基于Illumina MiSeq測序技術(shù)對冰川棘豆(Oxytropis glacialis)不同組織內(nèi)生菌多樣性的研究

許國琪,劉怡萱,曹鵬熙,姬亞麗,李敬科,李小燕,劉 星,,*

1 張家口學(xué)院, 張家口 075000 2 西藏大學(xué)理學(xué)院, 拉薩 850000 3 西藏大學(xué)青藏高原生態(tài)學(xué)研究中心極端環(huán)境生物適應(yīng)與進化實驗室, 拉薩 850000 4 武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430072

植物內(nèi)生菌(Endophyte)廣泛存在于植物體內(nèi),且大部分植物內(nèi)生菌對植物有益,具有促生作用、降解有毒物質(zhì)、抗逆境、抗動物攝食以及其他化感作用等[1-2]。在與宿主植物長期共存的過程中,內(nèi)生菌與植物互為條件、相互選擇,在宿主植物不同組織器官中形成相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng),發(fā)揮其相應(yīng)的生態(tài)功能。植物內(nèi)生菌在相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域中影響不斷擴大,特別是在醫(yī)藥方向和農(nóng)業(yè)方向中植物內(nèi)生菌資源調(diào)查與開發(fā)方面受到廣泛關(guān)注[3-4]。而極端環(huán)境下植物內(nèi)生菌經(jīng)過植物和環(huán)境的雙重選擇,特殊的內(nèi)生菌資源得以富集,并在植物組織中形成了其獨特的生態(tài)位和對極端環(huán)境的適應(yīng)能力,具有極高的研究價值[5-6]。青藏高原極端且多樣的生態(tài)環(huán)境孕育了豐富的植物資源,也為植物內(nèi)生菌的研究提供了寶貴的天然資源儲備庫[7-8]。目前,基于青藏高原高海拔、強輻射、寒冷氣候等極端環(huán)境下對植物內(nèi)生菌的相關(guān)研究已相繼開展,如矮火絨草[9]、青稞[1]、紫花針茅[10]、西藏沙棘[11]等,但對于青藏高原草地有毒植物的內(nèi)生菌多樣性及其對極端環(huán)境的適應(yīng)性研究卻鮮有報道。

草地有毒植物的發(fā)生作為全球變暖與干旱大背景下生態(tài)演變的基本規(guī)律,但牲畜超載加速了這種演替的過程[12]。作為我國4大牧區(qū)之一,西藏畜牧業(yè)成為支柱產(chǎn)業(yè)的同時,也成為受有毒植物-瘋草危害較嚴(yán)重的省區(qū)之一[13]。對冰川棘豆等瘋草類植物的毒性來源分析表明,植物體內(nèi)的致毒物質(zhì)是由其植物內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的一種吲哚里西啶類生物堿苦馬豆素(Swainsonine,SW),動物誤食毒草后,作為一種高效的甘露糖苷酶競爭性抑制劑,致使相關(guān)組織器官的功能紊亂甚至喪失,表現(xiàn)出以慢性神經(jīng)機能障礙為特征的中毒或死亡,嚴(yán)重威脅西藏畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展[14]。但另一方面冰川棘豆在荒漠化草原、沙漠地區(qū)廣泛分布,具有防風(fēng)固沙的重要生態(tài)功能[14]。此外,由于冰川棘豆作為一種高營養(yǎng)價值[15]的潛在可利用的豆科牧草資源及其植物體內(nèi)苦馬豆素藥用價值[16-17]的發(fā)現(xiàn),冰川棘豆的綜合防治與利用得到了廣泛的關(guān)注。目前,圍繞冰川棘豆植物微生物組的研究已從不同生態(tài)環(huán)境下內(nèi)生細(xì)菌多樣性[7]、內(nèi)生菌互作網(wǎng)絡(luò)[18]、根系微生物多樣性[19]等角度開展,但以植物不同組織內(nèi)生菌多樣性為視角的相關(guān)研究尚未見報道。

本研究基于Illumina MiSeq測序技術(shù)對冰川棘豆不同組織中的內(nèi)生菌進行研究,分析不同組織間內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)差異,探究內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)、功能差異及其與環(huán)境因子間的關(guān)系,從植物不同組織內(nèi)生菌角度完善冰川棘豆微生物組研究,也為進一步挖掘冰川棘豆內(nèi)生菌協(xié)同宿主植物適應(yīng)極端環(huán)境的機制研究提供參考。

1 研究方法

1.1 區(qū)域概況及樣品采集

本研究于2018年8月份對青藏高原高寒草原植被區(qū)[20]冰川棘豆生長旺盛期進行采樣,共采集冰川棘豆根(10)、葉(11)組織21個樣品。采樣時將根部脫落土壤收集用于測定土壤理化性質(zhì),將根、葉組織分段置于無菌管中,暫存在-20 ℃車載冰箱(美固Mobicool,CF-50)。在超凈工作臺(蘇凈安泰,SW-CJ-1F)中將植物組織取出,按無菌水(30 s), 70%無菌乙醇(2 min),2.5% NaClO(含0.1% Tween80)(5 min), 70%無菌乙醇(30 s)進行表面無菌化處理,最后使用無菌水洗滌3次[21]。并將材料保存在新的無菌管中置于-80 ℃超低溫冰箱(江蘇盛藍(lán),DW86L-158)用于內(nèi)生菌總DNA提取。

1.2 植物內(nèi)生菌DNA提取與PCR擴增、測序

植物內(nèi)生菌總DNA使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek, Inc.)提取,使用ABI GeneAmp? 9700型PCR儀進行DNA擴增實驗。對細(xì)菌16S rRNA V5-V7區(qū)進行擴增[21],引物為799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)、1193R (5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)。20 μL體系： 5×FastPfu Buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,5 μmol/L正反引物各0.8 μL,2.5 U/μL FastPfu Polymerase 0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板10 ng, ddH2O補至20 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min； 第一輪擴增：95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,27次循環(huán)； 72 ℃ 10 min；第二輪擴增13次循環(huán),擴增條件不變,10 ℃保溫。對真菌ITS1區(qū)進行擴增[22],引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。20 μL體系：10× Buffer 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,5 μmol/L正反引物各0.8 μL,5 U/μL rTaq Polymerase 0.2 μL,BSA 0.2 μL,模板10 ng,ddH2O補至20 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s, 37次循環(huán)； 72 ℃ 10 min,10 ℃保溫。對PCR產(chǎn)物純度和濃度以及DNA完整性進行檢測, PCR擴增及Illumina MiSeq測序工作由上海美吉公司完成,原始數(shù)據(jù)已上傳至GenBank,項目登錄號為PRJNA613354。

1.3 環(huán)境因子測定

使用GPS+北斗雙星接收機(GARMIN,eTrex 209X)測定采樣點經(jīng)緯度和海拔地理位置信息,對土壤理化性質(zhì)和大氣環(huán)境中的13個環(huán)境因子進行測定, 6個環(huán)境因子對菌群結(jié)構(gòu)或功能具有顯著影響,用電位計法測定(HANNA,HI98103) 土壤pH值,用恒溫干燥箱(上海精宏,DK-420S)烘干測定土壤含水量(Soil moisture,SM),使用托普云農(nóng)TPJ-26-I-G測定采樣點的空氣相對濕度RH (Relative humidity)和露點DPT (Dew-point temperature)以及大氣溫度AT (Atmospheric temperature),土壤速效磷AP (Available P)用便攜型土壤成分測定儀(北京優(yōu)普通用,UPA-B506)測定。樣品采集點信息見表1。

表1 樣品采集點信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于上海美吉生物I-Sanger云平臺(https://www.i-sanger.com/)進行生物信息學(xué)分析。利用Flash 軟件(version 1.2.7)對原始測序數(shù)據(jù)進行拼接, Trimmomatic軟件(version 0.33)對拼接數(shù)據(jù)進行過濾,基于Silva (Release128,http://www.arb_silva.de) 和Unite (Release 7.2,http://unite.ut.ee/index.php) 數(shù)據(jù)庫比對注釋后,經(jīng)Usearch軟件 (version 7.0)以97%的序列相似度水平劃分分類單元(operation taxonomic units,OTU)。Mothur軟件 (version 1.30.1)計算Alpha多樣性指數(shù),R軟件 (version 3.5.1)進行Alpha多樣性指數(shù)組間T 檢驗差異分析?；赒iime軟件 (version 1.17)計算Beta多樣性距離矩陣,綜合ANOSIM組間差異檢驗結(jié)果,對樣本進行NMDS非度量多維尺度分析。

LEfSe多級物種差異判別分析評價對樣本差異產(chǎn)生顯著性影響的菌群, LDA線性判別分析篩選出對組間差異有重要影響的菌群(LDA分值>2)[23]。VIF方差膨脹因子分析篩選出相互作用較小的因子(VIF值<10)進行CCA典型分析得到對菌群結(jié)構(gòu)有顯著影響的環(huán)境因子,并與多樣性指數(shù)進行線性回歸分析進一步篩選出顯著影響多樣性指數(shù)的環(huán)境因子,計算其與菌屬之間的Spearman相關(guān)系數(shù)。

EggNOG數(shù)據(jù)庫對內(nèi)生細(xì)菌進行功能預(yù)測分析,比對獲得內(nèi)生細(xì)菌OTU對應(yīng)的COG家族信息。FUNGuild[24]預(yù)測工具將內(nèi)生真菌群落劃分為病理營養(yǎng)型(pathotroph,PA)、共生營養(yǎng)型(symbiotroph,SY)、腐生營養(yǎng)型(saprotroph,SA)及其組合和未知類型(unknown,UN)共 8種功能營養(yǎng)類型。Wilcox秩和檢驗的組間顯著性差異檢驗確定存在顯著差異的菌群功能, Permanova置換多元方差分析評價環(huán)境因子對組織間內(nèi)生菌差異功能的解釋度,計算其與功能之間的Spearman相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰川棘豆植物內(nèi)生菌多樣性分析

本次測序得到175791條內(nèi)生細(xì)菌有效序列,注釋到428個OTUs； 757113條內(nèi)生真菌有效序列注釋到391個OTUs；平均測序覆蓋率分別達(dá)到99.88%和99.99%。

Alpha多樣性分析中(表2),不同內(nèi)生菌種類群落豐富度Chao指數(shù)(P=0.803、P=0.303)在分組間均無顯著差異；而群落多樣性Shannon指數(shù)在內(nèi)生細(xì)菌中根小于葉但無顯著差異(P=0.127),內(nèi)生真菌中根大于葉且存在顯著差異(P=0.015)。Beta多樣性分析中基于ANOSIM組間差異檢驗下的NMDS分析表明(圖1),組織間內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)(R=0.164,P=0.043)和內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)(R=0.294,P=0.004)均存在顯著性差異,分組對內(nèi)生細(xì)菌、真菌菌群結(jié)構(gòu)的差異均具有一定的解釋意義(stress=0.140、stress=0.153)。

表2 基于T檢驗(Student′s t test)的冰川棘豆內(nèi)生菌菌群Alpha多樣性指數(shù)分析

圖1 冰川棘豆內(nèi)生菌菌群Beta多樣性分析Fig.1 Beta diversity analysis of endophyte in Oxytropis glacialis

2.2 冰川棘豆植物內(nèi)生菌組成分析和差異分析

428個內(nèi)生細(xì)菌OTUs比對到19個門和267個屬。在門分類水平上(圖2),變形菌門(Proteobacteria)在根和葉樣本中占主要優(yōu)勢(58.87%、76.65%),放線菌門(Actinobacteria) (6.95%、8.42%)和擬桿菌門(Bacteroidetes) (3.68%、11.50%)以及其他菌門(0.14%、0.42%)的相對豐度占比在葉樣本中均高于根樣本,根樣本中僅有厚壁菌門(Firmicutes) (30.36%、3.02%)相對豐度占比要高于葉樣本。在屬分類水平上,根樣本中有194個菌屬,Lachnoclostridium5(20.84%)、假單胞菌屬(Pseudomonas,18.99%)和泛菌屬(Pantoea,9.04%)等8個菌屬相對豐度占比大于3%,其他菌屬占比為17.83%；葉樣本中有199個菌屬,假單胞菌屬(30.66%)、代爾夫特菌屬(Delftia,12.59%)、叢毛單胞菌(Comamonas,7.61%)等10個菌屬相對豐度占比大于3%,其他菌屬占比為21.53%。根和葉樣本中126個共有菌屬,占內(nèi)生細(xì)菌所有種類的47.19%,占菌群總豐度的97.54%。

圖2 基于門和屬水平的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Microbial community structure analysis of endophyte based on genus and phylum level

391個內(nèi)生真菌OTUs比對到7個門和149個屬。在門水平上(圖2),子囊菌門(Ascomycota)在根和葉組織中均占主要優(yōu)勢(90.36%、98.83%)且相對占比在葉樣本中高于根樣本,而其他菌門包括擔(dān)子菌門(Basidiomycota) (4.29%、1.11%)、接合菌門(Zygomycota) (1.12%、0.01%)和未知真菌(4.15%、0.05%)的相對占比在根樣本中均高于葉樣本。從屬分類水平來看,根樣本中有117個菌屬,格孢腔菌科未知屬(unclassified Pleosporaceae,32.95%)、Chaetosphaeronema(17.57%)以及赤霉菌屬(Gibberella,7.13%)等5個菌屬相對豐度占比大于3%,其他菌屬占比為32.83%;葉樣本中有76個菌屬,格孢腔菌科未知屬(32.44%)、格孢腔菌目未分類屬Ⅰ(unclassified Pleosporales Ⅰ,28.58%) 、格孢腔菌目未分類屬Ⅱ(unclassified norank Pleosporales Ⅱ,11.59%)等5個菌屬相對豐度占比大于3%,其他菌屬占比為8.31%。根和葉樣本中44個共有菌屬,占內(nèi)生真菌全部種類的29.53%,占菌群總豐度的91.54%。

LEfSe多級物種層級分析顯示(圖3),內(nèi)生細(xì)菌中擬桿菌門在葉樣本中具有相對優(yōu)勢,內(nèi)生真菌中子囊菌門在葉樣本中占相對優(yōu)勢,擔(dān)子菌門、接合菌門、未知菌門在根樣本中占相對優(yōu)勢。從屬水平來看,內(nèi)生細(xì)菌在根樣本中具有相對優(yōu)勢的有2個菌屬,而葉樣本則有14個菌屬占相對優(yōu)勢；內(nèi)生真菌中9個菌屬在根中占相對優(yōu)勢,5個菌屬在葉中具有相對優(yōu)勢。LDA線性判別分析表明(圖3),內(nèi)生細(xì)菌中鞘脂單胞菌目未分類屬(norank Sphingomonadales)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium) 、芽孢桿菌屬(Bacillus)等15個菌屬對不同組織間差異具有顯著影響,內(nèi)生真菌中Chaetosphaeronema、子囊菌門未分類屬、格孢腔菌目未分類屬Ⅰ等14個菌屬對樣本間差異具有顯著影響。

圖3 冰川棘豆內(nèi)生菌菌群差異分析Fig.3 Microbial community difference analysis of endophyte in Oxytropis glacialis LEfSe多級物種層級樹圖由內(nèi)至外的圈層表示菌群從門至屬的分類級別,節(jié)點圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比,黃色節(jié)點表示樣本間無顯著差異的菌群,紅色與藍(lán)色節(jié)點表示樣本間存在顯著差異的菌群,其中紅色節(jié)點表示菌群在根組織中具有相對優(yōu)勢,藍(lán)色節(jié)點表示菌群在葉組織中具有相對優(yōu)勢

2.3 環(huán)境因子對植物內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

方差膨脹因子VIF分析篩選相互作用較小的環(huán)境因子,結(jié)果表明僅有pH(VIF=1.00)、SM(VIF=1.00)到達(dá)分析要求(VIF<10)。CCA典型分析和線性回歸分析表明(圖4),組織間內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)受pH (R2=0.669,P=0.001)、SM(R2=0.684,P=0.001)的顯著影響,pH (R2=0.074,P=0.233)對組間Beta多樣性的影響不顯著,組間Beta多樣性主要受到SM(R2=0.241,P=0.024)影響。內(nèi)生真菌中pH (R2=0.771,P=0.001)、SM(R2=0.762,P=0.001) 對不同組織間菌群結(jié)構(gòu)的差異具有顯著性影響,其中SM (R2=0.223,P=0.031)顯著影響組間Beta多樣性,pH (R2=0.571,P<0.001)對于Chao指數(shù)影響顯著,但上述環(huán)境因子對組間內(nèi)生真菌中存在顯著差異的Shannon指數(shù)解釋并不顯著(P>0.05)。

圖4 環(huán)境因子對冰川棘豆內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of environmental factors on the microbial community structure of endophyte in Oxytropis glacialis* 0.01

對上述具有顯著性影響的環(huán)境因子與豐度前20的菌屬進行相關(guān)性分析表明(圖4), 50%的優(yōu)勢菌屬受環(huán)境顯著影響。從內(nèi)生細(xì)菌來看,pH與假單胞菌屬、新根瘤菌屬(Neorhizobium)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,而勞爾氏菌屬(Ralstonia)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)等8個菌屬與SM呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。從內(nèi)生真菌來看,pH與白粉菌屬 (Erysiphe) 呈顯著正相關(guān)關(guān)系,與子囊菌門未分類屬、Phaeomycocentrospora、格孢腔菌目未分類屬Ⅱ等7個菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,SM與菌刺孢屬(Mycocentrospora)呈顯著正相關(guān)關(guān)系,與毛殼菌屬(Chaetomium)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.4 冰川棘豆內(nèi)生菌菌群功能組成和環(huán)境因子對功能結(jié)構(gòu)的影響

通過比對EggNOG數(shù)據(jù)庫得到24種COG功能,組織間COG功能組成分析顯示(圖5),根組織中排名前10的COG功能依次為未知功能(S)、氨基酸運輸與代謝(E)、一般功能預(yù)測(R)、轉(zhuǎn)錄(K)、糖類運輸與代謝(G)、無機離子運輸與代謝(P)、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換(C)、細(xì)胞壁、膜、囊膜生物起源(M)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制(T)以及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源(J),葉組織中S>E>R>K>P>C>M>T>G>J。此外,在冰川棘豆根(2.10%)和葉(2.39%)組織中次生代謝產(chǎn)物生物合成、分解代謝(Q) 相關(guān)基因均有表達(dá)。對全部COG功能進行組間顯著性差異檢驗結(jié)果表明(圖5),G、M、轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白轉(zhuǎn)運、分子伴侶(O)在組織間存在顯著性差異。Permanova置換多元方差分析結(jié)果表明,無環(huán)境因子對組織間內(nèi)生細(xì)菌差異功能具有顯著的解釋意義。其中顯著影響菌群結(jié)構(gòu)的土壤pH值和土壤含水量對不同組織中內(nèi)生細(xì)菌功能結(jié)構(gòu)均無顯著性影響(圖5)。

FUNGuild分析顯示(圖5),內(nèi)生真菌營養(yǎng)模式 UN (33.74%、43.86%)在冰川棘豆根和葉組織中均占比最大, PA-SA(33.23%)、PA(12.35%)和PA-SA-SY(11.58%)在根組織中占比較大,而葉組織中PA-SA(32.80)、PA(20.42%)占優(yōu)勢。對全部營養(yǎng)型進行組間顯著性差異檢驗結(jié)果表明(圖5),PA-SA-SY、SA-SY在不同組織間具有顯著性差異(P<0.05)。Permanova置換多元方差分析表明,AL(R2=0.140,P=0.044)、RH(R2=0.159,

P=0.021)、AT(R2=0.180,P=0.014)、AP(R2=0.204,P=0.003)、DPT(R2=0.229,P=0.004)對營養(yǎng)模式結(jié)構(gòu)具有顯著影響。對上述顯著影響功能結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子與各營養(yǎng)模式進行相關(guān)性分析表明(圖5),PA與AL(R=0.659,P=0.023)和RH(R=-0.581,P=0.046)呈顯著正相關(guān)關(guān)系,PA-SA與AT(R=-0.700,P=0.017)、AP(R=-0.600,P=0.040)、DPT(R=-0.600,P=0.040)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,但上述環(huán)境因子對組織間存在顯著差異的營養(yǎng)類型影響并不顯著。

3 討論

植物體在自然界的實際生存狀態(tài)被認(rèn)為是微生物和植物相互依存的狀態(tài)[25],植物內(nèi)生菌在這一過程中形成了自身獨特的宿主保守性和地域特異性以及組織專一性等適應(yīng)性特點,本研究主要從組織專一性角度對冰川棘豆內(nèi)生菌多樣性進行探討。從組織間內(nèi)生菌多樣性來看,已有研究表明植物組織間內(nèi)生菌多樣性結(jié)構(gòu)隨植物不同并不具有一致性[26]。本研究中,冰川棘豆根部內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性小于葉但差異并不明顯,而根部的內(nèi)生真菌群落多樣性顯著大于葉。這與水稻和翅堿蓬的研究相似,水稻葉組織中內(nèi)生細(xì)菌的群落多樣性最豐富[27],而翅堿蓬根中內(nèi)生真菌群落多樣性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過莖和葉[28]。這可能與植物內(nèi)生菌的來源密切相關(guān),目前普遍認(rèn)為內(nèi)生菌主要來源于土壤,土壤中微生物在進入根系后,隨著蒸騰作用沿著維管束向葉部遷移。但由于組織間的生理特性不同,內(nèi)生真菌對根部的侵染程度較地上部分要強[29],導(dǎo)致根部內(nèi)生真菌群落多樣性顯著高于其他組織,而葉中除來自根部的內(nèi)生細(xì)菌傳遞外還存在空氣等其他途徑為微生物進入植物體內(nèi)提供可能[27],因此表現(xiàn)出較高的群落多樣性。從內(nèi)生菌群落組成來看,與其他植物內(nèi)生菌研究結(jié)果相一致,冰川棘豆不同組織內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌門為變形菌門[9],內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門[25],這與其他植物內(nèi)生菌在門水平上的研究結(jié)果相一致存在普遍共性。屬水平下,不同組織中共有菌屬豐度占比達(dá)90%以上,可能提示共有菌屬作為基礎(chǔ)菌群發(fā)揮重要作用,如對假單胞菌屬的研究中發(fā)現(xiàn),該屬的許多菌株可以分泌吲哚乙酸或赤霉素以及多種不同的抗生素,能有效促進植物的生長和抑制多種病原菌活性以及顯著提高植物的抗病性[30-31]。而差異性菌屬可能表現(xiàn)出菌屬相應(yīng)功能的強弱或在組織間特異性生理活動中發(fā)揮作用,如葉組織中占優(yōu)勢的內(nèi)生真菌格孢腔菌目菌屬作為深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes,DSE)的常見菌屬,被認(rèn)為能提高宿主抗病蟲能力及在干旱、寒冷的高海拔脅迫環(huán)境中的抗逆性[32]。根組織中差異性的內(nèi)生細(xì)菌生絲微菌屬,被報道能產(chǎn)生吡咯喹啉醌以提高其他細(xì)菌對毒性和輻射等極端條件的耐受性[33]。

除植物組織生理特性差異的影響外,外部環(huán)境條件的改變成為驅(qū)動植物組織間內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)差異的一個關(guān)鍵因素[34-35]。本研究中冰川棘豆不同組織的內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)受土壤pH和土壤含水量的顯著影響,其中土壤pH對組織間內(nèi)生真菌的Alpha多樣性豐富度有顯著影響,而土壤含水量對內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌的Beta多樣性影響顯著。與醉馬草研究中發(fā)現(xiàn)土壤有機質(zhì)顯著影響組織間內(nèi)生菌多樣性的結(jié)論不同,土壤有機質(zhì)等對冰川棘豆內(nèi)生菌無顯著性影響,這可能與宿主植物的特性有關(guān),冰川棘豆通過高效利用土壤有機質(zhì)適應(yīng)貧瘠土壤,這為其植物體內(nèi)的內(nèi)生菌提供了一個穩(wěn)定的生存環(huán)境,避免受土壤有機質(zhì)的顯著影響,實現(xiàn)對貧瘠土壤環(huán)境的適應(yīng)。與差異性菌群作用相似,受環(huán)境影響的內(nèi)生菌可能通過豐度的改變幫助冰川棘豆在變化或多樣的生態(tài)環(huán)境中適應(yīng)和擴散。如鹽單胞菌屬作為耐鹽細(xì)菌和具有固氮功能的根瘤菌屬與土壤含水量呈現(xiàn)顯著性的負(fù)相關(guān)關(guān)系,這可能有助于冰川棘豆在干旱脅迫下對鹽堿環(huán)境的適應(yīng)和固氮功能的實現(xiàn)。但同時也存在有使宿主致病,抑制宿主的生長的部分病菌,如白粉菌屬[36]和菌刺孢屬[37]作為植物病原菌被報道,可能提示冰川棘豆在高土壤pH值和高土壤含水量的地區(qū)易發(fā)生相應(yīng)的疾病。

植物內(nèi)生菌因受植物保護而具有相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境,內(nèi)生細(xì)菌通過與宿主植物之間發(fā)生基因橫向轉(zhuǎn)移,參與植物各種生命活動[38-39],而內(nèi)生真菌在宿主內(nèi)長期演化過程中,具備有在共生、寄生和腐生之間轉(zhuǎn)換的生存策略以應(yīng)對宿主植物的不同的生理狀態(tài),并在這種表型可塑性的過程中發(fā)揮其重要的生態(tài)作用[25,40-41]。本研究中,氨基酸運輸與代謝(E)等在組織間保守性的相關(guān)基因為不同組織提供了基礎(chǔ)性的保障,糖類運輸與代謝(G)的相關(guān)基因在根組織中占比較為顯著,這可能有助于冰川棘豆的根系不斷擴展,而葉組織中與細(xì)胞過程相關(guān)的細(xì)胞壁、膜、囊膜生物起源(M)、轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白轉(zhuǎn)運、分子伴侶(O)的占比較為顯著,這可能是由于青藏高原高海拔、強輻射的生態(tài)環(huán)境對葉組織易造成損害,進而促使參與細(xì)胞過程相關(guān)的內(nèi)生菌基因資源在葉組織中顯著富集,幫助植抵御極端環(huán)境對葉組織的傷害。此外,次生代謝產(chǎn)物因其多樣的生物活性被認(rèn)為是內(nèi)生菌發(fā)揮各種功能作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[25,42],冰川棘豆不同組織中均存在一定比例的次生代謝產(chǎn)物生物合成、分解代謝(Q) 相關(guān)基因,這為內(nèi)生細(xì)菌參與宿主植物代謝提供可能。就內(nèi)生真菌而言,一方面可能由于FUNGuild數(shù)據(jù)庫解析不全面[24],不同組織內(nèi)生真菌營養(yǎng)模式中未知營養(yǎng)型占比最大,但同時也反映出冰川棘豆中存在大量未知的內(nèi)生真菌資源有待發(fā)掘。基于生物多樣性的保險效應(yīng)理論,內(nèi)生真菌多樣的功能營養(yǎng)型可以為宿主植物在新的環(huán)境條件下承擔(dān)更多功能的可能性就越高[43],冰川棘豆中不同的功能營養(yǎng)型將有助于宿主對外界環(huán)境的適應(yīng)。而組織間差異的菌群功能為內(nèi)生真菌在宿主植物不同組織中發(fā)揮特異性功能提供可能。綜合環(huán)境因子分析來看,部分內(nèi)生細(xì)菌的功能或內(nèi)生真菌的營養(yǎng)型存在顯著差異的原因可能是受本研究測定外的環(huán)境因子影響或與組織生理結(jié)構(gòu)等其他因素有關(guān)。