蒲公英不同提取物對酒精性肝損傷的保護作用

夏金，陳義倫

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

酒精引起的肝損傷會引起脂肪肝、肝炎、肝纖維化和肝硬化[1]等酒精性肝病，嚴(yán)重威脅人類健康。酒精進入機體后產(chǎn)生的氧自由基和代謝產(chǎn)物是損傷肝臟的主要物質(zhì)，過量酒精進入機體后，在鐵離子的參與下會與細(xì)胞色素P450結(jié)合產(chǎn)生大量的氧自由基，這些自由基會影響肝臟正常的氧化還原狀態(tài)，引起脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞膜通透性被破壞，進而損傷肝臟細(xì)胞的完整性和功能[2]；其代謝產(chǎn)物乙醛會與肝臟中參與代謝、轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的生理功能，繼而引起DNA修復(fù)異常，破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[3-4]；此外，線粒體中的谷胱甘肽與氧自由基反應(yīng)被大量消耗，降低線粒體氧化損傷的修復(fù)能力，進一步增加肝細(xì)胞的損傷程度[5]。

針對上述的損傷途徑，糖皮質(zhì)激素、S-腺苷蛋氨酸、多烯磷脂酰膽堿、還原型谷胱甘肽等一系列治療藥物被相繼研發(fā)并成功地應(yīng)用。但這些藥物會引起過敏、代謝紊亂等副作用，對人體健康產(chǎn)生危害[6]。藥食兩用植物包含的多酚、多糖、黃酮等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌[7]、抗炎等功效，能夠清除自由基、緩解機體應(yīng)激反應(yīng)，保護肝臟細(xì)胞[8]。

蒲公英是我國常見的藥食兩用植物，富含多糖、黃酮、酚酸等多種生物活性物質(zhì)，中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明其具有保肝瀝膽，利尿，抗炎，抗菌和輔助保護化學(xué)性肝損傷作用[9-10]。蒲公英乙醇提取物可提高藥物損傷小鼠肝臟中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量，并使谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)的含量減少，有效的保護肝臟[11]；水提物可降低四氯化碳對肝臟的損傷[12]。現(xiàn)有研究多采用不同溶劑提取蒲公英中的活性組分，研究其保肝作用，不同溶劑提取物中活性成分的種類、含量各不相同，無法對其中各類活性組分的作用進行系統(tǒng)性的比較和分析。基于現(xiàn)有研究現(xiàn)狀，本試驗采用水、乙醇作為溶劑提取蒲公英中活性組分，系統(tǒng)比較、分析不同提取物對酒精性肝損傷小鼠和HHL-5肝細(xì)胞保護作用和差異。在此基礎(chǔ)上，以抗氧化能力為切入點，探究其與保肝作用的內(nèi)在聯(lián)系，為系統(tǒng)分析蒲公英作用成分與機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蒲公英全草，山東省新泰市野菜野生水果養(yǎng)殖基地；SPF級昆明種雄性小鼠，4周齡，體重25～30 g，泰山醫(yī)學(xué)院，許可證號SCXK(魯)20170023；HHL-5細(xì)胞系，山東諾丁生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇、苯酚，均為分析純；胎牛血清Gibco，美國Thermo Fisher Scientific公司；RPMI-164 0培養(yǎng)基，Biological Industries公司；ALT、AST、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、SOD、GSH、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒，南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯，北京協(xié)和藥廠；Infinite2000多功能酶標(biāo)儀，法國Tecan公司；5415R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒲公英提取物的制備

去離子水清洗蒲公英全草，在70 ℃下干燥至恒重，打碎成粉，過40目篩，置于干燥器中備用。取50 g蒲公英全草粉，分別加入500 mL的水和乙醇制成提取液。提取液超聲2 h后抽濾、離心取上清液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35 ℃)濃縮至膏狀，冷凍干燥得所需樣品，置于-80 ℃條件下避光保存。

1.3.2 小鼠肝損傷模型的建立與試驗設(shè)計

小鼠都被安置在(25±3) ℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境，每天喂食和飲水。小鼠環(huán)境適應(yīng)7 d后，將其隨機分為9組，分別為對照組，損傷組，聯(lián)苯雙酯組，水提物的高、中、低劑量組和醇提物的高、中、低劑量組，每組8只。所有處理組小鼠均進行損傷和給藥處理(2次處理間隔12 h)，具體處理方式如表1所示，連續(xù)灌胃21 d。于最后1次灌胃后，禁食16 h進行器官處理和相關(guān)指標(biāo)的測定[13]：摘除眼球取血、離心(3 500 r/min，10 min，4 ℃)獲得血清；摘取肝臟后生理鹽水沖洗，按照肝組織與生理鹽水1∶9(g∶mL)制備勻漿，離心(4 000 r/min，10 min，4 ℃)后收集上清液進行后續(xù)分析；取肝組織左葉浸泡于10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛中，脫水制成石蠟切片，用蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

表1 各組小鼠實驗處理Table 1 Treatment of mice in each group

1.3.3 HHL-5肝細(xì)胞損傷模型建立與試驗設(shè)計

消化對數(shù)生長期的HHL-5肝細(xì)胞并計數(shù)，以1×105個/mL濃度接種于24孔板中，每個孔中加入0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。除對照組外，其他處理組采用3%乙醇處理15 min[14]進行損傷；對照組和損傷組使用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余各組使用添加提取物的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(高劑量組提取物終質(zhì)量濃度為0.5 g/L；中劑量組提取物終質(zhì)量濃度為0.25 g/L；低劑量組提取物終質(zhì)量濃度為0.125 g/L)，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液離心得上清液用于測定AST、ALT。用4 ℃的PBS沖洗24孔板后加入0.5 mL 1%(體積分?jǐn)?shù)) Triton-X 100細(xì)胞裂解液，充分吹打混勻，收集細(xì)胞裂解液，離心(4 000 r/min，10 min，4 ℃)取上清液測定SOD、MDA、GSH含量。

1.3.4 生化指標(biāo)檢測

參考邢佳等[15]的方法，分別測定9組小鼠血清和細(xì)胞上清液中AST、ALT、TG，肝臟組織和細(xì)胞中MDA、SOD、GSH等指標(biāo)。

1.3.5 體外抗氧化試驗

分別配制質(zhì)量濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、3、4、5 g/L的蒲公英全粉的水提取液和乙醇提取液，測定上述提取液的DPPH自由基清除能力[16]，羥自由基清除能力[17]和ABTS陽離子自由基清除能力[18]。

1.4 試驗結(jié)果統(tǒng)計分析

采用Origin 7.5軟件分析細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)和體外自由基清除能力的相關(guān)關(guān)系；采用單因素方差分析法分析處理組間顯著性差異，采用一般線性模型分析不同提取方式(水、醇提取)的差異，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英提取物對酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、TG含量和肝比重的影響

不同蒲公英提取物對小鼠血清中AST、ALT、TG含量和肝比重的影響如圖1所示。與對照組相比，損傷組小鼠血清中的AST、ALT、TG含量和肝比重均顯著增高(P<0.05)，說明酒精性肝損傷模型建模成功。水提物和醇提物的中、高劑量處理組與聯(lián)苯雙酯組處理的ALT含量無顯著性差異(圖1-a)；水提物和醇提物的高劑量組與聯(lián)苯雙酯處理組的AST含量無顯著性差異，表明2種提取物高劑量組可以有效保護線粒體(圖1-b)。上述結(jié)果表明蒲公英水、醇提物的高劑量組均能有效地保護細(xì)胞膜完整性(P<0.05)。低劑量和中劑量的水提物能夠有效維持細(xì)胞膜完整性，對線粒體的保護作用不顯著。從圖1-c可以看出，蒲公英水、醇提取物高劑量處理均能有效降低小鼠血液中TG含量；從肝比重的角度來看(圖1-d)，水提取物的全部劑量組和醇提物的高劑量組能有效降低肝比重(P<0.05)。此外，蒲公英的水、醇提物對血液中的AST、ALT和TG含量的影響有顯著性差異(P<0.05)。AST、ALT存在于肝細(xì)胞線粒體[19]和細(xì)胞質(zhì)[15]中，過量的酒精進入機體后，會引起細(xì)胞質(zhì)中自由基增加和氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起線粒體和細(xì)胞膜損傷，通透性增加，血清中含量升高。高濃度的蒲公英提取物能顯著降低血清中AST、ALT含量，低濃度的提取物作用效果不明顯，說明高濃度的蒲公英提取物可能會與細(xì)胞質(zhì)中自由基反應(yīng)，或是參與細(xì)胞通路的調(diào)節(jié)；而低濃度的提取物清除自由基能力較低，或調(diào)節(jié)能力相對不足，無法起到有效保護作用。當(dāng)使用中濃度的提取物處理肝臟時，提取物中功能組分均可與細(xì)胞質(zhì)中氧自由基，氧化應(yīng)激反應(yīng)通路Nrf-2[20]，抗凋亡通路Bcl-2/Bax[21]，以及炎癥通路TLR4/NF-κB[22]發(fā)生作用，減少炎癥因子釋放、調(diào)節(jié)信號通路；而線粒體膜與細(xì)胞膜所處的微環(huán)境不同，受損傷程度，細(xì)胞因子、反應(yīng)通路作用，和提取物調(diào)節(jié)程度也不同，宏觀上表現(xiàn)出中等濃度提取物能夠保持細(xì)胞膜完整性，但對線粒體膜保護作用不明顯。綜合上述結(jié)果，細(xì)胞蒲公英水、醇提取物的高劑量組能有效保護小鼠肝細(xì)胞，蒲公英水提物在維持生物膜完整性、降低血液中甘油三脂含量等方面均優(yōu)于醇提物。

2.2 蒲公英提取物對酒精性肝損傷小鼠肝臟中SOD、GSH、MDA活力的影響

酒精會導(dǎo)致機體活性氧(reactive oxygen species，ROS)等自由基含量增加，使非酶性抗氧化物含量降低和內(nèi)源性抗氧化酶(如SOD等)活性顯著降低，進而損傷肝臟[23]。從圖2可以看出，損傷組小鼠肝臟GSH、MDA、SOD活性較對照組活性顯著變化，聯(lián)苯雙酯處理組能有效保護肝臟(P<0.05)。具體來說，水提物各劑量和醇提物高劑量處理組均能顯著提高GSH(圖2-a)和SOD(圖2-b)的含量，僅水提物的高劑量組能有效降低MDA的含量(P<0.05)，醇提物作用效果不顯著(圖2-c)。綜合上述結(jié)果，水提物不同劑量組均能有效減輕細(xì)胞氧化損傷，醇提取高劑量組對SOD和GSH等酶活有顯著地保護作用，但對細(xì)胞中的MDA含量沒有影響；2種提取方式在細(xì)胞中MDA含量和抗氧化指標(biāo)等方面存在顯著性的差異。

2.3 肝損傷病理切片分析

如圖3所示，對照組(圖3-a)肝細(xì)排列整齊，細(xì)胞分布規(guī)律，形態(tài)正常，有明顯邊界，細(xì)胞核大小合適且呈圓狀，未見異常。損傷組(圖3-b)細(xì)胞排布散亂，細(xì)胞邊界不清晰且間隙大小無規(guī)律，部分細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)脂肪，有些細(xì)胞核不明顯，肝細(xì)胞出現(xiàn)變性。聯(lián)苯雙酯組(圖3-c)和各提取物組(水提物組：圖3-d～圖3-f；醇提物組圖3-g～圖3-i)可以改善酒精損傷肝細(xì)胞的程度，細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞質(zhì)中脂肪減少，細(xì)胞核較為規(guī)整。各提取物高劑量組改善程度好于中低劑量組，水提物組優(yōu)于醇提物組。

2.4 蒲公英提取物對酒精損傷肝細(xì)胞HHL-5中ALT、AST、GSH和SOD的影響

不同蒲公英提取物對酒精損傷肝細(xì)胞HHL-5中ALT、AST、GSH和SOD含量的影響結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，損傷組ALT、AST、GSH和SOD含量均發(fā)生顯著變化(P<0.05)，說明酒精損傷肝細(xì)胞模型建立成功；與損傷組相比，聯(lián)苯雙酯組和蒲公英水、醇提物均能有效地減輕肝細(xì)胞損傷。具體來說，水提物高劑量組能有效降低AST含量(圖4-b)；與小鼠血清中AST含量變化不同，蒲公英水、醇提物高劑量組均不能有效降低肝細(xì)胞中ALT含量(圖4-a)，2種提取方法對HHL-5肝細(xì)胞SOD含量沒有影響(圖4-d)，但其高劑量組能有效提高肝細(xì)胞中GSH含量(圖4-c)[24]。

2.5 不同蒲公英提取物保護作用與抗氧化能力相關(guān)性分析

蒲公英提取物的DPPH自由基、羥自由基、ABST陽離子自由基清除能力結(jié)果如表2所示。在0～2.0 g/L，水、醇提取物均具有較強的DPPH自由基清除能力，其清除能力隨著添加量的增加而增加；與DPPH自由基清除結(jié)果類似，2種提取物均具有較強的羥自由基、ABTS陽離子自由基清除能力。采用一般線性模型對不同提取物自由基清除結(jié)果進行分析，蒲公英全粉水提物體外自由基清除能力優(yōu)于醇提物，且不同濃度處理結(jié)果均具有顯著性的差異(P<0.05)。

表2 蒲公英提取物自由基清除能力Table 2 Free radical scavenging capacity of dandelion extract

為了進一步探究蒲公英抗氧化能力與細(xì)胞損傷指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系，對相同濃度的蒲公英提取物體外抗氧化劑值和小鼠細(xì)胞損傷相關(guān)指標(biāo)進行相關(guān)分析，結(jié)果如表3所示。蒲公英水、醇提物的體外抗氧化能力與細(xì)胞中SOD活性和GSH含量均呈現(xiàn)出較高地相關(guān)性(R>0.82)。上述結(jié)果進一步證實了蒲公英提取物中抗氧化組分是保護肝細(xì)胞的重要基礎(chǔ)[25]。

表3 蒲公英水提物和醇提物的自由基清除能力與胞內(nèi)細(xì)胞損傷指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of radical scavenging capacity and related indexes in water extractand ethanol extract

3 結(jié)論

動物和細(xì)胞實驗表明，高劑量的蒲公英水提物、醇提物對酒精誘導(dǎo)的肝損傷均具有保護作用，減輕肝細(xì)胞膜和線粒體膜損傷程度，提高肝臟中SOD、GSH等抗氧化酶的水平，降低MDA的含量；與醇提物相比，水提物的作用劑量更低，保護作用更好；體外抗氧化能力及相關(guān)性分析表明，水提物和醇提物都具有很強的自由基清除能力，與胞內(nèi)抗氧化能力呈正相關(guān)性，水提物抗氧化效果更好。

蒲公英提取物保肝效果與其抗氧化作用有關(guān)，水提物與醇提物中多糖、多酚等主要活性物質(zhì)含量不同，水提物中比醇提物含有更多的抗氧化活性物質(zhì)，可能是水提物保肝作用效果好的重要原因，蒲公英中主要保肝物質(zhì)成分及其是否有協(xié)同作用需進一步研究闡明。