脂肪間充質(zhì)干細胞治療腦癱的研究進展

胡 可，胡紫薇，古月明，唐小冬，溫優(yōu)良

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第三臨床醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進步降低新生兒死亡率的同時增加了腦癱患兒的發(fā)病率。腦癱是導(dǎo)致兒童身體殘疾的重要疾患，給家庭、社會帶來沉重負擔(dān)。目前臨床上對腦癱患兒主要采用藥物、手術(shù)、康復(fù)治療及高壓氧等治療手段，但這些治療對腦癱患兒療效不穩(wěn)定，更多是一種支持性治療，尤其對一些重癥患兒療效不佳［1］。近年來，干細胞在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的潛在作用受到廣泛關(guān)注，特別是間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），如骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、臍帶間充質(zhì)干細胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）在治療腦癱的臨床試驗上表現(xiàn)出積極的結(jié)果［2-5］。近年，有研究證實脂肪來源的MSCs 即脂肪間充質(zhì)干細胞（Adipose-derived mesenchymal stem ce11s，ADMSCs）在特定的誘導(dǎo)技術(shù)下，同樣可以定向分化成多種類型的細胞和分泌多種生物活性因子［6］。目前，ADMSCs 除應(yīng)用于皮膚組織缺損［7-8］、骨關(guān)節(jié)炎［9-10］、糖尿病［11-12］等疾病治療外，有動物疾病模型實驗也證實其在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的可行性［13-14］，且在臨床試驗上也有案例報道證實其療效［15］。本文主要對ADMSCs治療腦癱的應(yīng)用及研究進展進行綜述。

1 ADMSCs治療腦癱的取材優(yōu)勢

一直以來，骨髓和臍帶是獲取MSCs 的主要來源，并廣泛地應(yīng)用于臨床與實驗研究。但BMSCs 的獲取不僅具有侵入性，增加感染風(fēng)險，而且從骨髓中提取出的間充質(zhì)干細胞的數(shù)量與質(zhì)量也會受供體者年齡的影響［4］。同樣獲得足夠數(shù)量的UCMSCs大約只能在40%的臍帶樣品中才能實現(xiàn)［2］。研究表明，人體脂肪中含有充足的ADMSCs，每毫升吸脂劑的干細胞數(shù)比骨髓中的干細胞數(shù)約高8 倍［16］，而且ADMSCs 具有穩(wěn)定的增殖分化能力，可以避免因供體者年齡的增長而顯著下降［17］。ADMSCs 另外一個優(yōu)勢是具有極低的免疫原性，即它可以逃避T 細胞的免疫識別而在異體內(nèi)長期存活。產(chǎn)生此優(yōu)勢的原因可能是ADMSCs不表達共刺激表面抗原及其分泌的細胞因子形成了免疫抑制微環(huán)境對T細胞增殖具有直接抑制作用［18］。因此，ADMSCs 通?？梢匀∽曰純旱哪赣H臍周區(qū)域脂肪來實現(xiàn)異體移植治療腦癱，有效地避免倫理學(xué)上的爭議?？梢?，ADMSCs憑借來源豐富、提取率高、倫理學(xué)爭議性小、低免疫原性的取材優(yōu)勢，有望成為治療腦癱的良好種子細胞。

2 ADMSCs治療腦癱可能的機制

目前，ADMSCs 治療腦癱的機制雖然還不能完全明確，但有動物實驗和臨床試驗研究證實它具有促進神經(jīng)恢復(fù)和神經(jīng)保護作用的特性，并可能通過以下直接或間接的作用機制來治療腦癱［19］。

2.1 直接作用直接作用是指腦癱發(fā)生后，受損的腦組織會釋放出多種生物活性因子，在“歸巢”機制的作用下，引導(dǎo)移植入患兒體內(nèi)的ADMSCs 容易穿過已受損的血腦屏障遷移至腦損傷區(qū)域而產(chǎn)生作用［20］。ADMSCs 到達受損組織處后，在受損組織的特定微環(huán)境誘導(dǎo)下，通過增殖分化發(fā)育為相應(yīng)組織類型的功能細胞，使各個腦區(qū)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連接增加，從而改善腦癱患兒的功能結(jié)局［21］。近年來，雖有體外實驗已證實ADMSCs 可以向多種細胞類型分化，但其在體內(nèi)可否直接分化替代受損細胞卻存在爭議［22］，有待進一步深入研究。

2.2 間接作用間接作用是指當(dāng)ADMSCs 移植到患兒體內(nèi)后可旁分泌各種生長因子來修復(fù)受損腦組織和營造良好的恢復(fù)微環(huán)境［23］，如血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）能促進損傷部位的血管再生，穩(wěn)定損傷部位的血液循環(huán)；肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）可影響少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育和生長，加速髓鞘的形成；腦源性神經(jīng)生長因子（Brain-derived neuro trophic factor，BDNF）可通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，Erk）磷酸化或TrkB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來改善低髓鞘化，還可以與神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）共同激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞再生［19］。另外，在這些生長因子的作用下能夠?qū)κ軗p組織起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、抗凋亡等多種共同作用［24-25］。這些間接治療作用的潛力使得ADMSCs 移植成為治療腦癱的理想選擇。目前，這種間接作用的機制也被大多數(shù)學(xué)者所接受。

3 ADMSCs治療腦癱的臨床研究

3.1 臨床試驗的案例報道HIRANO A 等［26］首次報告1 例7 歲腦癱患兒經(jīng)過6 次靜脈注射移植同種異體ADMSCs 后，評估了其治療安全性和可行性。報告顯示在隨訪12個月的時間里，患兒臨床表現(xiàn)顯著改善，生活質(zhì)量及身心評分均顯著提高，未見嚴重不良反應(yīng)。此研究一定程度上反應(yīng)同種異體ADMSCs 在腦癱患兒中可安全有效地使用，但由于受試對象僅為1 例，其結(jié)果是否可推廣到其他腦癱患兒，需要進一步研究。

目前，ADMSCs 治療腦癱的臨床試驗側(cè)重于對單個受試對象的療效及安全性評價的研究。截止到2020 年1 月31 日從美國臨床試驗數(shù)據(jù)庫（Clinicaltrials）查詢到使用ADMSCs 治療腦癱的臨床試驗共2 項［27-28］，治療缺血缺氧性腦?。℉ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）的臨床試驗共1 項［29］（表1）。國內(nèi)尚未見應(yīng)用ADMSCs 治療腦癱的臨床試驗開展。

表1 ADMSCs治療腦癱的臨床試驗

3.2 臨床試驗的注意事項ADMSCs 治療腦癱要想在臨床上得到廣泛應(yīng)用，仍需要開展更多標準化動物模型的臨床前試驗和多中心的臨床隨機對照試驗來科學(xué)證實ADMSCs治療腦癱臨床安全性和有效性。在已開展的MSCs 治療腦癱的臨床試驗中，受試者的年齡、給藥途徑、給藥劑量及隨訪時間等方面均不一致，這就加大了臨床試驗的風(fēng)險。參考其他來源的MSCs 治療腦癱的臨床試驗，為確保ADMSCs 治療腦癱臨床試驗的規(guī)范性必須考慮以下3個方面。

3.2.1 ADMSCs 的來源與制備ADMSCs 的低免疫原性優(yōu)勢決定治療腦癱的ADMSCs來源可以是自體的，也可以是異體的。有研究表示來自異體的ADMSCs 和自體的ADMSCs 在作用上沒有差異，甚至接受同種異體MSCs 的患者較自體的不良反應(yīng)更少［26］；但也有研究表明不同脂肪組織來源的ADMSCs 的分化能力具有差異性［18］，尤其是肥胖者脂 肪 中 的ADMSCs 分 化 潛 力 較 差［30］，因 此 對ADMSCs 來源的供體者要進行詳細健康檢查。目前，尚沒有統(tǒng)一的ADMSCs制備方法，不同的方法制備質(zhì)量也不同。實驗室中較為安全、有效的方法是將采集到的脂肪組織經(jīng)過緩沖液反復(fù)沖洗以獲得純度較高的脂肪顆粒，隨后用適當(dāng)濃度的Ⅰ型膠原酶或胰蛋白酶對這些脂肪顆粒進行連續(xù)消化離心，接著在無血清培養(yǎng)基內(nèi)貼壁培養(yǎng)傳代擴增，獲取足夠數(shù)量的ADMSCs懸浮液冷凍保存?zhèn)溆茫?6］。

3.2.2 ADMSCs 的鑒定與給藥劑量臨床試驗中給腦癱患兒注射的ADMSCs 試劑必須根據(jù)《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》的標準進行鑒定［31］?？紤]到傳代擴增帶來的影響，臨床試驗中一般應(yīng)采用3～5 代的ADMSCs。采用流式細胞技術(shù)對其表面的標志物進行鑒定，鑒定結(jié)果必須要符合國際細胞治療協(xié)會規(guī)定的3 個標準［32］，才能保證治療的安全性。采用臺盼藍染色和排除試驗測定制備的ADMSCs 試劑存活率＞80%［26］，才能保證治療的有效性。此外，還要對試劑進行細菌、支原體、內(nèi)外源致病因子、內(nèi)毒素水平、致瘤風(fēng)險等檢測［3，33］。只有給予足夠數(shù)量的干細胞才能起到一定的療效，但各臨床試驗的給藥劑量不一致。在國內(nèi)針對神經(jīng)恢復(fù)的臨床細胞治療指南中建議通過靜脈注射的方式UCMSCs 的給藥劑量在5×105個·kg-1～8×105個·kg-1是安全可行的［34］，但實際臨床試驗中遠遠超過了這個劑量。

3.2.3 ADMSCs 的給藥途徑影響ADMSCs 治療腦癱療效的主要因素在于ADMSCs能否準確到達受損部位?，F(xiàn)有干細胞治療給藥途徑包括腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔注射、腦立體定向手術(shù)和靜脈注射等［4］。其中前兩種給藥方式能夠更有效地將細胞輸送到受損的腦組織區(qū)域，治療效果更明顯，但其給藥過程具有較大的侵入性且不易控制治療劑量，由此增加患兒的不良反應(yīng)，甚至出現(xiàn)繼發(fā)性損傷［4，35］。靜脈注射相對比較安全，但注射后細胞大部分停留在肺毛細血管網(wǎng)中很難到達腦受損部位［36］，必須加大治療劑量才能達到治療作用，增加了治療成本和肺栓塞形成的風(fēng)險。目前，還沒有對這三種給藥途徑的差異性進行研究對比的報道。在已開展的臨床試驗中大多采用靜脈注射重復(fù)間隔給藥方式，但對于年齡較大、癥狀較重的受試者可以考慮前兩種給藥方式。

3.3 臨床試驗的安全性和療效評估在臨床試驗的過程中，要重視對受試對象安全性及療效的客觀反映才能使試驗結(jié)果具有科研價值。在安全性評估方面，所有開展的臨床試驗都必須嚴格遵守《干細胞臨床研究管理辦法（試行）》的規(guī)定進行［37］。在試驗前要對受試者進行全面的體格檢查、實驗室檢查、心電圖、胸片、腦部核磁共振等。有癲癇史、肝或腎功能不全、凝血功能障礙、嚴重過敏性或自身免疫性疾病等高危風(fēng)險的患兒不應(yīng)納入試驗對象［4］。在每次實施ADMSCs 移植時要監(jiān)測受試者的生命體征［33］，移植后要密切關(guān)注其是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，且至少要隨訪半年以上。對于臨床試驗中出現(xiàn)的不良反應(yīng)如發(fā)熱、呼吸困難、白細胞減少等，應(yīng)及時予以觀察是否終止試驗并做好記錄。在療效評估方面，臨床檢查和功能評定應(yīng)貫穿整個治療過程。在每次實施ADMSCs移植后應(yīng)該采用各種評估工具詳細地對受試者的運動功能、言語功能、心理狀態(tài)、自我照顧、社會適應(yīng)等方面進行評估，最好采用“雙盲”進行療效評估，以便更加客觀地反映治療效果。目前，常用的療效評估量表有粗大運動功能測 試 量 表（GMFM-88）、改 良 的Ashworth 量 表（MAS）、改良Barthel 指數(shù)量表、腦性癱瘓綜合功能評分量表和語言發(fā)育遲緩量表（S-S）等。這些量表在腦癱療效判斷中具有較好的信度及效度，還可以避免因版權(quán)問題受到限制［38］。

4 小 結(jié)

盡管ADMSCs 治療腦癱的前景是樂觀的，但臨床推廣仍存在一些爭議。例如，通過靜脈注射方式移植的ADMSCs 除在受損部位可檢測到外，也會在肺和心臟等器官發(fā)現(xiàn)，且一段時間后很難在體內(nèi)再檢測到ADMSCs。這就增加了我們對ADMSCs 長期治療作用的爭議性和向腫瘤細胞分化的擔(dān)憂，從而限制臨床試驗的開展。其實目前對ADMSCs治療腦癱最大的問題在于ADMSCs的體內(nèi)增殖分化機制尚不完全明確以及缺少治療后長期隨訪的療效評價。其他方面的問題有：因腦癱疾病診斷的滯后性，在治療時機上錯過最佳的治療時間；缺少大樣本的受試對象；聯(lián)合治療不規(guī)范以及最佳治療劑量的未知等?？傊?，ADMSCs 憑借其良好的生物學(xué)特性在治療腦癱上展現(xiàn)出極大的潛力，現(xiàn)有的臨床試驗也表現(xiàn)出積極的結(jié)果。但由于基礎(chǔ)研究欠缺和已開展的臨床試驗較少，我們還需要對ADMSCs 在體內(nèi)的分化機制、最佳治療時機、最佳治療劑量等做進一步的研究。相信隨著研究的深入開展，ADMSCs 移植治療腦癱有望徹底實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。