美洲大蠊配方顆粒特征圖譜方法建立

曾永禎，高 晗，孫福仁，田 方，李軍山 ，2*

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司，云南 楚雄 675000)

美洲大蠊為蜚蠊科昆蟲，俗稱蜚蠊，又稱蟑螂、偷油郎等，是一種十分古老的昆蟲，最早以蜚蠊之名載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明美洲大蠊具有促血管增生、組織修復(fù)、強(qiáng)心升壓、改善微循環(huán)、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫等作用[2-4]，并且以美洲大蠊藥材為原料開發(fā)出了許多國(guó)家系列新藥，如：康復(fù)新液、心脈龍注射液、肝龍膠囊等。

美洲大蠊主要含氨基酸類和核苷類成分。根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊中均含有17種以上氨基酸，其中包括7種必需氨基酸，2種半必須氨基酸和8種非必需氨基酸。核苷類有胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷等[5-7]。另外，美洲大蠊還含有蜚蠊酸、蟑螂油、過敏原成分、各種酶、細(xì)胞色素A、B、C、甲殼素、煙酸等。

近年來已有不少學(xué)者[8-10]，通過 HPLC或 UPLC法分析美洲大蠊藥材及其產(chǎn)品，為快速高效評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供了參考依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法建立 3 批美洲大蠊配方顆粒的特征圖譜，并標(biāo)定了尿嘧啶、酪氨酸、次黃嘌呤、肌苷4個(gè)特征峰。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CPA225D電子分析天平(賽多利斯股份公司，德國(guó))；KH-7200E超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 材料

美洲大蠊配方顆粒(云南神威施普瑞藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：1906151、1907241、1907284)。對(duì)照品：尿嘧啶(批號(hào)：100469-201302)，酪氨酸(批號(hào)：140609-201914)，次黃嘌呤(批號(hào)：140661-201704)，肌苷(批號(hào)：140669-201606)，均為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動(dòng)相A，以體積比3%甲醇溶液(含0.1%冰醋酸)為流動(dòng)相B，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃；以表1中的梯度洗脫條件進(jìn)行檢測(cè)，理論板數(shù)按肌苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取酪氨酸、尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含尿嘧啶0.05 mg、酪氨酸0.08 mg、尿嘧啶0.05 mg、次黃嘌呤0.1 mg、肌苷0.1 mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入85%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率150 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用85%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液15 mL，水浴蒸干，殘?jiān)铀m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法

分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5～10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。具體見圖1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取美洲大蠊配方顆粒，按照上述供試品溶液制備方法制備美洲大蠊配方顆粒供試品溶液，進(jìn)樣6次，結(jié)果各主要特征峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD為0.04%～2.48%之間，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取美洲大蠊配方顆粒，按照上述供試品溶液制備方法制備美洲大蠊配方顆粒供試品溶液，分別于制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)檢測(cè)，結(jié)果各主要特征峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD為0.15%～1.70%之間，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取美洲大蠊配方顆粒，按照上述供試品溶液制備方法制備美洲大蠊配方顆粒供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果各主要特征峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD為0.13%～1.96%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 樣品測(cè)定

取美洲大蠊配方顆粒適量，照“2.4”項(xiàng)下制備供試品溶液。另取尿嘧啶、酪氨酸、次黃嘌呤、肌苷對(duì)照品適量，照“2.3”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄尿嘧啶、酪氨酸、尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷保留時(shí)間，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表2。

注：對(duì)照品溶液(A)(1：尿嘧啶 2：酪氨酸 3：次黃嘌呤 5：肌苷)。

注：美洲大蠊配方顆粒樣品(B)。

表2 3批美洲大蠊配方顆粒特征圖譜測(cè)定結(jié)果

由表2可知，美洲大蠊配方顆粒特征圖譜有7個(gè)特征峰，與次黃嘌呤對(duì)照品參照物相對(duì)應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，RSD<2.0%，故規(guī)定：其他特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±10%范圍內(nèi)，規(guī)定值為：0.74(峰1)、0.95(峰2)、1.05(峰4)、1.11(峰5)、1.24(峰6)、1.50(峰7)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)美洲大蠊配方顆粒樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，比較不同波長(zhǎng)下色譜圖的峰數(shù)目與分離效果。結(jié)果表明，在254 nm波長(zhǎng)下美洲大蠊配方顆粒的峰數(shù)目較多且分離度良好，且溶劑峰影響小，因此將254 nm作為美洲大蠊配方顆粒特征圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究建立了美洲大蠊配方顆粒的特征圖譜測(cè)定方法，并標(biāo)定了尿嘧啶、酪氨酸、次黃嘌呤、肌苷4個(gè)特征峰，測(cè)定了3批美洲大蠊配方顆粒的特征圖譜，方法科學(xué)、穩(wěn)定、可靠。為美洲大蠊的產(chǎn)品提供了科學(xué)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)為完善美洲大蠊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了良好的基礎(chǔ)。