用于糞便DNA檢測(cè)的樣本保存液制作和效果評(píng)估

李 博，李改瑞，趙 偉，彭曉琳，*，趙 丹，彭 績(jī)

(1．深圳市南山區(qū)慢性病防治院腫瘤傷害與營(yíng)養(yǎng)科，廣東 深圳518054；2．海南省疾病預(yù)防控制中心，海南 ?？?70203；3．深圳市慢性病防治中心腫瘤防治科，廣東 深圳518020)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，雖然近年來(lái)其篩查手段已有了很大的進(jìn)步，但是我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率依然居高不下。結(jié)直腸癌具有患病率高、癌前病變(如息肉、腺瘤)界定明確，且發(fā)展到癌變需要較長(zhǎng)(10～15年)時(shí)間等特點(diǎn)，這為在出現(xiàn)臨床癥狀之前的早期干預(yù)提供了極好的機(jī)會(huì)。目前結(jié)直腸鏡取材標(biāo)本的病理學(xué)檢查還是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，由于其成本高、并發(fā)癥發(fā)生率高和手術(shù)的侵入性，使受試者的依從性普遍較低。糞便隱血試驗(yàn)因其成本較低，檢測(cè)方便、快捷，目前較廣泛地應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早篩早診，然而，其明顯不足的是對(duì)癌前病變(如息肉和腺瘤)及早期結(jié)直腸癌的篩查靈敏度較低。針對(duì)糞便樣本開(kāi)發(fā)結(jié)直腸癌早期篩查分子標(biāo)志物是目前結(jié)直腸癌無(wú)創(chuàng)早篩研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。但目前這種檢測(cè)整體存在價(jià)格較高的問(wèn)題，僅適用于特殊人群，篩查成本效益比偏低，其中樣本前期采集、處理、保存需要大量的運(yùn)輸成本及人力成本?；诖耍狙芯颗渲屏艘环N適用于結(jié)直腸癌大樣本人群篩查可以常溫運(yùn)輸保存的糞便樣本保存液，并對(duì)其保存糞便樣本中人源DNA完整性及抑制微生物增殖的效果進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

StepOne Plus熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀、NanoDrop One超微量分光光度計(jì)、Qubit 4熒光計(jì)和糞便樣本保存 液RNAlaterSolution，均 購(gòu) 于Thermo Fisher Scientific公司，糞便樣本基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于深圳市南科征途有限公司，dsDNA HS(高靈敏度)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司。

1.2 自制糞便保存液的組分及制作

自制糞便樣本保存液主要包括：細(xì)胞緩沖組分、離子螯合DNA穩(wěn)定組分和微生物防增殖組分等。其中細(xì)胞緩沖組分為三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris]、氯化鈉(sodium chloride)，離子螯合DNA穩(wěn)定組分為乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，微生物防增殖組分為硫酸銨(ammonium sulfate)及水組成。

首先制備三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液；其次制備乙二胺四乙酸溶液；再次制備氯化鈉溶液；最后將硫酸銨溶于水中加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液、乙二胺四乙酸溶液、氯化鈉溶液混合后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值得到成品(各組分濃度等相關(guān)技術(shù)細(xì)節(jié)正處于專利申請(qǐng)中，故不作詳細(xì)描述)。

1.3 糞便樣本的采集與處理

1.3.1 糞便樣本的保存和分組

1個(gè)健康受試者的新鮮糞便樣本均分為4份。實(shí)驗(yàn)組采用自制保存液與人糞便樣本1∶1體積混勻，1份室溫放置3 d，1份室溫放置7 d。對(duì)照組采集糞便樣本直接置于空管中，1份室溫放置1 h內(nèi)，1份室溫放置3 d。

1.3.2 不同凍融條件下自制糞便樣本保存液效果比較

3個(gè)健康志愿者(A/B/C)的新鮮便樣，用自制保存液與人糞便樣本1∶1體積混勻后，分別均分為5份，進(jìn)行如下處理：①室溫保存1 d、-80℃凍存6 d；②室溫保存2 d、-80℃凍存5 d；③室溫保存3 d、-80℃凍存5 d；④-80℃凍存7 d；⑤為對(duì)照組，室溫保存7 d。

1.3.3 自制保存液與RNAlater的效果比較

1個(gè)健康志愿者的新鮮便樣均分成6份，1份采集糞便樣本直接置于便樣采集空管，1份糞便樣本與RNAlater按1∶1體積混勻，其余4份糞便樣本與自制保存液1∶1體積混勻。置于保存液中的5份樣本均室溫放置7 d。

1.3.4 自制保存液用于保存結(jié)直腸癌早篩人群糞便樣本

隊(duì)列一：收集社區(qū)結(jié)直腸癌早篩人群新鮮糞便樣本434份，2～8℃冷鏈運(yùn)輸并分裝，當(dāng)天置于-80℃低溫冰箱保存。隊(duì)列二：采用自制保存液收集社區(qū)結(jié)直腸癌早篩人群新鮮糞便樣本501例，常溫運(yùn)輸，3 d內(nèi)轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.4 糞便樣本核酸保存質(zhì)量檢測(cè)

1.4.1 糞便DNA提取

按照糞便樣本基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟，抽提糞便中腸道細(xì)胞的DNA樣本，體積約50 mL。

1.4.2 糞便DNA定性檢測(cè)

采用瓊脂糖凝膠電泳法，上樣量5 mL。

1.4.3 糞便DNA濃度檢測(cè)

使用Qubit/Nanodrop分光光度計(jì)，檢測(cè)提取出的DNA濃度及純度。

1.4.4 人源

β-globin

基因DNA拷貝數(shù)檢測(cè)

針對(duì)1.3.1所述不同處理?xiàng)l件下保存的糞便DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法，對(duì)人源

β-globin

基因DNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)Δ

C

值(Δ

C

=

C

-

C

)，推測(cè)糞便DNA的變化情況。

1.4.5 人源

ACTB

基因DNA拷貝數(shù)檢測(cè)

針對(duì)糞便樣本提取的DNA，采用qPCR方法，對(duì)人源

ACTB

基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)

C

值，推測(cè)糞便DNA的總量，以

C

＜40為標(biāo)準(zhǔn)判為合格樣本。

2 結(jié)果

2.1 自制保存液糞便樣本DNA質(zhì)量保存效果測(cè)試

同等糞便樣本，在無(wú)自制保存液室溫放置3 d后，DNA發(fā)生明顯降解，條帶變模糊，Qubit濃度明顯增加，qPCR結(jié)果顯示

C

值較對(duì)照組增加2.5個(gè)循環(huán)。同等糞便樣本在自制保存液室溫放置7 d后，條帶與室溫放置3 d及新鮮便樣相比，條帶相似，且qPCR結(jié)果顯示Δ

C

≤0.2。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，DNA濃度及

C

值變化情況見(jiàn)表1。

圖1 4等份新鮮糞便樣本在有無(wú)保存液及置室溫不同時(shí)間條件下瓊脂糖凝膠電泳分析

表1 4等份新鮮糞便樣本在有無(wú)保存液及置室溫不同時(shí)間條件下人源DNA的濃度及C t值變化情況

2.2 不同凍融條件對(duì)自制保存液保存糞便樣本DNA效果比較

不同凍融條件對(duì)自制保存液保存的糞便樣本DNA完整性良好，各組條帶無(wú)明顯異常，濃度無(wú)明顯差異，qPCR結(jié)果顯示Δ

C

值變化小于1。A、B、C 3個(gè)樣本經(jīng)不同凍融條件瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，DNA濃度及

C

值變化情況見(jiàn)表2。

圖2 3組5等份便樣不同處理?xiàng)l件下瓊脂糖凝膠電泳分析

表2 3組5等份糞便樣本在不同處理?xiàng)l件下人源DNA濃度及Ct值變化情況

2.3 自制保存液與RNAlater對(duì)糞便樣本DNA保存效果比較

自制保存液保存糞便樣本7 d后DNA條帶清晰單一，優(yōu)于RNAlater；qPCR結(jié)果顯示自制保存液相較于新鮮糞便樣本對(duì)照Δ

C

值均為負(fù)值，RNAlater保存液組Δ

C

達(dá)到了1.1。兩種不同保存液對(duì)糞便樣本DNA保存完整性瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖3，DNA濃度及

C

值變化情況見(jiàn)表3。

表3 自制保存液與RNAlater對(duì)糞便樣本人源DNA濃度及Ct值變化情況比較

圖3 自制保存液與RNAlater處理后的糞便樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

2.4 自制保存液用于結(jié)直腸癌早篩人群糞便樣本DNA保存的效果比較

將自制糞便樣本保存液應(yīng)用于實(shí)際結(jié)直腸癌早篩人群，與未使用保存液進(jìn)行保存的樣本比較，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，從結(jié)直腸癌篩查人群中收集的新鮮糞便樣本的合格率為39%，而采用自制樣本保存液的樣本合格率可達(dá)71%。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，GLOBOCAN 2020估計(jì)全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例和死亡病例分別為193.16萬(wàn)和93.52萬(wàn)，分別位于所有惡性腫瘤的第3位和第2位。我國(guó)最新腫瘤登記年報(bào)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例38.8萬(wàn)，死亡病例18.7萬(wàn)，其發(fā)病和死亡數(shù)目分別位列我國(guó)惡性腫瘤的第3位和第5位。結(jié)直腸癌篩查是目前公認(rèn)的減少結(jié)直腸癌發(fā)病的有效手段，美國(guó)近20年來(lái)結(jié)直腸癌發(fā)病率的下降主要得益于篩查工作的廣泛開(kāi)展，從1976年到2014年，美國(guó)結(jié)直腸癌的病死率從28.6/10萬(wàn)下降到14.1/10萬(wàn)。我國(guó)部分地區(qū)雖已啟動(dòng)大規(guī)模人群篩查，但結(jié)直腸癌發(fā)病率及病死率還在持續(xù)上升，結(jié)直腸癌防控工作任重道遠(yuǎn)，市場(chǎng)規(guī)模較大。

結(jié)直腸癌各篩查指南普遍將FIT、結(jié)腸鏡檢查作為一線篩查手段，而FIT-fecal DNA等分子學(xué)檢測(cè)作為二線或三線篩查手段，主要原因還在于價(jià)格過(guò)高，成本效益比較低，不易推廣等問(wèn)題。近年來(lái)，“精準(zhǔn)醫(yī)療”為疾病的檢測(cè)、診斷及治療等提供了各種新的方案，研究人員也在各自領(lǐng)域?qū)ふ腋魅巳簩倩蜃V，糞便DNA檢測(cè)作為最適合大腸癌早期篩查的檢測(cè)方法之一，具有無(wú)創(chuàng)、較高靈敏度和特異度等優(yōu)點(diǎn)，以此作為檢測(cè)手段的產(chǎn)品也層出不窮，但如應(yīng)用于大規(guī)模篩查人群，樣本的可及性及篩查成本也必須進(jìn)行控制。糞便樣本中不僅含有微生物菌群生物學(xué)信息，也有來(lái)自人的腸道脫落細(xì)胞，癌癥患者腫瘤上皮細(xì)胞更新速度更快，糞便中人源DNA信息會(huì)更多，而糞便樣本中的核酸酶、多糖、膽酸、膽鹽等成分均會(huì)對(duì)糞便DNA的保存及后續(xù)檢測(cè)造成影響。

在醫(yī)院或體檢中心要求進(jìn)行檢驗(yàn)的糞便樣本，時(shí)常因其本身收集質(zhì)量或溫度或環(huán)境雜質(zhì)等誘發(fā)的不穩(wěn)定而必須立即送檢，給病人造成了不便且對(duì)醫(yī)護(hù)人員送檢時(shí)間要求較高，也給檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室增加了運(yùn)作和及時(shí)提供結(jié)果的難度。而對(duì)于社區(qū)篩查人群，糞便樣本保存時(shí)間及保存條件必須足夠便捷，成本必須足夠低，才能保證收集樣本質(zhì)量不受影響，促使更多的人選擇該種篩查手段。因此，亟需研發(fā)一種低成本且能夠有效保持糞便樣本中人源脫落細(xì)胞基因信息的糞便保存試劑，且試劑組分必須不影響下游如PCR、測(cè)序等分子生物檢測(cè)。

而目前公開(kāi)的糞便樣本保存液方法，存在兩種局限性：①為抑制糞便中微生物滋生，使用不易保存易于分解的抗生素，對(duì)糞便保存條件的要求則更為苛刻；同時(shí)抗生素試劑成本較高，連帶提升了產(chǎn)品市場(chǎng)價(jià)位；②使用如乙醇或氯丁醇等物質(zhì)來(lái)固化菌群結(jié)構(gòu)，但對(duì)人類基因組保存較難保證，同時(shí)醇類作為可燃物還會(huì)產(chǎn)生運(yùn)輸風(fēng)險(xiǎn)。因此，為解決成本較低可適用于篩查、常溫保存及運(yùn)輸、有效保護(hù)糞便中的人源脫落細(xì)胞繼而穩(wěn)定細(xì)胞中的DNA不被降解、保存液各組分不會(huì)影響后續(xù)糞便樣本檢測(cè)幾個(gè)問(wèn)題，我們配制了一種經(jīng)過(guò)改良的糞便樣本保存液，在該保存液中，細(xì)胞緩沖組分可以保持糞便樣本的pH值在7～10，可以有效防止脫落細(xì)胞破裂，并阻遏基因組DNA的降解；金屬離子整合劑則用于整合糞便樣本中的金屬離子，從而穩(wěn)定樣本中DNA組分，并可抑制各種核酸酶活性；而防腐劑的添加，使糞便樣本中的微生物不致過(guò)度增殖，可防止脫落細(xì)胞被微生物破壞。

該研究分別測(cè)試了自制保存液對(duì)于糞便樣本常溫保存3、7 d的保存能力，認(rèn)為新鮮便樣及在有保存液置室溫3或7 d后人源DNA降解較少，

C

值各組基本穩(wěn)定；而無(wú)保存液室溫保存7 d后DNA降解較嚴(yán)重，且DNA濃度明顯增加，提示可能主要由污染菌擴(kuò)增導(dǎo)致，也提示自制保存液的主要作用一方面是保存基因信息完整性，保證人源脫落細(xì)胞的DNA不會(huì)發(fā)生明顯降解；另一方面在于抑菌，使微生物源DNA也無(wú)顯著增殖。測(cè)試了7 d內(nèi)不同凍融條件下自制保存液的保存糞便DNA的效能，認(rèn)為在有保存液的情況下，反復(fù)凍融一次對(duì)糞便基因信息的完整性及總量無(wú)明顯影響。因此后期開(kāi)展人群大樣本量糞便樣本收集時(shí)，認(rèn)為經(jīng)自制糞便保存液處理后，可在-80℃低溫條件下長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，可凍融次數(shù)有待進(jìn)一步研究。另外研究還顯示自制保存液與RNAlater相比，其保存糞便基因信息及抑制微生物生長(zhǎng)的性能要優(yōu)于RNAlater，但成本卻是只有其1/5。本研究通過(guò)對(duì)935例社區(qū)篩查人群糞便樣本的實(shí)際應(yīng)用，對(duì)比無(wú)保存液處理的新鮮便樣本434例和用自制保存液處理的新鮮樣本501例，并提取糞便樣本DNA，經(jīng)qPCR法檢測(cè)人源

ACTB

基因拷貝數(shù)后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用自制保存液保存人群樣本的合格率(71%)高于無(wú)保存液保存的新鮮樣本合格率(39%)。經(jīng)對(duì)保存液保存的不合格樣本進(jìn)行追蹤調(diào)查，影響因素主要有兩種：①篩查對(duì)象在采集樣本前將采集管中保存液傾掉；②樣本采集部位異常引起采集樣本多為食物殘?jiān)倩蛐畔ⅰＳ捎诤Y查大樣本時(shí)，人數(shù)眾多，人員素質(zhì)參差不齊，對(duì)樣本采集要求的理解程度等的不同，對(duì)采集質(zhì)量造成一定的影響。后續(xù)應(yīng)用過(guò)程中需對(duì)采樣說(shuō)明進(jìn)一步明確，同時(shí)加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員的培訓(xùn)以便更好地指導(dǎo)居民采樣。

綜上所述，本研究通過(guò)改良市場(chǎng)糞便樣本保存液的配方，模擬社區(qū)人群結(jié)直腸癌篩查過(guò)程中樣本收集時(shí)間及溫度，對(duì)其保存性能進(jìn)行一系列的測(cè)試，開(kāi)發(fā)了一種可以應(yīng)用于結(jié)直腸癌篩查人群糞便樣本保存的保存液，并通過(guò)較大人群驗(yàn)證，為后續(xù)經(jīng)濟(jì)、有效、便捷地進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)前的大樣本人群糞便樣本采集提供參考和依據(jù)。