杏花一測多評方法的建立及不同儲存環(huán)境各成分的含量比較

閆偉偉,徐 鵬,羅慧玉,丁 杰,賀麗霞,陳正源

0 引言

杏花為薔薇科植物杏或山杏的干燥花,味苦,性溫,無毒[1],杏花有一定的藥用歷史,中醫(yī)典籍中記載其可用于活血補虛,去除面部粉滓[2-3]。杏在我國分布廣泛,所含化學(xué)成分豐富,現(xiàn)代研究表明，其主要含有多糖、多酚、總黃酮類、揮發(fā)性成分及其他成分等[4-7],民間常以其作為茶飲使用[8-9],也有報道其被開發(fā)成杏花露使用[10-11]。一測多評法是基于一個對照品為內(nèi)參物,實現(xiàn)多成分同時測定[12]的質(zhì)控方法,該方法快速、簡便,成本低,近年來被廣泛應(yīng)用[13-15]。前期課題組已通過單因素試驗成功建立了杏花中蘆丁、阿魏酸、異槲皮苷含量的測定方法[16],為節(jié)省資源,縮短分析時間,本試驗采用QAMS 法，以蘆丁為內(nèi)參物,對杏花中3種成分進行含量測定,對其原有測定方法進行優(yōu)化和改進,并對不同儲藏環(huán)境下的杏花各成分含量進行測定比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蘆丁(批號:100080-201408,純度90.2%)、阿魏酸(批號:110773-201012,純度99.6%)、異槲皮苷(批號:111809-201403,純度92.9%)來源于中國食品藥品檢定研究院;乙腈、磷酸為色譜純,乙醇為分析純。

1.2 藥材 杏花藥材樣品 10 批,由河北省藥品檢驗研究院段吉平主任藥師鑒定:7 批為薔薇科植物杏的干燥花,3 批為薔薇科植物山杏的干燥花,見表1。

表1 藥材樣品信息

1.3 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(島津LC-2010A HT型):島津公司;分析天平(CPA225D):德國賽多利斯集團,純水/超純水機(Milli-Q Integral):美國Millipore 公司;YMC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm):YMC公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品14.60 mg,蘆丁對照品 30.40 mg,異槲皮苷對照品17.80 mg,分別置于100、10、100 ml 量瓶中,加70%乙醇溶液定容至刻度,分別制成濃度為0.145 4 mg/ml、2.742 1 mg/ml、0.165 3 mg/ml的對照品儲備液。精密量取各儲備液5 ml,置同一50 ml量瓶中,加70%乙醇溶液稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為阿魏酸14.541 6 μg/ml、蘆丁274.21 μg/ml、異槲皮苷16.536 2 μg/ml的對照品溶液。

圖1 混合對照品(A)和供試品溶液(B)的HPLC圖

2.1.2 供試品溶液的制備 取杏花粉末(過四號篩)約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇20 ml,密塞,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2 色譜條件 色譜柱:YMC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸(15∶85);流速:1.0 ml/min;檢測波長:343 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μl。

2.3 正交試驗 經(jīng)過單因素預(yù)試驗,采用L9(34)正交試驗以異槲皮苷、蘆丁和阿魏酸的含量為評價指標,以乙醇濃度(A)、溶劑體積(B)、提取時間(C)為考察因素,分別選擇3個水平(A:60%、70%、80%;B:10 ml、20 ml、30 ml;C:20 min、30 min、40 min)進行正交試驗,結(jié)果見表2～表4。由表3可知,各因素對異槲皮苷的影響大小是A>C>B,最佳提取條件為A2B2C2;各因素對蘆丁的影響大小是A>C>B,最佳提取條件為A2B2C2;各因素對阿魏酸的影響大小為A>C>B,最佳提取條件為A2B2C3。由表4可知,乙醇濃度(A)對3個成分結(jié)果的影響存在顯著性差異,溶劑體積(B)與提取時間(C)對蘆丁和異槲皮苷的結(jié)果無顯著影響。綜合各項指標,確定最佳提取條件為A2B2C2,即70%乙醇,20 ml,超聲30 min。精密稱取同一產(chǎn)地杏花3份,每份1.0 g,對最佳提取條件進行驗證,3次試驗結(jié)果異槲皮苷平均含量為0.324 1 mg/g,蘆丁平均含量為6.933 0 mg/g,阿魏酸平均含量為0.327 2 mg/g,優(yōu)于正交試驗各組數(shù)據(jù),表明所確定的最佳提取條件穩(wěn)定可行。

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 直觀分析

表4 方差分析結(jié)果

2.4 相對校正因子的建立 采用多點校正法。精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液 2、5、10、15、20 μl注入液相色譜儀中,記錄峰面積,以蘆丁為內(nèi)參物,分別計算阿魏酸、異槲皮苷的相對校正因子(表5),取其平均值作為定量fs/i,確定阿魏酸的相對校正因子f蘆/阿為0.486 3,異槲皮苷的相對校正因子f蘆/異為0.751 9。

表5 各成分的相對校正因子(fs/i)和相對保留時間(ts/i)

2.5 相對校正因子的耐用性考察

2.5.1 儀器與色譜柱的考察 分別考察熱電BOS HYPERSIL(250 mm×4.6 mm,5 μm)、YMC-Pack(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Waters SunFire(250 mm×4.6 mm,5 μm)3種C18色譜柱與島津LC-2010A HT、Waters e 2695-2998、島津LC20 AT 3個品牌高效液相色譜儀對校正因子的影響,結(jié)果(表6)各成分均能實現(xiàn)良好分離,各成分校正因子的RSD均小于5.0%,表明高效液相色譜儀和色譜柱對各成分校正因子無顯著影響。

表6 不同色譜柱與高效液相色譜儀對相對校正因子(fs/i)和相對保留時間(ts/i)的影響

2.5.2 柱溫、流速的考察 采用島津LC-2010A HT高效液相色譜儀和YMC-Pack C18色譜柱,考察不同柱溫(28、30、32 ℃)、流速(0.9、1.0、1.1 ml/min)對校正因子的影響,結(jié)果(表7)各成分校正因子的RSD均小于5.0%,表明柱溫和流速對各成分校正因子無顯著影響。

2.6 待測成分色譜峰的定位 以蘆丁保留時間的相對值結(jié)合紫外吸收光譜特征作為待測成分的定位標準。按“2.4”項下測得保留時間計算阿魏酸和異槲皮苷的保留時間的比值ts/i(ts/i=t蘆丁/待測成分)(結(jié)果見表5),阿魏酸的t蘆/阿為1.072 5,異槲皮苷的t蘆/異為0.838 3。按“2.5”項下對ts/i進行耐用性考察,結(jié)果(表 7)表明,在不同的色譜儀、色譜柱、柱溫和流速下,測得各待測成分的相對保留時間ts/iRSD均小于5.0%,可用來對待測成分色譜峰進行確認。

表7 不同柱溫與流速對相對校正因子(fs/i)和相對保留時間(ts/i)的影響

2.7 樣品含量測定及比較 取10批次不同來源的杏花按照供試品溶液制備方法進行樣品處理,采用ESM和QAMS法計算3個成分含量結(jié)果見表8,并采用t檢驗比較,2種方法測得結(jié)果無顯著性差異,表明所建立的QAMS法可用于杏花藥材的含量測定。

表8 QAMS法與ESM法含量測定結(jié)果比較

2.8 不同儲存環(huán)境中含量測定與比較 取S5號杏花3份,每份100 g,第1份自封袋封口置于干燥器中放于溫度為4 ℃的冰箱環(huán)境中(低溫低濕環(huán)境),第2份自封袋封口置于儲藏室溫度25 ℃,濕度45%～75%環(huán)境中(常溫常濕環(huán)境),第3份自封袋敞口置于溫度為35 ℃,濕度為85%以上的密封環(huán)境(高溫高濕環(huán)境)。對杏花藥材各成分含量進行為期12個月的考察,分別于1個月、4個月、8個月、12個月測定其各成分含量,同時,應(yīng)用SPSS統(tǒng)計分析軟件對在3種儲藏環(huán)境下3種成分含量進行單因素方差分析,分別以各成分的含量為因變量,3種儲藏環(huán)境為自變量。結(jié)果(表9)表明,蘆丁和異槲皮苷含量隨著儲藏時間的增長有所降低,常溫常濕與低溫低濕2種環(huán)境對兩成分含量的影響無顯著差異;高溫高濕環(huán)境下,2種成分含量下降明顯,存在顯著差異。阿魏酸含量隨著儲藏時間的增長略有升高,常溫常濕環(huán)境下,阿魏酸含量較其他2種環(huán)境升高明顯,存在顯著差異,高溫高濕與低溫低濕2種環(huán)境對阿魏酸含量的影響無顯著差異。

表9 不同儲藏環(huán)境下杏花化學(xué)成分含量

3 討論

課題組前期對供試品溶液的制備進行了選擇優(yōu)化,對色譜條件、方法學(xué)考察與提取方法單因素試驗進行了試驗研究并已發(fā)表[16]。蘆丁、阿魏酸與異槲皮苷標準曲線的相關(guān)系數(shù)均為0.999 9,三成分色譜峰與其他色譜峰均能實現(xiàn)良好分離,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性與加樣回收率均能達到要求?；趩我蛩卦囼灥慕Y(jié)果,本試驗進行了以乙醇濃度、溶劑體積、提取時間為考察因素的正交試驗,最終確定以70%乙醇20 ml提取30 min作為供試品溶液提取方法。

依據(jù)QAMS法建立技術(shù)指南,內(nèi)參物優(yōu)選含量較高、保留時間適中的有效成分。本試驗中,蘆丁較阿魏酸和異槲皮苷含量高,且相對價廉易得,綜合考慮,確定蘆丁為內(nèi)參物。在待測成分色譜峰的定位中,采用待測成分與內(nèi)參物的相對保留時間進行定位,并結(jié)合色譜峰峰型及紫外吸收光譜特征,可準確判斷出目標峰的位置進行準確定位。

采用QAMS法對不同儲存環(huán)境下的杏花各成分含量進行測定。研究發(fā)現(xiàn),常溫常濕與低溫低濕對杏花中蘆丁與異槲皮苷無顯著影響,均呈略有下降趨勢,而高溫高濕狀態(tài)下降明顯。阿魏酸則在常溫常濕環(huán)境下含量有所升高,且較另2種環(huán)境升高明顯,可能與微生物活動導(dǎo)致“陳化”現(xiàn)象有關(guān);在低溫低濕環(huán)境下“陳化”現(xiàn)象不明顯;而高溫高濕環(huán)境下可能在發(fā)生“陳化”現(xiàn)象的同時,杏花中復(fù)雜的成分間發(fā)生了相互作用,導(dǎo)致含量變化不大，有待進一步研究。故從杏花總體質(zhì)量綜合考慮,建議杏花選擇常溫常濕儲存。

本試驗首次采用正交試驗結(jié)合QAMS 法對杏花進行質(zhì)量控制,測定杏花中蘆丁、阿魏酸、異槲皮苷的含量,與外標法測得值沒有顯著性差異。表明所建立的方法有效可行,能實現(xiàn)對杏花中多種有效成分的質(zhì)量控制。