中國市售醬腌菜中生物胺含量分析

李梅，汪冬冬，唐垚，張其圣，陳功，趙磊，明建英，郭麗艷，李成康*

1(眉山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川 眉山，620000)2(國家泡菜質(zhì)檢中心，四川 眉山，620000)3(四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山，620000)

生物胺是一類低分子質(zhì)量的含氮有機化合物，主要通過氨基酸脫羧形成。根據(jù)結(jié)構(gòu)可劃分為脂肪族胺(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等)、芳香族胺(酪胺、苯乙胺等)、雜環(huán)族胺(組胺、色胺等)。根據(jù)組成可分為單胺(組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺等)和多胺(精胺、亞精胺等)[1-3]。

發(fā)酵食品本身存在或發(fā)酵過程中污染面存在的含氨基酸脫羧酶的微生物，它們利用底物中的游離氨基酸脫羧產(chǎn)生生物胺[4]。由于發(fā)酵過程通常會導(dǎo)致微生物生長和游離氨基酸的產(chǎn)生，這為生物胺的積累提供了前提條件。常報道發(fā)酵肉、奶制品、魚產(chǎn)品和發(fā)酵蔬菜中生物胺含量偏高[5]。人體適量攝入生物胺能促進生長、增強代謝活力、清除自由基等，但攝入過多可能會引起惡心、頭痛和呼吸不適等不良反應(yīng)[6-7]。

醬腌菜是一種以新鮮蔬菜為主要原料制成的蔬菜產(chǎn)品，添加或不添加香料，經(jīng)鹽或食用鹽水處理而成，是我國生鮮蔬菜最基本和最主要的貯藏及加工方式[8]。在中國市場上商業(yè)化的醬腌菜主要包括四川泡菜、東北酸菜、辣白菜、冬菜、宜賓芽菜、現(xiàn)代工業(yè)泡菜、調(diào)味海帶等。根據(jù)主要加工特征，將醬腌菜分為強發(fā)酵、弱發(fā)酵和不發(fā)酵。以泡菜為代表的醬腌菜，目前仍以自然發(fā)酵為主，依賴于蔬菜表面的以乳酸菌為主的微生物，生物胺的產(chǎn)生不可避免[9-10]。

考慮到生物胺的毒理學(xué)意義以及發(fā)酵食品風險評估的數(shù)據(jù)支持，本研究的目的是闡明某些類型的醬腌菜是否是高含量生物胺來源，因為這與消費者飲食健康直接相關(guān)。因此，本文采用高效液相色譜法對全國299個醬腌菜樣品中的生物胺含量進行檢測，根據(jù)區(qū)域、蔬菜品種、工藝等特征分析生物胺差異，找出影響生物胺產(chǎn)生的主要影響因素。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

根據(jù)全國各地醬腌菜產(chǎn)量確定采購的相對數(shù)量，從線上平臺以及全國各地企業(yè)進行采樣，共收集到299個醬腌菜樣品，其中包裝樣品(n=139)來自四川、黑龍江、沈陽、山東、河北、廣東、吉林和天津。散裝的樣品(n=160)主要來自四川，是從家庭、農(nóng)貿(mào)市場、餐館和四川工廠收集，包含現(xiàn)代工業(yè)泡菜樣品(n=51)。將包裝好的產(chǎn)品密封并在冷藏條件下或室溫下保存。在室溫下24 h內(nèi)分析未包裝腌菜的樣品。根據(jù)發(fā)酵特性，將299個樣品分為強發(fā)酵類(n=77，東北酸菜、現(xiàn)代工業(yè)泡菜半成品)、弱發(fā)酵類(n=151，傳統(tǒng)四川泡菜、辣白菜、冬菜、宜賓芽菜等)、不發(fā)酵類(n=77，現(xiàn)代工業(yè)泡菜成品和調(diào)味海帶等)。各工藝醬腌菜特征及取樣量如圖1所示。

1.2 材料與試劑

組胺二鹽酸鹽(98%，histamine dihydrochloride，HIM)、腐胺(99.9%，putrescine，PUT)、苯乙胺(97.5%，2-phenylethylamine，PHE)、尸胺(98%，cadaverine，CAD)、色胺(≥97.5%，tryptamine，TRPM)、酪胺(≥98.5%，tyramine，TYM)、亞精胺(≥98%，spermidine，SPD)、亞精胺(≥98%，spermine，SPM)和1,7-二氨基庚烷(98%，internal standard，IS), 美國Sigma公司；丹磺酰氯(≥98%)，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈(色譜純)和甲醇(色譜純)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；丙酮、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氨水、乙酸銨和三氯乙酸等均為分析純試劑，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 實驗儀器

LC-2030 高效液相色譜分析儀，日本島津儀器公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海析達儀器有限公司；TGL-20bR冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；VORTEX-2 旋渦混合器，美國GENE公司；TP-214 分析天平，美國DENVER公司。

1.4 試驗方法

國內(nèi)高校對水文與水資源工程專業(yè)學(xué)生的培養(yǎng)目標和要求，是能在水利、水務(wù)、能源、交通、城建、農(nóng)林、環(huán)保、國土資源、教育等部門從事水文、水資源、水環(huán)境和水生態(tài)有關(guān)的勘測評價、規(guī)劃設(shè)計、預(yù)測預(yù)報與管理、教學(xué)與科學(xué)研究等工作，具有知識面寬、能力強、素質(zhì)高、敢于創(chuàng)新、善于合作的高級專門人才。本科畢業(yè)論文的選題內(nèi)容將是對學(xué)生專業(yè)業(yè)務(wù)水平的綜合考查以及走上工作崗位之前的再一次系統(tǒng)鍛煉，具有非常重要的意義。

1.4.1 生物胺標準溶液及內(nèi)標配制

生物胺單標儲存液：準確稱量酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、腐胺、尸胺和組胺標準品0.01 g，用0.1 mol/L HCl溶液溶解后定容為1 mg/mL的標準儲備溶液，置于-20 ℃下儲存。

內(nèi)標使用液的配制：準確稱取1,7-二氨基庚烷0.1 g，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋呈10 mg/mL的內(nèi)標標準儲備溶液，使用時采用梯度稀釋至0.1 mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

生物胺混標使用液：分別吸取各單標儲存液1 mL，用0.1 mol/L HCl溶液配制成100 μg/mL的混標液，備用。

1.4.2 生物胺提取和衍生

參考MORET等[11]和FRAS等[12]的方法，并進行優(yōu)化。稱取10 g切碎研磨后的樣品置于離心管中，加入1.25 mL 1.0 mg/mL內(nèi)標使用液和15 mL 0.1 mol/L HCl溶液進行混勻，振蕩提取30 min，4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，得到上清液1，沉淀部分加入15 mL 0.1 mol/L HCl溶液進行混勻，振蕩提取30 min，4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，得到上清液2，合并2次取得的上清液，用0.1 mol/L HCl溶液定容至50 mL。取1.0 mL上述溶液，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL飽和NaHCO3溶液和2.0 mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液，于40 ℃ 下避光反應(yīng)60 min，然后加入200 μL 100 mg/mL 脯氨酸溶液，漩渦1 min后于室溫避光放置15 min，然后加入0.4 g NaCl漩渦振蕩至NaCl完全溶解后加入1 mL 乙醚，渦旋振蕩30 s，待靜置分層后取上層有機相，重復(fù)萃取1次，合并兩次有機相。將有機溶劑于40 ℃水浴中揮干，然后用1.0 mL乙腈溶解殘留物，再用0.22 μm濾膜過濾待測。

1.4.3 高效液相色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺標曲及回收率

為了評估分析方法的性能，結(jié)果如圖2和表2所示。醬腌菜中8種生物胺峰型獨立，生物胺的線性范圍為0.25～60 mg/L，相關(guān)系數(shù)R2為0.991 1～0.994。以信噪比(S/N)大于3和10分別作為檢出限和定量限的判斷標準，得出檢出限為0.06～0.36 mg/L，定限量為0.20～1.19 mg/L。以上結(jié)果表明本方法可有效檢測痕量生物胺。

表2 方法性能特征Table 2 The performance characteristics of the proposed method

為評估方法在醬腌菜中的實際適用性，使用HPLC方法分析3種不同質(zhì)量濃度生物胺添加到醬腌菜中的回收率。結(jié)果如表3所示，回收率在71%～105%，相對標準偏差為0.01%～0.57%，相對標準偏差<5%。說明醬腌菜中的基質(zhì)對HPLC方法測定生物胺的影響很小，該方法檢測醬腌菜中生物胺含量是可靠的。

表3 醬腌菜樣品中8種生物胺的回收率Table 3 Recovery rates of 8 biogenic amines in pickles

2.2 強發(fā)酵類醬腌菜生物胺含量

收集到的71個強發(fā)酵類型醬腌菜包括20個東北酸菜和51個現(xiàn)代工業(yè)泡菜半成品。其中東北酸菜屬于低鹽、低溫、長時間發(fā)酵，現(xiàn)代工業(yè)泡菜發(fā)酵成熟后大多采用高鹽長時間貯藏，兩者都屬于深度發(fā)酵泡菜，含大量乳酸，其總酸含量普遍達到為10 g/kg(數(shù)據(jù)未顯示)。強發(fā)酵類醬腌菜生物胺含量如表4所示，包裝的東北酸菜生物胺平均含量約為(613.4±163.1) mg/kg(n= 20)，含量在364.4～968.2 mg/kg，研究結(jié)果與LIU等[9]和KALAC等[13]相一致。51個現(xiàn)代工業(yè)泡菜半成品生物胺平均含量為(800.4±370.9) mg/kg(n= 51)，含量在106.4～1 708.5 mg/kg，其中有27%的樣品中生物胺含量超過1 000 mg/kg。有研究報道，當食品中的總生物胺含量超過1 000 mg/kg時對健康有風險[14-16]?，F(xiàn)代工業(yè)泡菜中高含量生物胺的累積可能歸因于長時間發(fā)酵，其中RABIE等[17]研究發(fā)現(xiàn)德國酸菜貯藏45 d后的生物胺總量高達1 553 mg/kg，組胺和酪胺的含量都高于200 mg/kg。PEAS等[18]也研究得出貯藏時間對德國酸菜中生物胺含量有顯著的影響。其中氨基酸脫羧酶的微生物扮演著重要的作用，唐垚等[19]從四川泡菜中篩選出解鳥氨酸拉烏爾菌，含有賴氨酸脫羧酶cacd基因和組氨酸脫羧酶hdc基因，回接發(fā)酵48 h產(chǎn)尸胺達(766.67±2.17) mg/L?；诖?，篩選及接種不產(chǎn)生物胺的乳酸菌來調(diào)控泡菜發(fā)酵，從源頭上減少生物胺的形成是一種有效途徑。LARANJO等[20]和RABIE等[17]提出采用乳酸菌發(fā)酵劑可以減少泡菜中生物胺的累積，RABIE等[17]將植物乳桿菌2142、干酪乳桿菌干酪亞種2763和彎曲乳桿菌2771接種于自然發(fā)酵泡菜中，總的生物胺含量仍大大低于對照組，所有泡菜中腐胺降低10倍。

表4 強發(fā)酵類醬腌菜總生物胺含量Table 4 Concentrations of total biogenic amines in intense fermentation pickles

強發(fā)酵類醬腌菜中8種生物胺分布如表5所示，腐胺、尸胺、組胺和酪胺是東北酸菜和現(xiàn)代工業(yè)泡菜半成品中的主要生物胺，其中尸胺含量最高。組胺和酪胺被認為是毒性最高的，特別是與不良健康影響有關(guān)[21]，其中腐胺和尸胺被稱為組胺的增強劑[22]。另外，腐胺和尸胺可以與亞硝酸鹽結(jié)合形成可致癌的N-亞硝胺[23-24]。然而有關(guān)總生物胺毒性的研究比較有限，大多數(shù)集中在組胺和酪胺，當組胺攝入量為8～40、40～100和高于100 mg時分別可能引起輕度、中度和重度中毒[25]。攝入100 g組胺含量高于400 mg/kg的食物會引起中毒，歐盟和美國食品藥品監(jiān)督管理局分別將組胺含量限定為100和50 mg/kg[26]。組胺是我國唯一被正式限制的生物胺，在魚制品中限定為300 mg/kg，而醬腌菜中的生物胺含量沒有官方限制。若以國際上組胺的限量，至少有50%東北酸菜樣品和45%工業(yè)泡菜半成品是不合格。據(jù)報道，酪胺的最高允許含量為100～800 mg/kg，攝入過量是有毒的[14]。目前，尚未建立對食品中腐胺和尸胺的官方限量標準，RAUSCHER等[23]建議將泡菜腐胺和尸胺的最高容許濃度分別設(shè)定為140和430 mg/kg。若根據(jù)酪胺、腐胺和尸胺的建議含量，至少50%東北酸菜樣品和73%的現(xiàn)代工業(yè)泡菜半成品可能對健康有風險，但兩者都不直接食用，都屬于醬腌菜加工過程中的原料，后期經(jīng)過清洗等，生物胺濃度會出現(xiàn)大幅降低。

表5 強發(fā)酵類醬腌菜生物胺分布Table 5 Distribution of biogenic amines contents in intense fermentation pickles

強發(fā)酵類醬腌菜中發(fā)現(xiàn)的主要生物胺是腐胺、尸胺、組胺和酪胺。生物胺積累主要歸因于醬腌菜的生產(chǎn)過程，在相同工藝中，蔬菜類型是影響生物胺產(chǎn)生的重要因素。工業(yè)泡蘿卜半成品顯示出最低的生物胺含量，平均含量為(383.6±180.0) mg/kg，和其他原料半成品間呈顯著性差異(P<0.05)，而工業(yè)泡豇豆半成品具有較高的生物胺含量，平均含量達到(1 113.0±434.1) mg/kg。盡管半成品醬腌菜顯示出較高的生物胺含量，但通常不直接用于消費，這些醬腌菜作為現(xiàn)代工業(yè)泡菜生產(chǎn)的原料。

2.3 強發(fā)酵類醬腌菜生物胺含量

根據(jù)發(fā)酵程度差異，弱發(fā)酵類醬腌菜包含傳統(tǒng)四川泡菜、辣白菜、芽菜、冬菜等，屬于地方特色產(chǎn)品，總酸含量介于0.3～0.4 g/kg，其生物胺含量如表6和表7所示。收集到不同蔬菜原料和不同包裝形式的傳統(tǒng)四川泡菜樣品87個，平均生物胺含量為(126.2±162.1) mg/kg，介于9.9～987.8 mg/kg。不同蔬菜原料制備的傳統(tǒng)四川泡菜生物胺含量差異明顯，其中由青芥菜制成的泡菜生物胺含量[(323.3±317.2) mg/kg，n= 10]比其他蔬菜原料泡菜明顯更高。與強發(fā)酵類醬腌菜生物胺結(jié)果相一致，腐胺、尸胺、組胺和酪胺是傳統(tǒng)四川泡菜中的主要生物胺，但腐胺濃度最高，達到(44.1±47.0) mg/kg。根據(jù)國際上對組胺的限量，傳統(tǒng)四川泡菜大部分屬于合格產(chǎn)品。根據(jù)酪胺、腐胺和尸胺的建議含量，2.3%的傳統(tǒng)四川泡菜可能存在健康風險。辣白菜生物胺含量[(147.0±123.5) mg/kg，n=12]與傳統(tǒng)四川泡菜類似，范圍介于65.8～486.2 mg/kg，主要生物胺為腐胺、尸胺和酪胺，但組胺含量較低，尸胺含量高達(80.6±47.0) mg/kg。其他樣品生物胺平均含量為(175.9±127.3) mg/kg，介于15.6～666.5 mg/kg，僅發(fā)現(xiàn)1個樣品生物胺含量超過500 mg/kg。綜合來看，腐胺、尸胺、組胺和酪胺是我國地方特色醬腌菜中最常見的生物胺，其中尸胺含量偏高，達到(74.4±57.5) mg/kg。

表6 弱發(fā)酵類醬腌菜總生物胺含量Table 6 Concentrations of total biogenic amines in weak fermentation pickles

表7 弱發(fā)酵類醬腌菜生物胺分布Table 7 Distribution of biogenic amines in weak fermentation pickles

以芽菜和冬菜為代表的高鹽、低水分等作用下，微生物作用弱，生物胺積累少；大部分餐館中的傳統(tǒng)四川泡菜屬于“洗澡泡菜”，又稱“過夜泡菜”，其發(fā)酵時間短，產(chǎn)酸量低等，泡菜中生物胺主要來自原料和泡菜液長期累積的生物胺。弱發(fā)酵類醬腌菜發(fā)酵程度低，生物胺的積累較少，腌制質(zhì)量更好。有趣的是辣白菜中組胺含量較低，可能與其發(fā)酵環(huán)境不利于產(chǎn)組胺微生物的生長，使組胺的積累少。發(fā)酵程度越深，將產(chǎn)生更多的生物胺，這主要與產(chǎn)胺微生物有關(guān)。

在相同的工藝生產(chǎn)中，生物胺的產(chǎn)生也受蔬菜類型的影響。弱發(fā)酵類醬腌菜中的葉類蔬菜(青芥菜)和果類蔬菜(豇豆)比根類蔬菜(蘿卜)更容易產(chǎn)生生物胺。傳統(tǒng)泡豇豆生物胺含量[(222.1±219.0) mg/kg，n=11]比泡辣椒[(83.3±59.3) mg/kg，n=11]明顯更高，即使豇豆和辣椒都是水果蔬菜。該結(jié)果可能歸因于蔬菜表面的微生物差異和產(chǎn)胺微生物的數(shù)量。散裝泡甘藍中生物胺含量明顯高于包裝產(chǎn)品，這可能是家庭、餐館加工的衛(wèi)生環(huán)境比工廠化加工環(huán)境差有關(guān)。由于工廠包裝產(chǎn)品經(jīng)過滅菌處理，而散裝樣品在運輸和存儲過程中容易受到污染，導(dǎo)致生物胺累積。

2.4 不發(fā)酵類醬腌菜生物胺含量

不發(fā)酵醬腌菜包含現(xiàn)代工業(yè)泡菜成品和調(diào)味海帶，其生物胺含量如表8所示，所有產(chǎn)品生物胺含量都低于500 mg/kg，其中現(xiàn)代工業(yè)泡菜成品生物胺含量[(177.6±105.1) mg/kg，n=70]明顯低于半成品[(800.4±370.9) mg/kg，n=51]，介于21.2～493.9 mg/kg。相比半成品，可能是由于在加工過程中的脫鹽和脫水工序使生物胺濃度被稀釋。工業(yè)泡蘿卜產(chǎn)品顯示出最高的生物胺含量，達到(203.4±143.9) mg/kg，值得注意。調(diào)味海帶生物胺含量明顯低于蔬菜制品的醬腌菜，包裝和散裝調(diào)味海帶生物胺的含量相一致[(36.2±27.9) mg/kg，n= 19]，介于5.3～74.0 mg/kg。通常認為散裝樣品中生物胺平均含量較高，可能與發(fā)酵過程中違反了衛(wèi)生指標和/或制造工藝不當有關(guān)。

表8 不發(fā)酵類醬腌菜總生物胺含量Table 8 Concentrations of total biogenic amines in no fermentation pickles

不發(fā)酵類醬腌菜生物胺含量分布如表9所示，腐胺、尸胺、組胺和酪胺也是現(xiàn)代工業(yè)泡菜產(chǎn)品中主要的生物胺，其中尸胺含量高達(79.4±79.3) mg/kg。根據(jù)國際上組胺限量標準，現(xiàn)代工業(yè)泡菜產(chǎn)品中有4.3%(70個樣品中的3個)超過100 mg/kg，存在健康有風險，僅有1個樣品的酪胺高于100 mg/kg。

表9 不發(fā)酵醬腌菜生物胺分布Table 9 Distribution of biogenic amines in no fermentation pickles

除蘿卜外，由其他現(xiàn)代工業(yè)泡菜半成品制成的產(chǎn)品在通過脫鹽和脫水過程顯著降低了生物胺含量，從而使現(xiàn)代工業(yè)泡菜滿足了食品安全要求。但是，由于原料和發(fā)酵程度的不同，現(xiàn)代工業(yè)泡菜樣品比調(diào)味海帶樣品顯示出更高的生物胺含量。19個調(diào)味海帶中未發(fā)現(xiàn)色胺，并且95%(總計18個)中含有酪胺，且含量最高，平均濃度達(13.2±9.0) mg/kg，但明顯低于大部分蔬菜制品醬腌菜。說明發(fā)酵過程對醬腌菜中生物胺的積累非常重要，不發(fā)酵類醬腌菜生物胺的含量取決于原料中生物胺的濃度，該結(jié)果和郭曉麗等[27]研究結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本文通過研究我國不同工藝299個醬腌菜樣品中生物胺含量分布，首次比較不同加工醬腌菜中生物胺含量。盡管腌制食品安全性評估的結(jié)果尚需進一步補充，但在這項研究中發(fā)現(xiàn)了影響生物胺產(chǎn)生的主要因素。首先，加工工藝是產(chǎn)生生物胺的最重要因素。其次，蔬菜類型和衛(wèi)生狀況會影響醬腌菜中生物胺的積累。

大多數(shù)醬腌菜中的生物胺以腐胺、尸胺、組胺和酪胺為主，但辣白菜中組胺含量較低，調(diào)味海帶的生物胺含量明顯低于發(fā)酵類醬腌菜。從所有分析的樣品中，至少有50%的東北酸菜樣品、4.5%的傳統(tǒng)四川泡菜樣品和4.3%的現(xiàn)代工業(yè)泡菜樣品超出了歐盟和美國食品藥品監(jiān)督管理局報告的組胺限量。因此，大多數(shù)商業(yè)化或家庭生產(chǎn)的泡菜都可以被認為是安全的。但是，需要一種更有效的質(zhì)量控制系統(tǒng)來提高我國醬腌菜食品的安全性。