用7種醫(yī)療用品原料比較家兔肌肉植入試驗(yàn)兩種評(píng)價(jià)方法的檢測(cè)敏感性

趙 霞，黃雅理，高顯己，王 穎，孫會(huì)敏*，林 飛*

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050)

家兔肌肉植入試驗(yàn)是將檢測(cè)樣品直接埋植于兔肌肉群中，在植入后不同時(shí)間觀察組織反應(yīng)的進(jìn)程和演變，比較檢測(cè)樣品與對(duì)照樣品的生物相容性，進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)。目前越來(lái)越多地用于體內(nèi)埋植或注射等臨床給予途徑的新醫(yī)療器械和醫(yī)療用品原料的評(píng)價(jià)，而且一般用途均屬于較高風(fēng)險(xiǎn)，需要采取特別措施嚴(yán)格控制管理以保證其安全性，臨床前均按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16886.6)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO 10993-6)文件要求進(jìn)行植入試驗(yàn)。但上述標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)樣品處理、植入方法和時(shí)間、觀察判定方法等有不少可變條件，選擇較高標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確判定意義重大。因此本實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用該試驗(yàn)方法檢測(cè)的樣品中，選擇顆粒、薄膜等7種不同產(chǎn)地的醫(yī)療用品原料，進(jìn)行短期、中期和長(zhǎng)期植入體內(nèi)后的檢測(cè)與評(píng)價(jià)，同時(shí)比較不同植入時(shí)間、不同觀察方法的敏感性和可信性是否有差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)樣品

選擇不同材料、規(guī)格、產(chǎn)地的7種醫(yī)療用品原料，對(duì)照樣品選擇已應(yīng)用于臨床多年的進(jìn)口原料，見表1。

表1 7種醫(yī)療用品原料相關(guān)情況

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)新西蘭白兔共84只，雄性，體質(zhì)量2.4～3.0 kg，每種檢測(cè)樣品使用12只。源于中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2019-0017號(hào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(京)2017-0013號(hào)，兔在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室適應(yīng)觀察1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要儀器

本研究使用的主要儀器包括：蒸汽滅菌器、電子天平、電熱恒溫干燥箱、組織病理學(xué)設(shè)備、生物顯微鏡、大視場(chǎng)工作儀、電動(dòng)剃刀和手術(shù)燈。

1.1.4 主要器械與試劑

實(shí)驗(yàn)使用下列器械與試劑：不銹鋼2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)篩(孔徑850 μm)、10 mL注射器、醫(yī)用剪刀、鑷子、手術(shù)刀、止血鉗、縫合針、絲線、3%戊巴比妥鈉溶液、2%碘酊、75%乙醇溶液和10%甲醛溶液等。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

根據(jù)檢測(cè)樣品的形狀不同，薄膜裁剪成長(zhǎng)×寬=10 mm×3 mm；體積小于長(zhǎng)×寬×高=10 mm×5 mm×3 mm的樣品顆粒不需切剪。肉眼挑選均勻一致、周邊沒有銳角的作為植入樣品，清洗、過(guò)濾、烘干，放置在玻璃平皿中，經(jīng)高壓滅菌(溫度113℃、壓力0.060 MPa、20 min)處理后用于試驗(yàn)。

1.2.2 手術(shù)植入

電動(dòng)剃刀去除兔腰背部以下脊柱兩側(cè)被毛，面積為15 cm×20 cm。3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，在脊椎兩側(cè)2.0～3.0 cm處，從第12胸椎至第5腰椎設(shè)4個(gè)植入點(diǎn)，每點(diǎn)間隔2.5 cm，深約1.5 cm，左側(cè)植入檢測(cè)樣品，右側(cè)植入對(duì)照樣品。

1.2.3 術(shù)后觀察

植入后連續(xù)觀察5 d植入點(diǎn)的皮膚反應(yīng)，有無(wú)出血、紅腫、樣品顆粒移位或脫落等，第7天拆除切口縫合線。術(shù)后第15、30、60和90天分別稱取每只動(dòng)物體質(zhì)量，每天觀察動(dòng)物整體狀態(tài)，是否出現(xiàn)異常反應(yīng)或?yàn)l死狀態(tài)。

1.2.4 解剖觀察

植入后第15天(2周以上)、30天(4周以上)、60天(8周以上)和90天(12周以上)分別處死3只兔，切取包裹樣品周圍1.0～1.5 cm的肌肉組織，中間切開，暴露植入樣品，大體觀察植入部位組織有無(wú)異常病變；經(jīng)固定、包埋、切片、染色后，每只兔檢測(cè)樣品組和對(duì)照樣品組4個(gè)植入點(diǎn)各制備3張切片。

1.2.5 組織反應(yīng)病理學(xué)分級(jí)

生物顯微鏡高倍鏡觀察4個(gè)植入點(diǎn)各1張切片的囊腔壁炎癥反應(yīng)和肉芽形成程度，以及檢測(cè)樣品在植入組織中的形態(tài)學(xué)改變。觀察最典型一個(gè)視野中纖維化囊腔壁厚度，新生血管形成、脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量和炎性細(xì)胞數(shù)量及種類，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分級(jí)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 植入樣品周圍組織反應(yīng)分級(jí)

1.2.6 組織反應(yīng)半定量評(píng)價(jià)計(jì)數(shù)

生物顯微鏡高倍鏡觀察4個(gè)植入點(diǎn)各3張切片，計(jì)數(shù)一個(gè)視野中囊腔壁的炎性反應(yīng)個(gè)數(shù)×2(包括嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及壞死細(xì)胞數(shù)量等)和組織反應(yīng)(包括新生血管形成個(gè)數(shù)、纖維化厚度、脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)個(gè)數(shù)等)。計(jì)算檢測(cè)樣品平均數(shù)值與對(duì)照樣品平均數(shù)值的差值。

1.2.7 級(jí)別和分值判定

每組3只兔檢測(cè)樣品組與對(duì)照樣品組的平均分值比較，組織反應(yīng)級(jí)別相同或平均分值的差值在0～2.9數(shù)值范圍為無(wú)刺激；組織反應(yīng)級(jí)別相差Ⅰ個(gè)等級(jí)或平均分值的差值在3.0～8.9為輕度刺激；組織反應(yīng)級(jí)別相差Ⅱ個(gè)等級(jí)或平均分值的差值在9.0～15.0為中度刺激；組織反應(yīng)級(jí)別相差Ⅲ個(gè)等級(jí)或平均分值的差值＞15.0為重度刺激。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況觀察

植入后第1～5天觀察各植入點(diǎn)切口無(wú)出血、樣品在植入腔內(nèi)無(wú)排出，皮膚無(wú)紅腫。在植入各時(shí)間范圍內(nèi)動(dòng)物精神好，外觀及行為正常，活動(dòng)自如，未見明顯異常反應(yīng)或?yàn)l死狀態(tài)。

2.2 體質(zhì)量增長(zhǎng)

選擇植入90 d組各檢測(cè)樣品3只兔平均體質(zhì)量見表3。植入后至取材前各時(shí)間點(diǎn)兔平均體質(zhì)量增長(zhǎng)基本正常，未發(fā)現(xiàn)各檢測(cè)樣品對(duì)兔的體質(zhì)量產(chǎn)生明顯影響。

表3 兔植入樣品各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量增長(zhǎng)觀察

2.3 大體觀察

在植入檢測(cè)樣品后第15、30、60和90天各組動(dòng)物分別處死3只，手術(shù)暴露植入樣品，其植入部位組織未見血腫、水腫、炎癥和明顯囊腔纖維化等病變；檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品顆粒大小和形態(tài)與植入前基本一致，未見降解和吸收。

2.4 組織反應(yīng)分級(jí)

顯微鏡觀察7種檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品每個(gè)植入點(diǎn)1張切片，根據(jù)炎癥反應(yīng)和纖維囊腔形成的程度和數(shù)量其進(jìn)行組織反應(yīng)分級(jí)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣品在植入后第15天存在炎癥反應(yīng)II級(jí)6個(gè)，纖維囊腔II級(jí)3個(gè)；植入后第30天存在炎癥反應(yīng)II級(jí)4個(gè)，纖維囊腔II級(jí)3個(gè)；植入后第60天存在炎癥反應(yīng)≥II級(jí)4個(gè)，纖維囊腔≥II級(jí)3個(gè)；植入后第90天存在炎癥反應(yīng)II級(jí)1個(gè)，纖維囊腔≥II級(jí)2個(gè)(見圖1)。與對(duì)照樣品比較，組織反應(yīng)級(jí)別相差Ⅰ個(gè)等級(jí)有輕度刺激性的是植入后第60天的3號(hào)樣品以及植入后第90天的3、5號(hào)樣品(見表4)。

圖1 顯微鏡觀察植入部位肌肉組織纖維囊腔形成和炎癥反應(yīng)分級(jí)

表4 7種檢測(cè)樣品植入不同時(shí)期組織反應(yīng)分級(jí)

2.5 半定量評(píng)價(jià)計(jì)分

顯微鏡觀察7種檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品植入點(diǎn)的炎性反應(yīng)和組織反應(yīng)，計(jì)算平均分值的差值，發(fā)現(xiàn)植入后第15天均＜2.9，為無(wú)刺激性；植入后第30天5號(hào)樣品為4.5，為有輕度刺激性；植入后第60天3、4、6號(hào)樣品為6.4、3.0、3.2，有輕度刺激性；植入后第90天3、5號(hào)樣品為7.5、3.2，有輕度刺激性(見表5～表8)。

表5 7種檢測(cè)樣品植入第15天半定量評(píng)價(jià)分值統(tǒng)計(jì)

表8 7種檢測(cè)樣品植入第90天半定量評(píng)價(jià)分值統(tǒng)計(jì)

2.6 各植入時(shí)間點(diǎn)組織病理學(xué)比較

檢測(cè)樣品植入第15天，樣品周圍組織反應(yīng)主要是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫為主，成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管構(gòu)成的肉芽組織和少量脂肪細(xì)胞；植入后第30天，樣品周圍肌肉組織和結(jié)締組織處于快速修復(fù)狀態(tài)，新生毛細(xì)血管中度增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫明顯好轉(zhuǎn)；植入后第60～90天，樣品周圍肌肉組織和結(jié)締組織呈穩(wěn)定狀態(tài)，新生毛細(xì)血管逐漸消失，脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫基本消失(見表9)。

表6 7種檢測(cè)樣品植入第30天半定量評(píng)價(jià)分值統(tǒng)計(jì)

表7 7種檢測(cè)樣品植入第60天半定量評(píng)價(jià)分值統(tǒng)計(jì)

表9 非降解吸收樣品對(duì)各植入期的組織病理學(xué)反應(yīng)特點(diǎn)*

3 討論

對(duì)醫(yī)療用品原料進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)時(shí)，一般采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.6和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO 10993-6等規(guī)范要求進(jìn)行。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.6-2015版與GB/T 16886.6-1997版 相比，主要采用ISO 10993-6：2007版內(nèi)容，增加了附錄E半定量分值評(píng)價(jià)法的具體實(shí)施細(xì)則，對(duì)植入樣品數(shù)量、觀察切片數(shù)量、可降解/可吸收材料應(yīng)用、判定標(biāo)準(zhǔn)及打分細(xì)則等均作了明確規(guī)定。但仍保留了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.6-1997版組織反應(yīng)分級(jí)法相關(guān)內(nèi)容。兩種檢測(cè)方法在判定檢測(cè)樣品時(shí)，結(jié)果是否一致，哪個(gè)更敏感、可信度更高，是本研究關(guān)注的內(nèi)容。

本研究結(jié)果表明，組織反應(yīng)分級(jí)法檢出有輕度刺激性的是植入后第60天的1個(gè)樣品，植入后第90天的2個(gè)樣品；半定量分值評(píng)價(jià)法檢出有輕度刺激性的是植入后第30天的1個(gè)樣品，植入后第60天的3個(gè)樣品，植入后第90天的2個(gè)樣品。其敏感性明顯提高、檢出率明顯增加，其原因主要是后者將炎細(xì)胞分類更細(xì)致且明確，計(jì)數(shù)的分?jǐn)?shù)值放大了2倍(分值×2)，判定刺激性平均分值的差值范圍標(biāo)準(zhǔn)固定，每只動(dòng)物植入點(diǎn)顯微鏡觀察由3～4張切片增加到10～12張切片，切片數(shù)增加可減少平均分值個(gè)體誤差，更具有代表 性。由此顯示半定量分值評(píng)價(jià)法其檢出率增加、敏感性、可信性提高，更能確切反應(yīng)出受試樣品與肌肉組織生物相容性的刺激程度。

樣品植入周期的設(shè)計(jì)要充分考慮材料特性和體內(nèi)滯留期的長(zhǎng)短，確保植入物在體內(nèi)生物學(xué)組織反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，以完整評(píng)價(jià)其生物相容性。對(duì)7種檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品分別植入到兔同體左側(cè)或右側(cè)脊柱旁肌，進(jìn)行短期15和30 d、中期60 d和長(zhǎng)期90 d術(shù)后觀察，通過(guò)組織病理學(xué)觀察、分級(jí)、半定量計(jì)分，評(píng)價(jià)周圍組織的反應(yīng)程度。結(jié)果顯示植入后第15天，樣品周圍組織反應(yīng)主要是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫為主，與手術(shù)切口的大小、無(wú)菌操作、愈合恢復(fù)狀態(tài)密切相關(guān)，區(qū)分創(chuàng)傷反應(yīng)和植入物刺激反應(yīng)較困難，檢出假陰性和假陽(yáng)性率較高。植入后第60天觀察，樣品周圍肌肉組織和結(jié)締組織呈穩(wěn)定狀態(tài)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫基本消失，新生毛細(xì)血管逐漸消失，脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)增加，纖維囊腔存在輕微～輕度增生。檢測(cè)樣品如存在刺激性，其炎癥反應(yīng)和纖維囊腔形成明顯加重，檢出率和可信性相對(duì)提高。

金屬材料、高分子材料、陶瓷材料以及復(fù)合材料等在臨床上用途廣泛。原材料的風(fēng)險(xiǎn)性定位分為低度風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)和高度風(fēng)險(xiǎn)。人工器官、血管支架、血管內(nèi)導(dǎo)管、植入器材、手術(shù)黏合劑、封堵劑、一次性輸液器、輸血器，注射用內(nèi)包裝等屬于高度風(fēng)險(xiǎn)材料，需要進(jìn)行多項(xiàng)毒理學(xué)試驗(yàn)以及嚴(yán)格安全性審評(píng)才能進(jìn)入臨床，而動(dòng)物植入試驗(yàn)是仿照臨床給予途徑、接觸部位和接觸時(shí)間，評(píng)價(jià)其局部刺激和全身毒性反應(yīng)，目前該試驗(yàn)更傾向與亞慢性毒性試驗(yàn)或慢性毒性試驗(yàn)結(jié)合，增加劑量(體積或數(shù)量)、增加全身檢測(cè)項(xiàng)目(血液學(xué)、生化學(xué)、組織臟器等)，以滿足生物材料和生物功能對(duì)不同患者自我康復(fù)能力，實(shí)現(xiàn)病變或缺損組織及器官的永久修復(fù)。