兩種異常核型髓系腫瘤的基因突變及臨床相關(guān)性分析

徐啟璐，高 慧，冉學(xué)紅，王軍軍，張俊英，劉麗萍，*

(1．濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053；2．濰坊醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院/濰坊市人民醫(yī)院血液內(nèi)科，山東 濰坊261041)

7號染色體丟失或長臂缺失(-7/7q-)是骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中最常見的染色體改變之一，尤其是繼發(fā)性MDS和AML。然而1號和7號染色體的不平衡易位形成衍生染色體+1，der(1;7)(p10;q10)[以下簡稱der(1;7)]，導(dǎo)致1號染色體長臂(1q)三體和7號染色體長臂(7q)單體，是髓系腫瘤中一種少見的重現(xiàn)性、獲得性核型異常。自1980年Geraedts首次報(bào)道的3例伴der(1;7)核型異常的骨髓纖維化患者以來，至今已報(bào)道近300例，國內(nèi)僅有少數(shù)幾篇報(bào)道。由于一半以上的患者既往有抗腫瘤化療史(特別是含有烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑)和/或放療史，或職業(yè)性有毒物質(zhì)接觸史，因此與繼發(fā)性或治療相關(guān)的MDS(t-MDS)或AML(t-AML)相關(guān)。目前對于der(1;7)的預(yù)后仍存在爭議。此外，der(1;7)患者的突變譜與預(yù)后生存的關(guān)系仍未明確。在本研究中，我們對2013—2020年通過常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析檢出的21例伴有der(1;7)和-7/7q-異常的髓系腫瘤患者進(jìn)行了二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)，并探討der(1;7)和-7/7q-患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、基因突變和臨床轉(zhuǎn)歸方面的差異。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2013年1月—2020年11月濰坊市人民醫(yī)院21例伴有der(1;7)或-7/7q-異常的MDS、AML和骨髓增殖性疾病(myeloproliferative neoplasm，MPN)患者的臨床資料，確認(rèn)der(1;7)或-7/7q-為唯一的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，排除伴有其他細(xì)胞遺傳學(xué)改變的患者。將其分為der(1;7)組和-7/7q-組，所有患者均在初診時(shí)采集骨髓標(biāo)本，應(yīng)用NGS檢測與疾病相關(guān)的38個(gè)基因突變，分析NGS結(jié)果及相關(guān)臨床資料。疾病診斷均符合2016年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)關(guān)于MDS、AML(非M3型)、MPN修訂分型標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)后危險(xiǎn)度分級MDS參照修訂的國際預(yù)后評分系統(tǒng)(IPSS-R)，AML參照2017年成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南。療效評價(jià)參照修訂的2018年MDS國際預(yù)后工作組(IWG-PM)療效標(biāo)準(zhǔn)和2017 ELN的白血病診斷和管理標(biāo)準(zhǔn)。21例患者中有17例應(yīng)用去甲基化藥物(地西他濱/阿扎胞苷)治療，11例應(yīng)用蒽環(huán)類藥物化療。研究隨訪截至2020年12月25日，中位隨訪時(shí)間169 d。

1.2 染色體制備

用常規(guī)方法對未經(jīng)刺激的骨髓液培養(yǎng)(24和48 h)制備的R顯帶中期細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色體分析。對20個(gè)中期細(xì)胞進(jìn)行了常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析。核型按照人類細(xì)胞基因組學(xué)國際命名體系(ISCN2016)報(bào)告。部分患者應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence

in situ

hybridization，F(xiàn)ISH)檢測1號及7號染色體長臂。對200個(gè)間期細(xì)胞進(jìn)行FISH分析。

1.3 二代測序檢測基因突變

提取骨髓液標(biāo)本中基因組DNA，制備DNA全基因組文庫。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物擴(kuò)增目的基因組38個(gè)MDS/AML/MPN相關(guān)基因，將目標(biāo)區(qū)域DNA富集后，采用illumina測序平臺進(jìn)行二代測序。測序后用dbSNP、1 000 genomes、COSMIC、Polyphen-2、SIFT等數(shù)據(jù)庫對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定致病性基因突變位點(diǎn)。平均測序深度1 000×，變異頻率＞5%的突變位點(diǎn)檢出率＞99%。測序由武漢思泰得醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)平臺完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0、Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、作圖；計(jì)量資料的組間比較，符合正態(tài)分布資料采用單因素方差分析或

t

檢驗(yàn)，非正態(tài)資料使用Kruskal-Wallis

H

檢驗(yàn)或Mann-Whitney

U

檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行差異性分析，檢驗(yàn)水 準(zhǔn)α＝0.05。以Kaplan-Meier法 計(jì) 算 總 生 存 期(overall survival，OS)，OS定義為從開始治療到因任何原因死亡的時(shí)間或最后一次隨訪的時(shí)間，率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析患者的核型和突變基因的相關(guān)性。

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本特征

本研究共納入21例患者，男性14例，女性7例，中位年齡58(52～64)歲。對21例患者的骨髓中期細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色體分析，應(yīng)用FISH對其進(jìn)行突變檢測，結(jié)果見圖1，利用缺失擴(kuò)增探針檢測發(fā)現(xiàn)3個(gè)1q21，1個(gè)D7S522異常熒光信號。患者的臨床特征及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果見表1，可見21例患者中11例為der(1;7)核型異?；颊?，10例為-7/7q-核型異?；颊?，der(1;7)組中MDS 3例，AML 7例，MDS/MPN-MF伴 發(fā) 肺 癌1例；-7/7q-組中MDS 5例，AML 5例。der(1;7)患者中以男性為主，男女比例10∶1，-7/7q-患者的男女比例大致均等(2∶3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.024)。der(1;7)組患者的血小板計(jì)數(shù)(1.5×10個(gè)/L)顯著低于-7/7q-組(4.3×10個(gè)/L，

P

=0.036)，der(1;7)組患者的C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)(51.3 mg/L)顯著高于-7/7q-組(8.15 mg/L，

P

=0.029)。將核型異?；颊叻譃镸DS與AML亞組，der(1;7)與-7/7q-患者的骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為

P

＞0.05)。兩組患者的免疫分型具有相似性(

χ

=0.078，

P

=1.000)，共同表達(dá)CD38、CD13、HLA-DR、CD117、CD34、CD33。

圖1 骨髓細(xì)胞遺傳學(xué)檢測結(jié)果

表1 der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的臨床特征及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

根據(jù)WHO(2016)分型，der(1;7)的MDS患者多為MDS-EB1分型；AML多為M5型，-7/7q-多為MDSEB2型；AML各型較分散。預(yù)后危險(xiǎn)度分層，分析結(jié)果見表1，AML患者IPSS-R評分der(1;7)全部表現(xiàn)為中等預(yù)后，-7/7q-全部表現(xiàn)為不良預(yù)后，兩組差異有統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(

P

＜0.01)。21例 患 者 中17例[der(1;7)7例，-7/7q-10例]應(yīng)用去甲基化藥物治療，11例[der(1;7)8例，-7/7q-3例]應(yīng)用蒽環(huán)類藥物化療，MDS患者中7例(87.5%)應(yīng)用去甲基化藥物治療，AML患者中8例(61.5%)應(yīng)用去甲基化藥聯(lián)合蒽環(huán)類藥物化療，der(1;7)組患者的總緩解率(ORR)優(yōu)于-7/7q-組(

P

=0.131)。

2.2 核型與基因突變的相關(guān)性

采用NGS檢測基因突變，21例患者中有6例(28.6%)未檢測到突變，11例der(1;7)患者中有7例(63.6%)檢測到突變，10例-7/7q-患者中有8例(80%)檢測到突變，共檢出13種基因37個(gè)突變，4例(23.8%，4/21)攜帶1個(gè)突變，11例(52.4%，11/21)攜帶2個(gè)(5例)、3個(gè)(3例)、4個(gè)(1例)或5個(gè)(2例)突變。人均檢出(1.76±1.02)個(gè)突變患者的突變基因分布見表2。根據(jù)基因功能分類，按突變頻率由高到低依次表現(xiàn)為遺傳 相 關(guān) 基 因(

DNMT3A

、

IDH1

/

IDH2

、

TET2

、

ASXL1

、

SETBP1

、

EZH2

)(59.5%，22/37)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因(

RUNX1

、

ETV6

、

BCORL1

、

CUX1

)(21.6%，8/37)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(

JAK2

、

CBL

)(10.8%，4/37)、剪接體相關(guān)基因(

U2AF

1)(8.1%，3/37)。der(1;7)患者中

RUNX1

(21.4%)、

IDH1/IDH2

(21.4%)、

JAK2

(21.4%)基因突變頻率較高，-7/7q-患者中

SETBP1

(17.4%)、

TET2

(17.4%)、

ASXL1

(13%)、

U2AF1

(13%)、

DNMT3A

(13%)基因突變頻率較高。兩組核型基因組成差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.012)，突變基因類型與核型之間存在正相關(guān)(

r

=0.522，

P

=0.001)。分別比較單個(gè)基因型在兩種細(xì)胞遺傳學(xué)中的數(shù)量分布，僅

SETBP1

基因突變數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.035)。

表2 der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的突變基因分布*

2.3 核型與患者預(yù)后生存的相關(guān)性

der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的生存曲線見圖2，der(1;7)組患者的中位OS、總OS均較-7/7q-組顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.045，HR=2.844)，兩組患者死亡風(fēng)險(xiǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=1.000)。基因突變型與野生型的核型異?；颊呱媲€見圖3，der(1;7)患者中

RUNX1

基因突變型較野生型中位OS明顯縮短(

P

=0.435，HR=1.936)；

IDH1

/

IDH2

(

P

=0.300，HR=0.343)、

JAK2

(

P

=0.487，HR=0.476)突變型較野生型表現(xiàn)出較長的OS；-7/7q-患者中

ASXL1

突變型較野生型中位OS顯著縮短(

P

=0.018，HR=5.583)，

SETBP1

基因表達(dá)頻率較der(1;7)患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.035)。

SETBP1

與

ASXL1

基 因 常 常 伴 隨 出 現(xiàn)(2/10)。

U2AF1

突變型較野生型OS延長(

P

=0.464)，且常與

SETBP1

突變伴發(fā)(2/10)。

DNMT3A

(13%)為-7/7q-患者中常見的突變基因，突變型較野生型中位OS縮短(

P

=0.061，HR=5.375)。

TET2

突變在der(1;7)和-7/7q-患者中均有表達(dá)，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

χ

=0.361，OR=0.333)。

圖2 der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的生存曲線

圖3 基因突變型與野生型的核型異常患者生存曲線

3 討論

der(1;7)染色體異常是著絲粒區(qū)域內(nèi)有絲分裂重組的產(chǎn)物，在MDS、AML及MPN中的發(fā)生率分別為1%～3%、1%～2%和1%，中位OS為24～46個(gè)月，白血病轉(zhuǎn)化率為14%～52%。本研究患者的臨床特征與既往報(bào)道大體一致，der(1;7)組患者男性居多，血小板計(jì)數(shù)顯著低于-7/7q-組；CRP顯著高于-7/7q-組，與初診時(shí)出血、感染發(fā)生率高有關(guān)。兩組患者的年齡分布相似，WBC、HGB和LDH的計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。der(1;7)組的AML較-7/7q-組骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與既往報(bào)道的der(1;7)異常MDS患者具有較低的骨髓原始細(xì)胞比例有差別。

der(1;7)和-7/7q-兩種細(xì)胞遺傳學(xué)組可能具有不同的致病模型，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與這種易位相關(guān)的一些特異性分子靶點(diǎn)。Westman等在11例合并der(1;7)異常的MDS或AML患者中發(fā)現(xiàn)了4例

IDH1

/

IDH2

突變，Hartmann等對80名7q-患者進(jìn)行NGS確定

ASXL1

、

TET2

、

RUNX1

的高頻突變；而國內(nèi)陳蘇寧教授團(tuán)隊(duì)對22例der(1;7)患者進(jìn)行NGS，證明der(1;7)與

RUNX1

的高頻突變有關(guān)。本研究通過對21例髓系腫瘤患者進(jìn)行NGS，發(fā)現(xiàn)der(1;7)患者

RUNX1

、

IDH1/IDH2

、

JAK2

基因的突變頻率較高，-7/7q-患者中

SETBP1

、

TET2

、

ASXL1

基因的突變頻率較高，基因與核型存在顯著的相關(guān)性，且-7/7q-患者中

ASXL1

與

SETBP1

存在伴隨突變。這與既往報(bào)道基本一致，但由于NGS檢測Panel的設(shè)計(jì)和檢測基因的熱點(diǎn)區(qū)域不同，導(dǎo)致結(jié)果存在異質(zhì)性。

RUNX1

突變比例在初診AML和MDS中為10%和10%～20%，本研究

RUNX1

突變比例為21.4%；der(1;7)患者

RUNX1

突變型(

RUNX1

)較野生型(

RUNX1

)OS短，預(yù)后不良，是der(1;7)患者獨(dú)立的預(yù)后危險(xiǎn)因素。蔡曉輝等證明了

RUNX1

突變的患者WBC水平、原始細(xì)胞百分比及白血病轉(zhuǎn)化(leukemic transformation，LT)率更高，血小板水平更低。多篇文獻(xiàn)提出伴

RUNX1

突變的年輕患者更能受益于異基因造血干細(xì)胞移植(HSCT)。本研究結(jié)果顯示

IDH1

/

IDH2

患者相比

IDH1

/

IDH2

OS延長。Xu等基于33篇已發(fā)表的研究進(jìn)行了meta分析，得出在核型異常的AML中

IDH2

突變可延長OS，且與預(yù)后良好相關(guān)。Westman等也證明了

IDH2

突變的der(1;7)患者預(yù)后明顯好于野生型，與LT正相關(guān)，但與其他7號染色體異常呈負(fù)相關(guān)，這表明在白血病發(fā)生中有一種不同于其他7號染色體缺陷的特殊生物學(xué)效應(yīng)，可能與1q三體有關(guān)。Molenaar等通過實(shí)驗(yàn)證明PARP抑制劑olaparib和talazoparib(奧拉帕利和他拉唑帕尼)與DNA損傷劑(柔紅霉素)的聯(lián)合化療對

IDH1

/

IDH2

AML細(xì)胞的致死性更高，可能是治療

IDH1

/

IDH2

AML更好的策略。本研究11例應(yīng)用蒽環(huán)類藥物的患者中有9例應(yīng)用了柔紅霉素為基礎(chǔ)的化療，患者OS延長，與上述研究結(jié)論一致，可用于指導(dǎo)治療。此外，

IDH

抑制劑在復(fù)發(fā)難治性

IDH1

/

IDH2

AML、MDS患者中顯示出良好的前景。

SETBP1

基因在-7/7q-核型異?；颊咧型蛔儽壤?，與

ASXL1

基因常常伴隨出現(xiàn)，且OS縮短。Saika等發(fā)現(xiàn)

SETBP1

在

ASXL1

的MDS患者中富集，并與高LT的發(fā)生率以及OS縮短有關(guān)。

ASXL1

是染色體修飾與調(diào)節(jié)基因，在MDS、AML、CMML中均與不良預(yù)后相關(guān)。本研究中

ASXL1

突變主要發(fā)生在-7/7q-患者中，OS較野生型顯著縮短，

SETBP1

與

ASXL1

聯(lián)合激活

Myc

基因的上調(diào)，并抑制了TGF-β信號通路，在體內(nèi)協(xié)同誘導(dǎo)AML，二者聯(lián)合突變比單獨(dú)出現(xiàn)表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性、更高的LT風(fēng)險(xiǎn)和更短的OS。因此

SETBP1

是伴

ASXL1

的MDS的關(guān)鍵驅(qū)動因素，可作為MDS的潛在治療靶點(diǎn)。組蛋白去乙?；敢种苿┓⒅Z他(vorinostat)能逆轉(zhuǎn)這些啟動子區(qū)域的組蛋白乙酰化，并誘導(dǎo)TGF-β信號通路的上調(diào)。對于

ASXL1

伴

SETBP1

的MDS和AML將是很有前景的治療藥物。

本研究17例患者應(yīng)用去甲基化藥物治療，11例應(yīng)用蒽環(huán)類藥物化療，der(1;7)組患者的總緩解率(ORR)優(yōu)于-7/7q-組，但OS不理想，說明der(1;7)患者對單純應(yīng)用去甲基化及蒽環(huán)類藥物有較高的快速緩解率，但由于缺乏進(jìn)一步的維持治療，der(1;7)組患者的OS顯著縮短。Horio等將13例der(1;7)的MDS患者，基于骨髓發(fā)育狀況和骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)分為預(yù)后良好組及預(yù)后不良組，3年生存率為86%和0%。其他幾項(xiàng)研究中兩者的OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中AML病例數(shù)量多(7/11)，骨髓原始細(xì)胞計(jì)數(shù)高，有2例由MDS轉(zhuǎn)化為AML，余5例不能除外先前未診斷且進(jìn)展迅速的LT的可能性，以及治療相關(guān)的基因毒性暴露對治療反應(yīng)較差、病死率高。既往報(bào)道MDS中大多數(shù)基因突變導(dǎo)致骨髓原始細(xì)胞數(shù)升高，預(yù)后較差。因此，我們認(rèn)為AML伴der(1;7)與已知低風(fēng)險(xiǎn)核型異常的AML相比，可能具有不利的臨床特征及預(yù)后。Itonaga等對接受HSCT的der(1;7)、-7/7q-和核型正常組患者進(jìn)行了一項(xiàng)大型的回顧性分析，證明der(1;7)患者在晚期疾病狀態(tài)下接受allo-HSCT表現(xiàn)出較好的預(yù)后生存。

綜上所述，der(1;7)和-7/7q-核型異常的髓系腫瘤是兩種相互獨(dú)立的疾病亞型，二者在實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、基因突變和臨床轉(zhuǎn)歸方面存在顯著差異，der(1;7)較-7/7q-患者預(yù)后差，OS短，

RUNX1

和

IDH1/IDH2

基因在der(1;7)組中突變頻率較高，

SETBP1

與

ASXL1

基因在-7/7q-組中常常伴隨出現(xiàn)。將基因突變恰當(dāng)?shù)丶{入該類疾病預(yù)后危險(xiǎn)分層中，進(jìn)行精確的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評估，選擇最佳的治療方案，實(shí)施精準(zhǔn)個(gè)體化診療，將是未來的研究方向。本研究具有一些局限性，分析及包含的患者數(shù)量有限，后續(xù)需要在大型的隊(duì)列研究中進(jìn)一步證實(shí)。