葉酸對阿爾茨海默病的影響及其機(jī)制研究進(jìn)展

李劍飛，郭錫漢，薛京倫，汪 旭，*

(1．云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650500；2．復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所，上海201438)

葉酸(folate)為B族水溶性維生素，作為一碳代謝的一組甲基傳遞體，參與嘌呤、嘧啶合成，以及DNA和各種生物分子甲基化反應(yīng)。氧化型葉酸經(jīng)一系列還原過程形成5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-methylenetetrahydrofolate，5,10-MeTHF)，為dUMP轉(zhuǎn)化為dTMP提供甲基；5,10-MeTHF隨即還原為5-甲基四氫葉酸，為甲硫氨酸(methionine，Met)提供甲基，合成生物體重要甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)，保證DNA精準(zhǔn)合成。因此，葉酸攝入及代謝異常與DNA、染色體的結(jié)構(gòu)和功能紊亂息息相關(guān)，是發(fā)育異常、退行性疾病、腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵風(fēng)險因子。據(jù)報道，帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的發(fā)生發(fā)展均與葉酸供給和代謝狀態(tài)相關(guān)。

AD是一種記憶、學(xué)習(xí)、注意力、人格、空間感等認(rèn)知功能漸進(jìn)性破壞乃至喪失的神經(jīng)退行性病變，其主要組織病理學(xué)特征是大腦不溶性淀粉樣蛋白斑塊和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成與漸進(jìn)性惡化，二者的核心組分分別是β-淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)和高度磷酸化的微管結(jié)合蛋白tau，它們的異常增加是AD發(fā)生發(fā)展的主要生物學(xué)標(biāo)志。本文圍繞葉酸對Aβ和tau生成過程的生物學(xué)作用，綜述葉酸對AD患病風(fēng)險的影響與可能機(jī)制，為AD防范奠定營養(yǎng)干預(yù)依據(jù)。

1 血清葉酸和同型半胱氨酸水平與AD

多項分子流行病學(xué)研究提示，一碳代謝組分中的各種甲基傳遞體、輔酶和相關(guān)微營養(yǎng)素與AD的發(fā)生發(fā)展有著錯綜復(fù)雜的聯(lián)系，一碳代謝核心組分葉酸的攝入及其代謝狀態(tài)與老年人的認(rèn)知水平變化、AD風(fēng)險具有顯著關(guān)聯(lián)。意大利一項以60歲以上、已出現(xiàn)認(rèn)知障礙的人群為對象的回顧性調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)血清葉酸含量與認(rèn)知能力呈正相關(guān)，葉酸水平較高(3～4 ng/mL)的個體認(rèn)知能力顯著高于低葉酸個體(＜2.2 ng/mL)，而一碳代謝中Met合成的底物之一，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的高水平(＞17.68 μmol/L)則與認(rèn)知障礙的惡化程度正相關(guān)。Ma等在病例對照研究中對比了134名中國健康老年人、129名輕度認(rèn)知障礙患者(mild cognitive impairment，MCI)和131名AD患者的血清葉酸濃度，發(fā)現(xiàn)3個群體的葉酸濃度依次降低、與認(rèn)知狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)；該團(tuán)隊進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Hcy水平與認(rèn)知障礙惡化正相關(guān)，提示高水平Hcy不僅是心血管病的獨立風(fēng)險因子，其對于神經(jīng)細(xì)胞正常功能也存在負(fù)面效應(yīng)。Hama等根據(jù)簡易智力量表(mini-mental state examination，MMSE)評分，在日本45名血清葉酸缺乏(＜3.6 ng/mL)的認(rèn)知障礙患者中給予葉酸補(bǔ)充干預(yù)(5 mg/d，28～63 d)，干預(yù)后受試者M(jìn)MSE評分及輕度認(rèn)知障礙得到明顯改善，Hcy也在干預(yù)后顯著降低。Ravaglia等對平均年齡74歲的816名意大利健康人群隨訪4年，發(fā)現(xiàn)112名志愿者發(fā)展為MCI，其中70名罹患AD，關(guān)聯(lián)分析揭示低水平血清葉酸(＜11.8 nmol/L)、高Hcy水平(＞15 μmol/L)個體發(fā)展為MCI和AD的風(fēng)險顯著提高。

多個實驗室利用動物模型開展了葉酸與AD相關(guān)病理因素變化的關(guān)聯(lián)研究。Lawton團(tuán)隊通過不同劑量葉酸膳食干預(yù)12個月，發(fā)現(xiàn)無葉酸膳食組的CD-1小鼠較之葉酸添加組(50 μg/d)出現(xiàn)顯著的記憶障礙，海馬區(qū)與記憶相關(guān)

MafB

和

Zfp410

基因表達(dá)顯著下調(diào)。Troen等研究人員以無葉酸膳食飼喂大鼠10周，繼而進(jìn)行認(rèn)知狀態(tài)、血液學(xué)和生化分析。發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏使受試大鼠空間學(xué)習(xí)與認(rèn)知功能損害，補(bǔ)充Met可一定程度逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，提示一碳代謝各種組分對認(rèn)知狀態(tài)改變、AD發(fā)生的影響具有多樣性和復(fù)雜性。Yang等為孕期小鼠補(bǔ)充葉酸(5 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)生較對照得到更好地維護(hù)、后代的學(xué)習(xí)與記憶能力顯著提高。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是平衡一碳代謝中DNA合成與甲基化過程的關(guān)鍵酶(圖1)。Bahous團(tuán)隊用

MTHFR

多態(tài)性小鼠模型評價了遺傳變異和營養(yǎng)失衡對葉酸代謝及AD發(fā)生發(fā)展過程的影響，發(fā)現(xiàn)

MTHFR

C677T突變使受試動物短期記憶損傷和焦慮、突觸標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄水平異常，葉酸缺乏膳食還誘發(fā)甲基供體SAM水平降低，與Aβ加工、神經(jīng)生長因子、一碳代謝和表觀修飾相關(guān)基因如

圖1 一碳代謝途徑示意圖

PS1

、

Ngf

、

Bdnf

、

Hdacs

、

DNMTs

、

Nmda

、

nr1

、

Mat2a

、

Pemt

和

Chdh

均出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄異常。這項研究進(jìn)一步提示葉酸對于維持正常甲基化、核苷酸和神經(jīng)遞質(zhì)合成、良好認(rèn)知狀態(tài)具有重要作用。甲基轉(zhuǎn)移酶是維護(hù)一碳代謝和機(jī)體甲基化反應(yīng)的重要酶系，其成員

DNMT1

和

DNMT3a

均可在神經(jīng)元中表達(dá)。Feng等構(gòu)建了條件性敲除

DNMT1

或/和

DNMT3a

的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)雙敲除小鼠海馬神經(jīng)元體積較對照小、學(xué)習(xí)記憶缺陷、DNA甲基化程度顯著降低、與突觸可塑性相關(guān)的

MHCI

和

Stat1

表達(dá)失調(diào)，結(jié)果提示

DNMT1

和

DNMT3a

是維持DNA甲基化、調(diào)節(jié)神經(jīng)元基因表達(dá)、維系突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶必不可少的因素。有研究以質(zhì)譜法分析了17位過世的AD個體前額葉皮質(zhì)組織和外周血淋巴細(xì)胞12個潛在AD易感基因位點(

APH1B

、

APOE

、

SIN3A

、

BACE

、

HTATIP

、

APP

、

NCSTN

、

TFAM

、

DNMT1

、

MTHFR

、

PSEN1

)的DNA甲基化改變，發(fā)現(xiàn)

MTHFR

啟動子區(qū)的甲基化水平顯著升高；還有團(tuán)隊在AD逝者腦組織解剖分析中發(fā)現(xiàn)，海馬區(qū)細(xì)胞的

DNMT1

和

DNMT3a

表達(dá)水平顯著下調(diào)、全基因組甲基化水平顯著降低，這些結(jié)果提示

MTHFR

所控制的DNA合成與甲基化反應(yīng)，以及甲基轉(zhuǎn)移酶對甲基化反應(yīng)的維系功能紊亂均和AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。

2 葉酸對Aβ代謝過程的影響

Aβ的前體為跨膜蛋白APP(amyloid precursor protein)，其降解通常包括淀粉樣和非淀粉樣途徑。在非淀粉樣降解途徑中，APP首先被α-分泌酶切割成N端片段sAPPα和C端片段α-CTF，α-CTF隨后經(jīng)γ-分泌酶(presenilin 1，PS1)切割形成P3和胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域AICD；在淀粉樣降解途徑中，APP經(jīng)β-分泌酶(BACE1)切割成AICD和sAPPβ，后者被γ-分泌酶進(jìn)一步分解為Aβ，后續(xù)形成含38～43個氨基酸的Aβ(圖2)。Aβ和Aβ是含量最高的Aβ異構(gòu)體，Aβ具有更強(qiáng)疏水性、聚合性和神經(jīng)毒性。Aβ的生成和清除過程異常可導(dǎo)致Aβ沉積、形成寡聚體和斑塊，引起海馬區(qū)和相關(guān)大腦皮層的神經(jīng)元凋亡、突觸連接喪失，是AD發(fā)生的高風(fēng)險因素。

圖2 淀粉樣蛋白斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成過程示意圖

BACE1和PS1是降解APP、加工合成不同大小Aβ片段的重要角色。Fuso課題組探索了表觀遺傳修飾對

PS1

和

BACE1

啟動子甲基化與淀粉樣蛋白生成在AD發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制，先后在AD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)高濃度Hcy與低水平B族維生素引起的一碳代謝異常使得轉(zhuǎn)基因小鼠

PS1

和

BACE1

基因低甲基化、表達(dá)上調(diào)。Li等研究人員也開展了葉酸對

APP/PS1

轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型Aβ水平影響的探索。他們以葉酸缺乏膳食、葉酸和/或SAM正常膳食飼喂小鼠60 d，發(fā)現(xiàn)葉酸強(qiáng)化飼喂(120 μg/kg)使受試動物血清葉酸提高，葉酸缺乏小鼠補(bǔ)充葉酸后，其DNMT活性、

APP

和

PS1

啟動子甲基化程度均不同程度提高。研究均認(rèn)為葉酸通過提高DNMT酶活性而加強(qiáng)相關(guān)基因啟動子甲基化、最終可能介導(dǎo)APP、PS1和Aβ水平的下降。研究人員還以Aβ-葉酸共培養(yǎng)小鼠海馬細(xì)胞HT-22，發(fā)現(xiàn)Aβ寡聚物降低細(xì)胞的DNMT活性、上調(diào)

PS1

和

APP

的表達(dá)，葉酸則在一定程度上消減Aβ生成聚集誘發(fā)的神經(jīng)毒性；該團(tuán)隊還為

APP

/

PS1

轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型加強(qiáng)葉酸[600 μg/(kg·d)]，發(fā)現(xiàn)

PS1

和

APP

啟動子甲基化水平均得到提升、表達(dá)活性降低。然而有報道卻稱，在意大利的120名晚發(fā)性AD患者和115名對照的外周血基因組中分析了

PS1

、

BACE1

、

DNMT1

、

DNMT3a

、

DNMT3b

和

MTHFR

基因的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)上述基因的甲基化情形在病例-對照組間未出現(xiàn)顯著差異。因此，一碳代謝組分變異、甲基轉(zhuǎn)移酶的活性改變對于不同組織細(xì)胞的Aβ生成代謝、AD的影響還需要在不同實驗系統(tǒng)、不同物種和組織中更縝密地深入剖析。MTHFR對于DNA合成與甲基化平衡、SAM合成、Hcy正常水平的維護(hù)具有不可替代的作用，

MTHFR

677TT純合突變型導(dǎo)致酶活降低近70%。分子流行病學(xué)提示

MTHFR

C677T多態(tài)性與晚發(fā)性AD患病風(fēng)險的增高相關(guān)。APP的Thr668位點磷酸化強(qiáng)度改變，可使APP分解為sAPPβ及sAPPα的平衡紊亂，嚴(yán)重干擾Aβ代謝。Hoffman團(tuán)隊探索了MTHFR功能缺陷所介導(dǎo)的APP分子Thr668位點磷酸化的改變，研究以正常葉酸和低葉酸膳食飼喂

MTHFR

、

MTHFR

和

MTHFR

小鼠6個月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低葉酸組中，

MTHFR

和

MTHFR

小鼠蛋白激酶GSK-3β被激活、蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)去甲基化和APP的Thr668位點磷酸化水平上升。

MTHFR

遺傳缺陷、GSK-3活化，PP2A去甲基化和APP的Thr668位點磷酸化可能構(gòu)成Aβ病理性加工的一條機(jī)制鏈條。

MTHFR

多態(tài)性與膳食葉酸缺乏的相互作用可能損傷神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)并增加AD患病風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體葉酸水平變化可調(diào)控特異性miRNAs表達(dá)，從而介導(dǎo)其靶基因表達(dá)改變，引起相應(yīng)的健康效應(yīng)。我們圍繞葉酸缺乏與miR-22-p和miR-149-5p表達(dá)的關(guān)系、以及2種miRNAs對

MTHFR

的靶向調(diào)控開展了大量工作，發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏可以通過上述2種miRNA的表達(dá)改變而介導(dǎo)MTHFR功能紊亂。根據(jù)前述討論，不排除葉酸水平的改變可通過miRNA表達(dá)而影響AD風(fēng)險的潛能。目前已有一系列的研究，報道了靶向

PS1

、

APP

和

BACE1

的miRNAs如miR-126-3p、miR-335-5p、miR-4422-5P、miR-188-3p、miR-339-5p、miR-200b-3p、miR-106a-5p等。其 中miR-339-5p、miR-200b-3p、miR-106a-5p和miR-339-5p可以響應(yīng)葉酸缺乏，靶向并調(diào)控

PS1

、

APP

和

BACE1

對Aβ生成與加工過程。Liu等以

APP

/

PS1

轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，探討葉酸缺乏和正常膳食對miRNA及其靶基因

APP

和

BACE1

的影響。發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏下調(diào)miR-200b-3p、miR-106a-5p和miR-339-5p表達(dá)，從而解除相關(guān)miRNAs對

APP

和

BACE1

的表達(dá)抑制，促進(jìn)Aβ生成加工與聚集。在離世的AD患者腦組織中，也發(fā)現(xiàn)miR-339-5p水平下降，在離體實驗中抑制miR-339-5p表達(dá)后，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的

BACE1

表達(dá)水平上升，提示miRNA響應(yīng)機(jī)體微環(huán)境變化并介導(dǎo)AD發(fā)生發(fā)展的可能性。

3 葉酸對tau代謝過程的影響

tau是由

MAPT

編碼、存在于神經(jīng)元的一種微管結(jié)合蛋白，其與微管蛋白結(jié)合，參與微管裝配，對于細(xì)胞骨架組裝、神經(jīng)元微管的動態(tài)平衡具有重要作用。正常狀態(tài)下，tau具有維持神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元極性等生理功能，人腦中的tau含多個潛在磷酸化位點，通常2～3個位點可被磷酸化。而在AD患者腦組織內(nèi)蛋白磷酸酯酶PP2A活性下降，蛋白激酶GSK-3β活性增強(qiáng)，磷酸化-去磷酸化平衡紊亂，導(dǎo)致tau過度磷酸化并與微管脫離、自聚合形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)。NFT具有神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙乃至細(xì)胞死亡，是AD的關(guān)鍵生物標(biāo)志之一。Sontag課題組揭示了葉酸缺乏對PP2A甲基化的影響與機(jī)制，以正常葉酸(1 mg/L)、低葉酸(0.01 mg/L)和無葉酸(0 mg/L)條件分別干預(yù)不同遺傳修飾的鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)無葉酸狀態(tài)下調(diào)

LCMT-1

轉(zhuǎn)錄、PP2A甲基化及其亞基Bα濃度，細(xì)胞凋亡壞死頻率增加；過表達(dá)

LCMT-1

或

B

α，均可以緩解無葉酸狀態(tài)誘發(fā)的PP2A去甲基化和tau磷酸化；該團(tuán)隊對C57BL/6J小鼠飼以正常葉酸(6.7 mg/kg)、低葉酸(0.2 mg/kg)或無葉酸飲食2個月，發(fā)現(xiàn)小鼠前額葉皮質(zhì)、中腦和小腦神經(jīng)元PP2A甲基化水平降低、

LCMT-1

的下調(diào)。葉酸缺乏對于

LCMT-1

表達(dá)、Bα水平均具有負(fù)面影響。

Li等研究人員通過探討葉酸對tau磷酸化的影響，剖析可能存在的葉酸-PP2A-tau磷酸化-AD患病風(fēng)險軸。研究以不同濃度葉酸(0～40 μmol/L)干預(yù)人SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞模型96 h，其間以10 nmol/L磷酸酯酶抑制劑(OA)暴露9 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA處理細(xì)胞的tau-Ser396位點磷酸化程度隨葉酸濃度的增加而被抑制，在葉酸40 μmol/L時抑制效應(yīng)最佳；研究還分析了葉酸干預(yù)后細(xì)胞的PP2A活性，發(fā)現(xiàn)隨著葉酸濃度增加，PP2A亞單位PP2Ac分子Leu309位點低甲基化被逆轉(zhuǎn)、tau磷酸化水平下降，研究提出了葉酸通過抑制PP2A去甲基化而下調(diào)tau磷酸化、降低AD風(fēng)險的假說。

為揭示2型糖尿病患者中的AD發(fā)病率高于正常人群的機(jī)制，Zheng等以葉酸缺乏(0 mg/kg)、常規(guī)葉酸(15 mg/kg)、高葉酸膳食(15 mg/kg+120 μg/kg)，即在常規(guī)基礎(chǔ)上額外補(bǔ)充葉酸干預(yù)經(jīng)鏈佐霉素建模的糖尿病小鼠8周，發(fā)現(xiàn)高濃度葉酸干預(yù)能顯著降低糖尿病小鼠腦內(nèi)tau的Ser396位點過度磷酸化、PP2A甲基化、DNMT轉(zhuǎn)錄上調(diào)，葉酸通過調(diào)節(jié)糖尿病小鼠PP2A甲基化而降低tau磷酸化的結(jié)果支持葉酸可能作為改善糖尿病患者認(rèn)知障礙的多靶點藥物。

4 結(jié)語與展望

國家統(tǒng)計局第七次全國人口普查數(shù)據(jù)顯示，我國60歲以上人口已達(dá)26 402萬人，占18.70%，其中，65歲及以上人口為19 064萬人，占13.50%，65歲及以上人口將成為增長最快的年齡組，人口老齡化程度進(jìn)一步加深。AD作為一種高度異質(zhì)性、病因復(fù)雜的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量、對公共健康和社會經(jīng)濟(jì)提出了日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。65歲以后人群是AD發(fā)病高峰人群，對于快速增長的老齡人口和沉重的照護(hù)負(fù)擔(dān)，如何從眾多維度有效預(yù)防或延遲AD的發(fā)生發(fā)展，是當(dāng)下社會面臨的緊迫問題！圍繞一碳代謝各類組分對腦細(xì)胞尤其是分化終端神經(jīng)元基因組結(jié)構(gòu)與表達(dá)的影響與機(jī)制，剖析一碳單位組分及遺傳變異對Aβ聚集和tau磷酸化、氧化脅迫與炎癥反應(yīng)、離子通道與微環(huán)境穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程相關(guān)基因、酶功能的影響與機(jī)制，甄別目前該領(lǐng)域研究成果吻合度不盡人意的瓶頸所在，將是防范AD、推進(jìn)公共健康發(fā)展的重要科學(xué)領(lǐng)域。