長基因間非編碼RNA963不同可變剪接體在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)和作用*

杜洪， 夏萬松， 韋四喜,， 夏英,3， 金泳， 李紅羽， 袁婷， 黃海,***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550001)

胃癌(gastric cancer，GC)是世界上常見的惡性腫瘤之一[1]。由于GC起病隱匿，無典型臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致GC被發(fā)現(xiàn)時常常已是中晚期，患者往往錯失了最佳手術(shù)治療時機[2]。因此，迫切需要深入挖掘GC發(fā)生發(fā)展的分子機制，以期尋找有效的GC早期診斷分子標(biāo)志物及相應(yīng)的治療靶點。長鏈非編碼核糖核酸(long noncoding ribonucleic acid，lncRNA )是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成的一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子[3]，研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]，本課題組前期研究也表明小核仁RNA宿主基因16(small nucleolar RNA host gene 16,SNHG16)和GC增殖增強轉(zhuǎn)錄本1(gastric carcinoma proliferation enhancing transcript 1,GHET1)可促進(jìn)GC的惡性進(jìn)程[6-8]。長基因間非編碼RNA963(long intergenic non-protein coding RNA 963，LINC00963)定位于人染色體9q34.11，國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫報道僅有1個可變剪接體(alternative splice variant，V)，有研究顯示該基因在肺癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)，可參與腫瘤的惡性進(jìn)程[9-11]，但LINC00963基因是否調(diào)控以及如何調(diào)控GC發(fā)生發(fā)展機制卻報道較少。因此，本研究通過克隆測序檢測LINC00963存在的多個V，分析其蛋白編碼能力、并檢測其在GC細(xì)胞系中的表達(dá)量，同時利用基因沉默技術(shù)進(jìn)一步研究LINC00963不同V的功能，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細(xì)胞來源 GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC-803及胃正常黏膜細(xì)胞系GES-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(上海生工生物)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)及PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(日本，Takara)，F(xiàn)irstChoice RLM-RACE Kit和Lipofectamine?RNAiMAX Reagent(美國Invitrogen)，BCL2相關(guān)X凋亡調(diào)節(jié)因子(BCL2 associated X apoptosis regulator， Bax)、BCL2凋亡調(diào)節(jié)因子(BCL2 apoptosis regulator，Bcl-2)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartate-specific protease 3，Caspase-3；美國Abcam)；LightCycler480熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(瑞士羅氏)，凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD)，臺式冷凍離心機和普通PCR儀(美國Thermo Fisher)，DYY-Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器)，化學(xué)發(fā)光儀(上海培清)。

1.1.3引物和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)合成 實驗所用引物及siRNA均由上海生工生物股份有限公司合成，以次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1，HPRT)為內(nèi)參，具體序列見表1和表2。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence

表2 si-RNA序列Tab.2 si-RNA sequence

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC-803及胃黏膜細(xì)胞系GES-1培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，含5%CO2、37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2常規(guī)PCR及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR) 常規(guī)PCR反應(yīng)采用3步法：95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，擴增40個循環(huán)擴增GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC-803及胃黏膜細(xì)胞系GES-1，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行克隆測序。qRT-PCR擴增反應(yīng)采用兩步法：95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。采用2-△△Ct分析GC細(xì)胞系A(chǔ)GS、MKN45、HGC-27、MGC-803及胃黏膜細(xì)胞系GES-1中基因的相對表達(dá)量，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)實驗 取“1.2.2”項下已提取的RNA按試劑盒說明書操作進(jìn)行RACE實驗，RACE產(chǎn)物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA后用于常規(guī)PCR反應(yīng)下游引物用LINC00963-R1557。PCR反應(yīng)采用3步法：95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，擴增40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分離后切膠送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行克隆測序。

1.2.4蛋白編碼潛力預(yù)測 測序數(shù)據(jù)采用SnapGene軟件讀取，并應(yīng)用基礎(chǔ)比對搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)進(jìn)行序列比對分析，采用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)開放閱讀框查找工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析V蛋白質(zhì)編碼潛力。

1.2.5免疫印跡分析 GC細(xì)胞HGC-27培養(yǎng)于6孔板中，設(shè)置si-NC、si-V1-a、si-V1-b及si-V1-a+b組。50%密度轉(zhuǎn)染siRNA 72 h后，提取蛋白，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)印于聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，使用牛奶封閉、相應(yīng)一抗孵育過夜，最后孵育二抗并采用辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光劑曝光，收集并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 未見報道的LINC00963 V

LINC00963-F598/R739引物擴增時發(fā)現(xiàn)該擴增產(chǎn)物大小與理論不符，測序發(fā)現(xiàn)該基因轉(zhuǎn)錄本第2外顯子5′端多出59個堿基、且與第1內(nèi)含子3′端59個堿基完全匹配。應(yīng)用LINC00963-F503/R1557擴增發(fā)現(xiàn)存在多個擴增產(chǎn)物，切膠測序證實至少存在3個NCBI未收錄的V，分別命名為LINC00963-V1(第三外顯子缺失、第2外顯子多59個堿基，且R711引物設(shè)在其中)、LINC00963-V2(第3外顯子缺失)及LINC00963-V3(第2、3外顯子缺失)。見圖1。

注：A為LINC00963可變剪接電泳圖，1、2泳道表示HPRT理論長度125 bp，3、4泳道表示LINC00963-F687/R807理論長度121 bp，5、6泳道表示LINC00963-F687/R1557理論長度871 bp，7、8泳道表示LINC00963-F598/ R711理論長度123 bp；B為LINC00963可變剪接電泳圖，LINC00963-F503/R1557理論長度1 054 bp；C為LINC00963可變剪接體示意圖，數(shù)字代表引物開始第一個堿基在野生型序列的堿基位置，方框代表外顯子，線段代表內(nèi)含子。圖1 LINC00963V的電泳結(jié)果及示意圖Fig.1 Schematic diagram of LINC00963 V

2.2 LINC00963不同V在GC細(xì)胞系中的表達(dá)

設(shè)計引物使得引物可擴增單一V，與胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)LINC00963-V1、LINC00963-V2主要在GC細(xì)胞系HGC-27中高表達(dá)(P<0.05)，并將qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。見圖2。

注：A為在GC細(xì)胞株中全部V和V1、V2的相對表達(dá)量；B為瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，1～5泳道為內(nèi)參基因，6～10泳道為全部V，11～15泳道為V1，16～20泳道為V2，第1、6、11、16泳道模板為GES-1，第2、7、12、17泳道模板均為AGS，第3、8、13、18泳道模板為MKN45，第4、9、14、19泳道模板為HGC-27，第5、10、15、20泳道模板為MGC803；與GES-1細(xì)胞比較，(1)P<0.001，(2)P<0.01。圖2 GC細(xì)胞系中LINC00963 V基因的表達(dá)Fig.2 Expression of LINC00963 V in GC cell lines

2.3 LINC00963不同V的5′RACE表征

測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析表明前期所發(fā)現(xiàn)未見報道V明確存在，且該基因轉(zhuǎn)錄本5′端發(fā)現(xiàn)比NCBI已收錄轉(zhuǎn)錄本更短；通過NCBI開放閱讀框查找器對新發(fā)現(xiàn)V的蛋白編碼能力進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LINC00963多個V蛋白編碼能力較弱或不具備蛋白編碼能力，該基因新發(fā)現(xiàn)的V極有可能也是非編碼RNA。見圖3。

注：A為5′RACE產(chǎn)物運用LINC00963-R1557引物擴增后克隆測序分析，NR_038955.1為NCBI已收錄轉(zhuǎn)錄本，其余5個為LINC00963 5′RACE擴增發(fā)現(xiàn)的不同轉(zhuǎn)錄起始位點，數(shù)字代表起始位點；B為NCBI 開放閱讀框查找器分析結(jié)果，紅色表示可能存在的開放閱讀框，藍(lán)色方框表示所預(yù)測結(jié)果中開放閱讀框最長的一段，白色箭頭代表翻譯方向。圖3 LINC00963不同V的5′RACE克隆測序分析Fig.3 Cloning and sequencing of LINC00963 V by 5′RACE

2.4 HGC-27細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)

蛋白免疫印跡檢測結(jié)果表明，與si-NC組比較，si-V1-a組、si-V1-b組及si-V1-a+b組敲低LINC00963-V1后，HGC-27細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)增加、BCL-2表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；si-V1-a組、si-V1-b組敲低LINC00963-V1后，HGC-27細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為免疫印跡法檢測結(jié)果，B為凋亡相關(guān)蛋白的定量結(jié)果；與NC組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05，(3)P<0.001。圖4 敲低LINC00963-V1后HGC-27細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化Fig.4 Expression of apoptosis related proteins in HGC-27 cells after knockdown of LINC00963-V1

3 討論

本研究結(jié)果表明LINC00963存在多個未見報道的V，為了進(jìn)一步深入分析LINC00963存在于GC中的V，本研究進(jìn)行了5′RACE、克隆測序及qRT-PCR實驗，并檢測到LINC00963明確存在多個未見報道或NCBI尚未收錄的V在GC中表達(dá)，研究結(jié)果表明LINC00963存在新的V且V1、V2在GC細(xì)胞系中高表達(dá)。

LINC00963基因定位于染色體9q34.11，研究表明LINC00963基因在腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色[12-13]。LINC00963基因的表達(dá)失調(diào)往往預(yù)示著一些腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，病情的惡化[14-16]，越來越多的研究表明LINC00963與miRNA相互作用，充當(dāng)分子海綿的作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9,17-21]。本研究結(jié)果顯示，在GC中LINC00963基因存在多個未見報道的新的V，蛋白質(zhì)編碼能力較弱、表達(dá)失調(diào)，可能參與GC的惡性進(jìn)程。真核生物基因表達(dá)是一個極為精細(xì)及復(fù)雜的過程，研究表明人類的基因數(shù)量范圍2～3萬個，但是蛋白質(zhì)的類型卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于基因，很大原因與RNA可變剪接修飾相關(guān)[22]。同一基因可產(chǎn)生不同的V，從而翻譯出不同的蛋白質(zhì)發(fā)揮不同的功能[23-24]。也有研究指出LINC00963在肺癌中存在NCBI尚未收錄的V，僅5′端減少了部分堿基且在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，參與肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移等分子機制[9]。也有研究顯示LINC00963在乳腺癌中發(fā)揮重要功能，但通過BLAST比對文章所提供引物，發(fā)現(xiàn)引物無法與模板匹配，或許在其他腫瘤中還存在其他V形式[25]。依據(jù)NCBI已收錄LINC00963基因RNA序列設(shè)計引物擴增時，本研究發(fā)現(xiàn)在GC細(xì)胞系中存在多個未見報道的V；運用qRT-PCR檢測不同V發(fā)現(xiàn)主要在HGC-27細(xì)胞株中高表達(dá)，提示可能參與GC更為重要的分子機制。5′RACE實驗發(fā)現(xiàn)LINC00963-V1是一類存在多個轉(zhuǎn)錄起始位點的V，但未見V2、V3，可能與V2、V3表達(dá)相對較低有關(guān)；同時NCBI開放閱讀框查找器分析LINC00963多個V，結(jié)果顯示該基因蛋白編碼較弱，提示LINC00963基因在發(fā)生可變剪接后依然以非編碼RNA的形式參與細(xì)胞功能。

本研究結(jié)果表明，在胃癌細(xì)胞系HGC-27中LINC00963-V1表達(dá)最高，后選擇V1作為主要研究對象。敲低LINC00963-V1后觀察到細(xì)胞密度較NC組低且死細(xì)胞較多，懷疑LINC00963-V1可能參與GC細(xì)胞抗凋亡的機制。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)敲低LINC00963-V1后促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，Caspase-3被激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bcl-2家族蛋白中Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加，誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白分子在細(xì)胞凋亡的機制中扮演著非常重要的角色，研究報道Bcl-2家族蛋白在線粒體上對細(xì)胞凋亡發(fā)揮著對凋亡形成因子的釋放調(diào)節(jié)功能，Bcl-2表達(dá)增加則抑制凋亡形成因子釋放，抑制細(xì)胞凋亡；Bax表達(dá)增加則促進(jìn)凋亡形成因子釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Caspase-3更是凋亡機制中重要的功能執(zhí)行者[26-27]。本研究的結(jié)果表明LINC00963-V1可以通過影響B(tài)cl-2家族蛋白和Caspase-3蛋白直接或間接抑制細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)程中發(fā)揮著促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明LINC00963在GC中存在的多個未見報道的V，且LINC00963可能通過誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)GC凋亡。