鈣磷濃度對白及種子萌發(fā)的影響

楊麗麗， 劉 海， 劉 筱， 孔 嬌， 莫遠(yuǎn)琪， 夏 與， 吳明開*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 現(xiàn)代中藥材研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550006； 3.安龍縣欣蔓生物科技有限責(zé)任公司，貴州 安龍 552400)

引言

【研究意義】白及(Bletillastriata)主要采集其塊莖干燥后入藥，是蘭科白及屬多年生草本植物[1]。其性苦、甘、澀，微寒，用藥歷史悠久，具有收斂止血、消腫生肌等功效，主要用于治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒和皮膚皸裂等病癥[2]，同時(shí)也在醫(yī)藥、化工、美容和保健等方面得到廣泛應(yīng)用[3-8]。白及是貴州道地藥材，而貴州是典型的喀斯特地貌，基巖中多為可溶性鹽類并且極富鈣(Ca)，同時(shí)土壤中磷(P)多數(shù)以難溶態(tài)存在，可以被植物直接吸收利用的有效磷含量低。因此，該環(huán)境下生長的白及遭受高 Ca、低P的雙重脅迫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】白及種子無胚乳，目前白及組培快繁體系尚不完善[9]，前人主要研究不同激素對白及種子的影響，如趙垚等[10]研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑對白及種子萌發(fā)及生長的影響。周雨等[11]研究了不同激素對白及種子無菌萌發(fā)生長的影響?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】到目前為止，鈣、磷不同濃度對白及種子萌發(fā)的影響尚未見報(bào)道，研究鈣、磷不同濃度脅迫下白及種子的萌發(fā)情況，對白及在貴州地區(qū)的種植和生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】探明高鈣、低磷對白及種子無菌萌發(fā)的影響，揭示白及對巖溶生境高鈣、低磷環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，為優(yōu)化白及組培育苗技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白及蒴果采于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材資源圃，原植物經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為蘭科植物白及(Bletillastriata)。

1.1.2 試劑 碘化鉀(分析純)、五水硫酸銅、磷酸二氫鉀，購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸錳，購自重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；硼酸、乙二胺四乙酸二鈉、肌醇、甘氨酸，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸鋅，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；鉬酸鈉，購自天津市化學(xué)試劑四廠；氯化鈷，購自天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；硫酸亞鐵、氯化鈣，購自成都市科龍化工試劑廠；VB1、VB6，購自上海山浦化工有限公司；煙酸，購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；硝酸鉀，購自重廣江川化工有限公司；硝酸銨，購自西隴化工股份有限公司；七水硫酸鎂，購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；6-BA，購自如吉生物科技；NAA，購自北京鼎國生物科技有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器MLS-3750 日本三洋(SANYO)全自動高壓蒸汽滅菌器(上海道薩生物科技發(fā)展有限公司)，SW-CJ-1G型單人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，尼康體視顯微鏡SM800N。

1.2 培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)條件

MS培養(yǎng)基中加入無水氯化鈣3.2 g/L，磷酸二氫鉀1.7 g/L。配制缺鈣的MS培養(yǎng)基，分別加入1/2倍鈣、1倍鈣、1.5倍鈣、2倍鈣、2.5倍鈣、3倍鈣；配制缺磷的MS培養(yǎng)基，分別加入1/8倍磷、1/4倍磷、1/2倍磷、1倍磷、1.5倍磷；將配制培養(yǎng)基置于121℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻待用。

1.3 果實(shí)預(yù)處理

將流水沖洗成熟未開裂的白及蒴果瀝干，在超凈臺上分別利用75%乙醇溶液、8% NaClO溶液進(jìn)行表面消毒1 min、10 min，再用無菌水沖洗4～6次[12]，然后用滅菌剪刀在白及碩果上開小口。

1.4 種子培養(yǎng)

將預(yù)處理的果實(shí)用鑷子夾緊蒴果表面，輕輕將粉末狀的種子均勻抖落至培養(yǎng)基表面，放置入溫度(25±1)℃、光照度1 200 lx、光/暗周期為12 h/12 h的環(huán)境下培養(yǎng)。期間觀察白及種子形態(tài)以及萌動期和發(fā)芽期的動態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及種子形態(tài)

肉眼下白及種子極小，黃褐色。10倍顯微鏡下呈兩端稍尖的紡錘形，中間有一細(xì)小橢圓狀的胚，無胚乳。30倍顯微鏡下種子的胚外層具有透明的種皮，種皮為一層薄壁細(xì)胞，細(xì)胞透明，無內(nèi)容物[13]，種皮有薄有厚(圖1)。

圖1 放大10 倍和30 倍的白及種子

2.2 萌動期動態(tài)

白及種子接種至培養(yǎng)基后開始吸水膨脹，種胚和種皮膨大。接種5 d時(shí)開始明顯吸脹，且高鈣濃度處理的種子吸脹較快，而低磷濃度對種子吸脹無明顯促進(jìn)作用。接種10 d種子顏色由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。隨著鈣濃度的增加白及種子膨脹體積越大(圖2)；低磷處理?xiàng)l件下，白及種子也在吸脹，逐漸膨大。但各濃度間無明顯差距(圖3)。由圖2、圖3可見，接種10 d白及種皮仍完整，白及種子先經(jīng)歷吸脹作用，待其膨大、轉(zhuǎn)綠后突破種皮。白及種子的胚不斷膨大，當(dāng)接種15 d時(shí)，部分種子沖破種皮，發(fā)育成圓球莖并不斷長大，種皮因此沿著長軸被不斷撕開，其他部分保持相對完整。

圖2 鈣處理播種10 d的白及種子(2×10 倍)

圖3 磷處理播種10 d的白及種子(2×10 倍)

2.3 發(fā)芽期動態(tài)

培養(yǎng)至20 d時(shí)，大部分種子已突破種皮，并形成子葉，甚至有的圓球莖尾部長出很細(xì)的根。由圖4可見，在加入2倍鈣、2.5倍鈣、3倍鈣中的幼苗長出第2片子葉。培養(yǎng)至30 d時(shí)，在不同磷濃度的培養(yǎng)基中，1/2磷濃度條件下長出第2片子葉(圖5)，而低濃度磷對子葉生長起促進(jìn)作用。

圖4 鈣處理播種30 d的白及種子(4×10 倍)

圖5 磷處理播種30 d的白及種子(4×10 倍)

3 討論

白及種子自然條件下萌發(fā)率極低，應(yīng)用和開發(fā)繁殖技術(shù)體系以保護(hù)白及資源及開展規(guī)?；a(chǎn)。試驗(yàn)配制缺鈣、磷和鈣、磷不同濃度的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)白及種子，5 d后開始吸脹，第10天白及種子逐漸膨大，但各濃度間無明顯差距。說明，萌發(fā)10 d是白及種子的膨脹期，適當(dāng)增加鈣濃度可促進(jìn)白及種子體積膨大，磷濃度對其影響不大，且高鈣、低磷處理的種子均發(fā)育較快。隨著鈣濃度的增加，白及種子的吸脹、萌動、發(fā)芽均呈明顯促進(jìn)作用，而在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著鈣濃度的增加，促進(jìn)作用越明顯。說明，白及種子對于喀斯特地區(qū)高鈣環(huán)境有較好的適應(yīng)性。低磷處理時(shí)，吸脹、萌動期有促進(jìn)作用，在發(fā)芽期1/2倍磷也促進(jìn)子葉的萌發(fā)。說明白及種子對于喀斯特地區(qū)低磷環(huán)境同樣有較好的適應(yīng)性。因此，貴州喀斯特地區(qū)高鈣低磷土壤環(huán)境適合白及種子萌發(fā)。

4 結(jié)論

鈣、磷不同濃度的MS培養(yǎng)基接種第5天時(shí)白及種子均開始明顯吸脹，且高濃度鈣對白及種子吸脹有促進(jìn)作用，而低濃度磷對種子吸脹影響較小；接種第10天不同培養(yǎng)基種子顏色由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色；接種第20天不同培養(yǎng)基大部分種子已突破種皮，并形成子葉，甚至有的圓球莖尾部長出很細(xì)的根。在加入2倍鈣、2.5倍鈣、3倍鈣培養(yǎng)基中的幼苗長出第2片子葉；1/2磷培養(yǎng)基中長出第2片子葉。適當(dāng)增加鈣濃度可促進(jìn)白及種子無菌萌發(fā)后子葉生長，且隨著鈣濃度的增大子葉生長加快；適當(dāng)減小磷濃度可促進(jìn)子葉生長。