層土壤(1.29±0.45、29.11±3.11),而Chloroflexi的相對豐度則在底層土壤(14.09±2.36)顯著高于表層土壤(6.08±1.38)。

2.4 真菌和細菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特征

基于高通量測序數(shù)據(jù)通過隨機矩陣理論分別構(gòu)建了表層和底層土壤微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)(圖3)。隨土壤深度增加,真菌網(wǎng)絡(luò)的模塊數(shù)減少,而節(jié)點和連線增加(表3)。表層和底層土壤真菌網(wǎng)絡(luò)中的連接均以負相關(guān)為主,并且表層土壤負相關(guān)的程度(222條,占所有連線的98.23%)高于底層土壤(195條、占底層土壤總連線的65.22%)。對表層和底層土壤真菌網(wǎng)絡(luò)的拓撲性質(zhì)分析表明,隨土壤深度增加,真菌網(wǎng)絡(luò)的復雜程度(平均連接度)、群落聚類程度(平均聚類系數(shù))、物種(節(jié)點)之間的距離(平均路徑距離)以及模塊性(表征微生物群落組織的有序性)均升高。相比于真菌,細菌的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)更為復雜。隨土壤深度增加,細菌網(wǎng)絡(luò)的模塊和節(jié)點減少,而連線增加。與真菌網(wǎng)落相反,表層和底層土壤細菌網(wǎng)絡(luò)中的連接都以正相關(guān)為主,并且隨土壤深度增加而升高：表層正相關(guān)連接占總連線的69.48%,而底層為75.21%。相比于表層土壤,底層土壤細菌網(wǎng)絡(luò)的平均連接度和平均聚類系數(shù)升高,而平均路徑距離和模塊性降低。

圖3 不同剖面深度下土壤真菌和細菌群落的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Co-occurrence network of fungal and bacterial communities at different soil profile depths每個節(jié)點代表一個OUT,節(jié)點的顏色代表細菌(門水平)和真菌(綱水平)分類。紫色連線表示負相關(guān),藍色連線表示正相關(guān)

表3 不同深度土壤真菌和細菌網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)特征

2.5 真菌和細菌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點功能劃分

模塊樞紐和連接節(jié)點是微生物群落中的關(guān)鍵基因,能將各自模塊內(nèi)或其他模塊中的許多節(jié)點連接起來。從基于網(wǎng)絡(luò)拓撲性質(zhì)的Zi-Pi分布圖(圖4)可以看出,底層土壤的真菌網(wǎng)絡(luò)含有4個連接節(jié)點,其中三個屬于錘舌菌綱(Leotiomycetes)。表層土壤的真菌網(wǎng)絡(luò)含有2個連接節(jié)點,同樣屬于Leotiomycetes。真菌網(wǎng)絡(luò)中余下96%的OTU都是外圍節(jié)點,沒有出現(xiàn)模塊樞紐和網(wǎng)絡(luò)樞紐。相比于真菌,細菌網(wǎng)絡(luò)的拓撲結(jié)構(gòu)更為復雜。表層土壤的細菌網(wǎng)絡(luò)含有20個模塊樞紐,多數(shù)屬于Acidobacteria(6個OTU)和Proteobacteria(7個OTU),而底層土壤含有17個模塊樞紐,多數(shù)屬于Acidobacteria(6個OTU)和Actinobacteria(4個OTU)(表4)。表層土壤細菌網(wǎng)絡(luò)含有9個連接節(jié)點,多數(shù)屬于Actinobacteria(5個OTU),而底層土壤含有8個連接節(jié)點,多數(shù)屬于Proteobacteria(5個OTU)。此外,屬于Chloroflexi、Planctomycetes和SHA-109門下的某些OTU僅在表層土壤細菌網(wǎng)絡(luò)中作為模塊樞紐或者連接節(jié)點,而Firmicutes、Gemmatimonadetes、WCHB1-60和BRC1門下的某些OTU僅在底層土壤細菌網(wǎng)絡(luò)中作為模塊樞紐或者連接節(jié)點(表4)。

表4 不同剖面深度土壤細菌網(wǎng)絡(luò)中的模塊樞紐和連接節(jié)點

圖4 基于土壤真菌和細菌網(wǎng)絡(luò)拓撲性質(zhì)的Zi-Pi散點圖Fig.4 Zi-Pi scatter plot based on topological properties of fungal and bacterial networks

3 討論

土壤環(huán)境因子(例如土壤pH值、有機質(zhì)、土壤含水量等)的變化顯著影響土壤微生物群落的組成和活性,因此不同深度下土壤環(huán)境因子的差異能夠?qū)е峦寥牢⑸锶郝浒l(fā)生顯著的變化[5]。本研究結(jié)果顯示,在色季拉山暗針葉林帶,土壤有機碳含量隨土壤深度增加而顯著下降(表1),而土壤真菌和細菌的多樣性也隨土壤深度增加而顯著降低(表2)。土壤有機碳是土壤微生物主要的能量來源和營養(yǎng)物質(zhì),其數(shù)量和質(zhì)量對土壤微生物多樣性有顯著影響[24]。同時,土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)在表層和底層土壤有顯著差異(圖1),并且不同深度下土壤有機碳含量的變化與多種微生物種群具有顯著相關(guān)性,例如Bacteroidetes(r=0.641,P<0.01)、Chloroflexi(r=-0.705,P<0.01)、Dothideomycetes(r=0.609,P<0.01)和Tremellomycetes(r=0.596,P<0.01)等。在藏西北高寒區(qū)域的研究結(jié)果也表明,土壤有機碳含量的變化是調(diào)控不同剖面深度下土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵因子[17]。不過,盡管土壤微生物群落在表層和底層土壤有顯著差異,群落構(gòu)建優(yōu)勢種群的種類沒有發(fā)生明顯變化。本研究結(jié)果顯示,真菌Agaricomycetes、Dothideomycetes、Tremellomycetes等綱以及細菌Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi等門在表層和底層土壤均為群落中的優(yōu)勢種群。與本研究相似,孫懷博[3]在青藏高原阿里地區(qū)的研究也發(fā)現(xiàn),放線菌(41.3%)、變形菌(9.3%)、酸桿菌(7%)、芽單胞菌門(7.2%)、綠彎菌門(5.9%)等在表層土壤(0—15 cm)和底層土壤(16—30 cm)都是土壤細菌群落中的優(yōu)勢種群。這種土壤微生物優(yōu)勢菌群在剖面垂直分布的相似性可能是由于這些微生物種群中的微生物擴散作用強、分布廣泛或者對環(huán)境變化的適應(yīng)能力較強,因而容易形成隨機性和廣泛性的分布特征[25]。

微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有無邊界、小世界、模塊化和層次結(jié)構(gòu)等特點,并且微生物網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)的特征有助于揭示不同微生物種群之間的復雜相互作用關(guān)系[26]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著土壤深度的增加,真菌和細菌網(wǎng)絡(luò)的平均連接度和平均聚類系數(shù)均升高(表3),說明底層土壤微生物網(wǎng)絡(luò)變得更復雜,群落組織有序性更高。土壤養(yǎng)分和資源分布的異質(zhì)性是影響微生物群落構(gòu)建的重要原因,土壤養(yǎng)分(尤其是碳氮)含量的增加能夠提高土壤微生物的數(shù)量,從而促進更復雜的相互作用關(guān)系。例如,Zhou等[15]發(fā)現(xiàn)生物結(jié)皮發(fā)展過程中土壤微生物網(wǎng)絡(luò)的復雜性(平均聚類系數(shù))隨土壤養(yǎng)分狀況的改善而逐漸增加。然而,本研究中土壤碳氮養(yǎng)分均隨剖面加深而降低,而微生物網(wǎng)絡(luò)卻在底層土壤更為復雜。Morri?n等的研究表明[27],相比于較為簡單的網(wǎng)絡(luò),具有更加復雜網(wǎng)絡(luò)的微生物群落具有更高效的資源利用循環(huán)和信息傳輸過程。因此,造成色季拉山深層土壤微生物網(wǎng)絡(luò)更加復雜的原因,很可能是底層土壤有限的營養(yǎng)物質(zhì)促使微生物群落演替發(fā)展出更加高效的養(yǎng)分利用效率[27-28]。本研究還發(fā)現(xiàn),真菌網(wǎng)絡(luò)的平均路徑距離隨土壤深度而增加,而細菌網(wǎng)絡(luò)的平均路徑距離則隨土壤深度增加而降低。平均路徑距離能夠表征網(wǎng)絡(luò)中物種(節(jié)點)之間連接的緊密性,平均路徑距離越小意味著該網(wǎng)絡(luò)中物種之間相互作用越緊密。不過,連接更加緊密的群落同時也意味著外界干擾在網(wǎng)絡(luò)中擴散的速度更快,對干擾的響應(yīng)可能更加敏感[12],因此這意味著深層真菌網(wǎng)絡(luò)在應(yīng)對干擾時更加穩(wěn)定,而細菌正相反。另外,隨土壤深度的增加,真菌的網(wǎng)絡(luò)模塊性增加,細菌網(wǎng)絡(luò)模塊性降低。網(wǎng)絡(luò)模塊性質(zhì)通常用表指征系統(tǒng)對外界干擾的抵抗能力,網(wǎng)絡(luò)模塊性越高,其抵抗外界干擾能力越強[29],因此色季拉山暗針葉林土壤中真菌網(wǎng)絡(luò)在底層土壤更加穩(wěn)定,而細菌網(wǎng)絡(luò)則在表層土壤更加穩(wěn)定。此外,土壤真菌和細菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的差異還反映在正負連接(即物種相互作用)的差異上：真菌網(wǎng)絡(luò)以負相互作用為主,而細菌網(wǎng)絡(luò)以正相互作用為主(圖3)。微生物網(wǎng)絡(luò)中的正相關(guān)連接可能反映了物種之間存在協(xié)同合作或者生態(tài)位重疊,而負相關(guān)連接可能意味著競爭作用或者生態(tài)位分化[30-31]。真菌的個體通常相對較大,生長速度相對細菌較慢,并且許多真菌能夠與針葉林樹種形成外生菌根,各自占據(jù)一定生態(tài)位,可能因此在分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)出負連接為主。而細菌由于個體小、生長速度快、隨機擴散作用強,很容易出現(xiàn)生態(tài)位重疊,因此其分子網(wǎng)絡(luò)具有更多的正連接。但是,理論上生態(tài)位重疊會導致競爭,表現(xiàn)出物種間的負相互作用。盡管微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析近年來在研究物種間相互作用中的應(yīng)用逐漸增加,但是網(wǎng)絡(luò)拓撲學特征對實際群落構(gòu)建的解釋還需要更多研究和驗證,因此獲得的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)與真實情況可能存在一定的差異。不過,分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中正負連接比例的變化可能更加有助于理解微生物相互作用關(guān)系對環(huán)境變化的響應(yīng)。例如在Zhou等[15]的研究中,細菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)也以正連接為主,但是隨著土壤養(yǎng)分和水分的增加,細菌網(wǎng)絡(luò)中負相關(guān)連接的比例增加,這與以往養(yǎng)分/水分增加促進細菌群落物種競爭的研究結(jié)果[32]一致。本研究中,相比于表層土壤,底層土壤真菌和細菌網(wǎng)絡(luò)的正連接的比例都增加,說明微生物種群正相互作用隨著土壤深度而增加。這暗示著在更深層的土壤中,微生物可能通過更高程度的協(xié)同合作獲取有限的養(yǎng)分資源或者抵抗底層土壤中的環(huán)境脅迫[33]。

微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的每個模塊象征著微生物群落的一個集合,在這個集合中的物種彼此聯(lián)系緊密,但是和其他模塊中的物種聯(lián)系較少。模塊內(nèi)部的關(guān)鍵連接者(模塊樞紐)和模塊之間的連接者(連接節(jié)點)是群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵物種,對維持群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起著重要的作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn),相比于表層土壤,底層土壤細菌和真菌網(wǎng)絡(luò)的模塊數(shù)、模塊樞紐和連接節(jié)點都下降,這說明土壤微生物群落的穩(wěn)定性程度可能隨剖面深度增加而降低。真菌網(wǎng)絡(luò)中的連接節(jié)點在表層和底層土壤均屬于Leotiomycetes(圖4),說明這類真菌對色季拉山暗針葉林土壤真菌網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建有重要意義。Leotiomycetes是土壤真菌群落中的的優(yōu)勢物種(平均相對豐度8.5%),屬于子囊菌門。子囊菌門是寒帶和溫帶森林生態(tài)系統(tǒng)重要的土壤微生物類群,尤其對凋落物分解過程有重要意義。例如,在歐洲針闊混交林的研究發(fā)現(xiàn),Leotiomycetes以及子囊菌門下Sordariomycetes和Eurotiomycetes的真菌種群是土壤胞外酶分泌的主要種群[34]。在真菌網(wǎng)絡(luò)中沒有出現(xiàn)模塊樞紐(Generalists),其他研究也報道過有些網(wǎng)絡(luò)中不存在Generalists[35]。不過,Montoya等[9]通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)證明Generalists中的模塊樞紐相對更重要,因為模塊樞紐數(shù)量的增加能增加網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。

相比于真菌,土壤細菌網(wǎng)絡(luò)的功能節(jié)點物種較為豐富,并且這些節(jié)點所屬生物學分類以及功能在表層與底層土壤網(wǎng)絡(luò)中存在明顯異同。土壤細菌網(wǎng)絡(luò)功能節(jié)點中的大多數(shù)屬于Acidobacteria、Actinobacteria及Proteobacteria這三個門(表4),而這三個門也是色季拉山暗針葉林土壤細菌群落中的優(yōu)勢種群。Acidobacteria在土壤中數(shù)量龐大、分布廣泛,在各種有機物質(zhì)的降解過程以及碳、氫和鐵元素的生物地球循環(huán)過程中有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),Acidobacteria門下的OTU在表層和底層土壤細菌網(wǎng)絡(luò)中均為模塊樞紐,說明其主要起著維持細菌網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的作用。Actinobacteria也是土壤細菌中的重要種群,能夠分解較為復雜的有機碳源物質(zhì),例如多糖和酚類化合物[36],并且一些放線菌具有菌絲體結(jié)構(gòu)。本研究中,Actinobacteria門下的OTU在表層土壤網(wǎng)絡(luò)中均為連接節(jié)點,主要起連接微生物網(wǎng)絡(luò)的作用,而在底層土壤網(wǎng)絡(luò)中多發(fā)揮著穩(wěn)定模塊內(nèi)部種群(模塊樞紐)的作用。Proteobacteria是細菌中種類和代謝多樣性最大的一門,是土壤碳、氮、硫等生物地球化學循環(huán)過程中的核心參與者。本研究中Proteobacteria門下的OTU均在表層和底層土壤細菌網(wǎng)絡(luò)中有關(guān)鍵作用,并且在表層土壤主要是維持群落穩(wěn)定(模塊樞紐),而在底層土壤則主要起連接微生物網(wǎng)絡(luò)的作用(連接節(jié)點)。除了優(yōu)勢種群,本研究還發(fā)現(xiàn),某些相對豐度較低的種群,例如硬壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、SHA-109等門下的物種也在土壤中起著維持網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定或連接網(wǎng)絡(luò)模塊的作用(表4)。此類微生物在群落中的數(shù)量雖不多,但在微生物共生網(wǎng)絡(luò)中起著非常關(guān)鍵的作用,但是目前對其中復雜的相互作用關(guān)系尚未研究清楚。未來對這些細菌種群生理生態(tài)學的研究有助于揭示藏東南暗針葉林土壤微生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和穩(wěn)定性機制,并促進對高寒地區(qū)土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)功能及其對環(huán)境變化的響應(yīng)與反饋的認識。

4 結(jié)論

在藏東南色季拉山暗針葉林帶,隨著土壤剖面深度的增加,土壤真菌和細菌的多樣性顯著降低,同時群落組成和結(jié)構(gòu)也發(fā)生了顯著的改變。土壤真菌和細菌的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)都隨著土壤深度的增加而變得更復雜,但是深層土壤中真菌網(wǎng)絡(luò)對環(huán)境變化可能更加敏感,而細菌網(wǎng)絡(luò)則在面對環(huán)境變化時可能具有更高的穩(wěn)定性。錘舌菌綱是維持土壤真菌網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和穩(wěn)定的關(guān)鍵種群,而細菌網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵種群的數(shù)量及種類則包括變形菌門、酸桿菌、放線菌、硬壁菌等十余種門類,且其網(wǎng)絡(luò)功能在不同土壤深度有明顯區(qū)別。研究結(jié)果有助于加深對青藏高原獨特的微生物地理區(qū)系的認識,并為深入理解及預測全球變化對高寒區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的影響提供理論依據(jù)。