一測多評(píng)法測定金沙藤中異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素的含量

張道英，孫湘婷，陳樹群，陶濟(jì)明，劉 海

（贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000）

近年來隨著中藥研究的進(jìn)一步發(fā)展，無論是消費(fèi)者、制藥公司、藥品研發(fā)人員，還是國家藥品監(jiān)督管理部門都對(duì)中藥質(zhì)量提出了更高的要求。目前大部分中藥是以單一成分的含量來評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量，然而中藥所含成分比較復(fù)雜，僅以單一成分含量來評(píng)價(jià)中藥產(chǎn)品質(zhì)量不夠全面準(zhǔn)確。因此提出了多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)，但是傳統(tǒng)的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)需要眾多中藥對(duì)照品，對(duì)照品稀缺且提取成本昂貴。2006 年一測多評(píng)法（quantitative analysis of multicomponents by single-maker，QAMS）［1］的提出成功解決了這個(gè)問題。

本文主要研究中藥材金沙藤，別名竹園荽、黑須草、牛斗茜等，它是海金沙科植物海金沙、小葉海金沙或曲軸海金沙的干燥地上部分［2］。在夏末秋初生長比較旺盛，該時(shí)間段為最佳采收期。金沙藤性涼，用途廣泛，取鮮品搗爛后外敷可以治療燙傷和黃蜂蟄傷，也可與滑石、蒲蓄、甘草梢聯(lián)合使用治療淋癥［3］。此外有文獻(xiàn)報(bào)道分別用金沙藤和海金沙做抗菌實(shí)驗(yàn)、抗炎實(shí)驗(yàn)以及鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)二者均有抗菌、抗炎和鎮(zhèn)痛的作用［4］。金沙藤化學(xué)成分復(fù)雜，目前已經(jīng)分離鑒定的化學(xué)成分就有十多種［5］，其中分離出的異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素四種化合物，均屬于黃酮類化合物。異槲皮苷有著色、抗氧化的特性［6］，以其為原料可以合成食品添加劑；紫云英苷可作為純天然抗氧化劑［7］，抗炎作用極強(qiáng)，有開發(fā)為抗乳腺炎藥物的潛能［8］；槲皮素對(duì)多種癌細(xì)胞有抑制作用，能防癌抗癌［9］，同時(shí)對(duì)心臟也有保護(hù)作用；山奈素亦稱“莰非醇”，能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)玉米葡糖的消耗，抑制乳腺癌MCF7 細(xì)胞增殖，有開發(fā)為治療乳腺癌藥物的潛能。

隨著金沙藤被廣泛應(yīng)用于臨床，目前關(guān)于金沙藤藥材的化學(xué)成分、對(duì)機(jī)體的影響及其作用機(jī)制等方面的研究越來越多［10-13］，周艷林等［4］分離鑒定了金沙藤中的10種化學(xué)成分，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，建議對(duì)金沙藤藥材進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究時(shí)選擇異槲皮苷作為對(duì)照品。因此，本實(shí)驗(yàn)以異槲皮苷為對(duì)照品，通過一測多評(píng)法測定金沙藤中異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素四種成分的含量。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑異槲皮苷［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2157-25-3（190711），純度HPLC≥98%］，紫云英苷［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限 公 司，批 號(hào)：480-10-4（190514），純 度HPLC≥98%］，槲皮素［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：117-39-5（190715），純度HPLC≥98%］，山奈素［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：520-18-3（190710），純度HPLC≥98%］，甲醇（色譜純），甲酸（色譜純），甲醇（分析純），超純水（自制）。

金沙藤藥材分別在江西贛州、湖南長沙和四川宜賓三個(gè)產(chǎn)地購買，均由藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李加林副教授鑒定為金沙藤正品。

1.2儀器高效液相色譜儀［島津LC-15C，島津LC-16C，島津儀器（蘇州）有限公司］，JP-100 超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司），B-260 恒溫水浴鍋（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司），F(xiàn)A1104十萬分之一分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），12S-FS1400 中藥粉碎機(jī)（合肥榮事達(dá)小家電有限公司），Exceed-Ad-16艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司），藥典三號(hào)篩（浙江上虞市道墟張興紗篩廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法原理中藥成分雖然復(fù)雜，但是各有效成分間存在一定的比例關(guān)系，在進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，引入相對(duì)校正因子，通過測定其中一個(gè)代表性成分（價(jià)格低廉，容易提取，含量豐富）的含量，根據(jù)待測成分與代表性成分間的相對(duì)校正因子，計(jì)算待測成分的含量。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備分別在4 個(gè)25 mL的容量瓶中加入精密稱取的11.05 mg、7.01 mg、4.12 mg、5.21 mg 異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素對(duì)照品，用甲醇定容，搖勻，即得上述四種成分的對(duì)照品溶液。

精密吸取異槲皮苷對(duì)照品溶液0.5 mL、紫云英苷對(duì)照品溶液0.5 mL、槲皮素對(duì)照品溶液0.2 mL和山奈素對(duì)照品溶液0.1 mL，并將全部溶液置于同一樣品瓶中，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取適量金沙藤藥材（湖南長沙產(chǎn)），置于中藥粉碎機(jī)中，粉碎成細(xì)粉，過三號(hào)藥典篩，精密稱定1.003 2 g，置于干燥的圓底燒瓶中，加入50 mL 純甲醇，水浴回流2 h，放冷后過濾，收集續(xù)濾液，再過0.45 μm 的微孔濾膜，將濾液置于樣品瓶中，貼好標(biāo)簽，備用。

2.4 色譜條件儀器：LC-15C 型高效液相色譜儀［島津儀器（蘇州）有限公司］；色譜柱：Agilent C18柱（規(guī)格150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動(dòng)相：甲醇-0.3%甲酸，梯度洗脫，洗脫程序見表1，進(jìn)樣量：10 μL。（色譜圖見圖1，圖2）。

表1 最佳的梯度洗脫程序

圖1 混合對(duì)照品溶液的HPLC圖

圖2 金沙藤樣品溶液的HPLC圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算6 次進(jìn)樣后4 種成分異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值，4 種成分 的RSD 值分 別 為：2.71%、1.03%、1.44%、2.50%，表明儀器有良好的精密度。

2.5.2 重復(fù)性考察精密稱取6 份同一批次的金沙藤粉末，每份約1.0 g，制備成6 份供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)的色譜條件依次進(jìn)樣分析，根據(jù)色譜圖中各成分的峰面積計(jì)算金沙藤中四種成分的含量以及RSD 值，四種成分的RSD 值分別為：1.28%、1.41%、3.27%、2.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察精密稱取1.000 3 g 金沙藤粉末（湖南長沙產(chǎn)），制備成供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)的色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣四種成分的峰面積，然后計(jì)算四種成分峰面積的RSD 值，RSD 值分別為1.13%、1.07%、1.99%、1.04%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 線性關(guān)系考察精密量取5 份混合對(duì)照品溶液，每份1 mL，將它們依次稀釋1 倍、2 倍、3 倍、4倍、5 倍，將稀釋好的溶液分別標(biāo)記為1-1、1-2、1-3、1-4、1-5，按“2.4”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度的溶液進(jìn)樣2次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，取平均值。然后以峰面積為Y軸，進(jìn)樣量（μg）為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程，見表2。表明四種成分的線性關(guān)系均良好。

表2 金沙藤中四種成分的線性關(guān)系

2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取5 份湖南長沙產(chǎn)的金沙藤粉末（1.000 2 g、1.001 3 g、1.000 2 g、1.000 3 g、1.000 1 g），加入與金沙藤粉末中四種成分等量的異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素對(duì)照品溶液，制備成供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)的色譜條件依次進(jìn)樣10 μL，測定藥材中四種成分的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表3 金沙藤中4種成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 相對(duì)校正因子的計(jì)算結(jié)合線性關(guān)系考察時(shí)配制的5種不同濃度對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析后所得色譜圖，根據(jù)公式fsi＝fs/fi=（AS/wS）/（Ai/wi），分別計(jì)算異槲皮苷（簡寫s）和紫云英苷（簡寫z）、槲皮素（簡寫h）、山奈素（簡寫n）之間的相對(duì)校正因子fsi［14］（其中AS為異槲皮苷對(duì)照品峰面積，wS為異槲皮苷對(duì)照品的質(zhì)量，Ai為某待測成分對(duì)照品峰面積，wi為某待測成分對(duì)照品的質(zhì)量）。計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 金沙藤中四種成分間相對(duì)校正因子的計(jì)算結(jié)果

2.7 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性考察

2.7.1 不同儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響考察島津LC-15C、島津LC-16C 兩種儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響。取混合對(duì)照品溶液，使用上述兩種儀器，各進(jìn)樣3次，記錄四種成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相對(duì)校正因子的RSD 值，RSD 值分別為0.75%、3.14%、1.38%，表明不同儀器不會(huì)對(duì)相對(duì)校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.7.2 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響考察Agilent C18、Shimadzu C18、Waters C18三種色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響。取混合對(duì)照品溶液，分別使用上述三種色譜柱進(jìn)樣分析，記錄四種成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其校正因子的RSD 值，RSD 值分別為2.72%、0.71%、2.56%，表明不同色譜柱不會(huì)對(duì)相對(duì)校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.7.3 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響考察25 ℃、30 ℃、40 ℃三種柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，取混合對(duì)照品溶液，分別按上述三種溫度設(shè)置柱溫，每種柱溫條件下進(jìn)樣3次，記錄四種成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相對(duì)校正因子的RSD 值，RSD 值分別為3.60%、1.74%、2.66%，表明不同柱溫不會(huì)對(duì)相對(duì)校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.7.4 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響考察0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1三種流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響，取混合對(duì)照品溶液，分別按上述三種設(shè)置流速，每種流速條件下進(jìn)樣3次，記錄四種成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相對(duì)校正因子的RSD 值，RSD 值分別為0.79%、1.07%、1.04%，表明不同流速不會(huì)對(duì)相對(duì)校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.8 待測成分色譜峰的定位在考察了不同儀器（島津LC-15C、島津LC-16C）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、40 ℃）及不同流速（0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，與此同時(shí)也記錄了不同儀器、不同柱溫及不同流速條件下待測組分與內(nèi)參物的保留時(shí)間，內(nèi)參物保留時(shí)間已知，根據(jù)待測組分與內(nèi)參物的相對(duì)保留時(shí)間確定色譜峰的準(zhǔn)確峰位置，見表5。

表5 待測組分與內(nèi)參物相對(duì)保留時(shí)間

2.9 外標(biāo)法與一測多評(píng)法測定結(jié)果的比較精密稱取4 份金沙藤粉末（贛州贛江1.003 1 g、宜賓1.003 2 g、贛州李記1.002 5 g、長沙1.002 5 g），分別制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄四種成分峰面積。首先用外標(biāo)法測定金沙藤中異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素的含量，然后再用一測多評(píng)法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表6。為了驗(yàn)證一測多評(píng)法的準(zhǔn)確性，將兩種測定方法得到的結(jié)果用Pearson相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果兩種方法之間的r為0.999 99，大于0.999 9，說明兩種方法相關(guān)性很高，再對(duì)兩種測定方法得到的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＞0.05，表明兩組測定結(jié)果無顯著性差異。

表6 一測多評(píng)法和外標(biāo)法測定金沙藤中四種成分的含量/%

3 討 論

3.1 從檢驗(yàn)結(jié)果看，不論是用一測多評(píng)法還是用外標(biāo)法測定金沙藤中四種有效成分的含量，結(jié)果并無顯著性差異。表明“2.6”中計(jì)算得到相對(duì)校正因子可靠，在沒有紫云英苷、槲皮素和山奈素對(duì)照品的情況下，利用異槲皮苷對(duì)照品以及相對(duì)校正因子可計(jì)算得到金沙藤藥材中紫云英苷、槲皮素和山奈素的含量。

3.2 色譜峰的定位是否準(zhǔn)確決定了實(shí)驗(yàn)的成敗，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間或保留時(shí)間差值確定色譜峰的準(zhǔn)確位置，是目前比較常用的方法，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)四種成分之間的相對(duì)保留時(shí)間定位待測成分的色譜峰。3.3 一測多評(píng)法整合了內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)、校正因子等方法的優(yōu)勢，被越來越多地運(yùn)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制中。它彌補(bǔ)了單一指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)和多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)的不足，但在一測多評(píng)法方法學(xué)的建立過程中，還有許多問題值得進(jìn)一步探究。