糞大腸菌群檢測方法探究

潘均悅

（山西省地質礦產研究院，山西太原 030001）

糞大腸菌群是大腸菌群的一種，具體可以分為4類，分別是腸桿菌屬、大腸埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬和克雷伯菌屬。糞大腸菌群屬于革蘭氏陰性無芽孢桿菌，是好氧、兼性厭氧菌，能夠發(fā)酵，分解乳糖產生酸和二氧化碳等氣體[1]。除了在人體中可以檢測到，糞大腸菌還可在排泄物中檢測出來。但有研究者從各地的水體中也檢測出來有此菌群，說明即使在不是糞便污染的情況下，也有可能在水體中檢測到該菌群。如果水流上游甚至下游被糞便污染，水流動中可能將整個水體污染，從而引發(fā)腸道病原菌感染及相關疾病。而糞大腸菌群檢測就是反應糞便對水體污染情況的檢測手段。因此，通過糞大腸菌群檢測，對監(jiān)測水源處糞大腸菌群的污染狀況，從而進行有效、及時、可靠的預測以及對流行疾病及時的控制與傳播有著重要意義。

1 糞大腸菌群檢測方法

1.1 發(fā)酵法

1.1.1 原理

大腸菌群可分解乳糖，產酸產氣，使多管發(fā)酵過程中乳糖蛋白胨培養(yǎng)基逐漸變?yōu)辄S色，且有氣泡產生。

1.1.2 檢測步驟

糞大腸菌群可以通過乳糖蛋白胨多管發(fā)酵，具體實驗培養(yǎng)流程有如下5個步驟[2]。

（1）無菌實驗，即經過滅菌消毒等過程，保證實驗環(huán)境無菌；對照試驗，即保證其他無關因素相同，與實驗組形成對照。

（2）提前準備水樣本，設置5組實驗組，按照水樣的污染程度確定接種量，一般選取10.00 mL、1.00 mL、0.10 mL、0.01 mL等。

（3）制備3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液或一般濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，若接種體積為10 mL，則使用3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液；若接種體積為1 mL或小于1 mL，則使用一般濃度培養(yǎng)液。

（4）進行初發(fā)酵實驗，首先將檢測水樣進行攪拌混合均勻，然后接種到裝有培養(yǎng)液的試管中，同時要保證儲存試管和5份培養(yǎng)液都是已滅菌無雜質的狀態(tài)。在（37.5±0.5）℃條件下培養(yǎng)（24±2）h。若產酸產氣，則說明該試管為陽性。

（5）進行復發(fā)酵實驗，輕微振蕩初發(fā)酵實驗中呈陽性的試管，在溫度為（44.5±0.5）℃的恒溫條件下放置培養(yǎng)（24±2）h。在發(fā)酵過程中，由于水樣中菌群種類可能不只是目標菌群，培養(yǎng)基中可能會生長出其他種類菌落。為了保證目標菌群的純度，需要將其他菌落提取出來，置于EC肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，要求在溫度（44.5±0.5）℃的條件下培養(yǎng)（24±2）h并進行觀測。觀測過程中，如果有陽性產氣現象，則證明有大腸菌群生長。發(fā)酵過程中，利用最大可能數MPN值和MPN指數的關系進行計算。

乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法是至今為止我國最常使用的糞大腸菌群檢測方法，也在各個國家中廣泛使用。各界研究人員對此檢測方法的認識達成了一致，因此乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法屬于國際標準方法。這種檢測方法的優(yōu)點：操作起來所需成本如財力物力人力較低，對操控的技術要求不高，在技術方面的花費相對較少，同時還能夠得到相對準確的結果。缺點：在實際操作方面步驟繁瑣條件過多，在實驗得出結論時不能馬上使用，需要開展驗證試驗，驗證結果是否準確，但檢測的準確性和可靠程度很容易受到外部環(huán)境的影響，如實驗人員數量、樣品量、實驗容器的無菌狀況等；同時，檢測所需時間也很長。

多管發(fā)酵法的實驗開展需要龐大的實驗團隊才能完成，但一般基層機構的實驗能力無法滿足。在研究人員對實驗方法的不斷改進下，多管發(fā)酵法發(fā)展為五管法、十管法和十五管法等。以十五管法為例，其具體步驟如下：（1）樣品采集，通過肉眼觀察清澈水體，一般為自然流水、城市流動河水和排放污水；（2）樣品稀釋和接種，當接種量小于1 mL時，應對樣品進行10倍或100倍的稀釋。無菌條件下，在5支裝有3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中各接種樣品10 mL，在10支裝有單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，5支接種樣品1 mL，5支接種樣品0.1 mL；（3）將接種后的試管在（37±0.5）℃下培養(yǎng)（24±2）h進行初發(fā)酵實驗，選擇產酸產氣的陽性試管進行復發(fā)酵實驗，在（44.5±0.5）℃下培養(yǎng)（24±2）h后進行對照觀察及計算。

1.2 濾膜法

1.2.1 原理

提前對實驗儀器及實驗環(huán)境進行滅菌處理，在過濾器中放入微孔濾膜，將水樣緩慢倒入過濾器中，應用抽濾法進行過濾。抽濾過后，菌種將會過濾吸附在濾膜表面。制備糞大腸桿菌培養(yǎng)基（MFC選擇性培養(yǎng)基），并將濾膜貼合在培養(yǎng)基表面進行接種，保持環(huán)境溫度為（44.5±0.5）℃恒溫，進行培養(yǎng)觀察。待培養(yǎng)基上長出糞大腸菌群后，觀察是否符合菌群特征，然后進行數量統(tǒng)計，并計算平均每升水樣中糞大腸菌群的數量。

1.2.2 檢測方法

（1）過濾檢測水樣，使用無雜質無菌的工具鑷起滅菌濾膜的邊緣，將細膩的一面放在下面，在過濾器中貼合濾床，并進行滅菌，加入10 mL無菌清澈水樣，再用已滅菌無雜質的吸管提取混勻均勻的待檢測水樣，打開過濾器閥門，在負壓50 kPa下進行抽濾。

（2）培養(yǎng)細菌，水樣濾完后，繼續(xù)抽出實驗儀器中的氣體5 s，并關閉過濾器的閥門。對操作工具進行滅菌，將過濾器下置，帶菌濾膜放置到MFC培養(yǎng)基表面，進行接種。注意在接種時要將濾膜吸附菌種的一面朝上，且濾膜應當緊貼培養(yǎng)基，以避免菌種無法正常生長。培養(yǎng)操作完成后，將培養(yǎng)皿密封倒置于培養(yǎng)箱中，保持（44.5±0.5）℃恒溫環(huán)境，培養(yǎng)（24±2）h。

（3）統(tǒng)計數據并報告結果，對菌落數量進行觀察計數。因為糞大腸桿菌菌落為藍色或藍綠色，很容易和其他菌落顏色區(qū)別開來；且在培養(yǎng)環(huán)境溫度下，其他菌落或與培養(yǎng)基試劑反應，或不易生長，所以MFC培養(yǎng)基上大部分是糞大腸菌群菌落。如有疑似菌種，則可將疑似菌落滴入EC培養(yǎng)液，保持（44.5±0.5）℃恒溫，并培養(yǎng)觀測（24±2）h。統(tǒng)計顏色為藍色或藍綠色的糞大腸菌群菌落，根據體積和濃度關系，通過公式1計算得出每升水樣中糞大腸菌群菌落的數量。

其中，菌群菌落數目單位為個/L，過濾水樣量單位為mL。

1.3 紙片快速檢測法

1.3.1 原理

實驗所采用的濾紙吸收選擇性的培養(yǎng)基，需要將濾紙與培養(yǎng)基貼合，在特定溫度下培養(yǎng)24 h。細菌繁殖會產生酸，可使溴甲酚紫指示劑變?yōu)辄S色，且脫氫酶會將底物還原成三苯甲臜，顯紅色，故觀察到的現象為黃色背景下出現紅色斑點。通過以上現象便可判斷樣品中大腸菌群存在與否及濃度。

1.3.2 檢測方法

紙片快速檢測法和發(fā)酵法的實驗相似：（1）取10 mL水樣接種，需要選取接種所用的5張紙片，規(guī)格為15 cm×l0 cm；（2）取1 mL水樣接種，需要選取接種所用的10張紙片，規(guī)格為5 cm×6 cm，用5張紙片進行常規(guī)接種，另外5張紙片接種檢測水樣10倍稀釋液各1 mL；（3）在恒溫（44.5±0.5）℃的環(huán)境下放置18～24 h，觀察并統(tǒng)計菌落數，統(tǒng)計紙片陽性情況，并與MPN值表進行比較。其中，陰性陽性判斷準則如下：菌落顏色為紫紅色，外部伴有黃色圓圈，則為陽性；菌落形狀為片狀，顏色為紅色，外部伴有黃色圓圈，則為陰性。

1.4 酶底物法

1.4.1 原理

大腸菌群菌落能夠產生半乳糖苷酶，從而分解乳糖，使培養(yǎng)基有菌部分變?yōu)辄S色；而大腸埃希氏菌葡萄糖醛酸酶，可以分解葡萄糖，產生的物質可在366 nm波長處進行紫外檢測，觀測顯示熒光現象，從而可以定量統(tǒng)計出糞大腸菌群數[3-4]。

1.4.2 檢測方法

（1）酶底物檢測法選用51孔的定量盤法，定量盤法是一種以MPN為基礎的方法。（2）檢測水樣容量為100 mL，先使用100 mL無菌無雜質的量瓶量取出100 mL測試水樣，并在水樣中加入一定量的MMO－MUG粉末，攪拌均勻。（3）準備容量為5 L的無菌定量盤，將制備好的水樣溶液倒入其中。（4）用工具消除定量盤內的氣泡，并進行密封操作。（5）在培養(yǎng)箱內設置（44.5±0.5）℃的恒溫環(huán)境，并進行觀測，培養(yǎng)（24±2）h，若檢測水樣變黃，則說明大腸菌群菌落的存在。

2 不同檢測方法的檢測效果對比

如表1所示，為糞大腸菌群各檢測方法的比較。由表1可知，發(fā)酵法和濾膜法實驗步驟多、干擾多、可行度不夠高，且實驗周期比較長，實際應用不太方便。紙片快速檢測法與發(fā)酵法相比，只需要保持溫度（44.5±0.5）℃，時間在18～24 h就可得出結果，檢測較快捷，通常用在需要快速出結果的檢測任務中。酶底物法操作簡單，用時短，只需要進行一次實驗就可滿足檢測要求，但花費較高[5]。

表1 糞大腸菌群各檢測方法比較

3 結語

我國科學技術和生物化學檢測技術在不斷進步，糞大腸菌群的檢測方式也更加多樣，用時更短，可信度和實驗效率更高。目前比較通用的方法有發(fā)酵法、酶底物法、濾膜法等，各種檢測方法都有其存在合理性，通過今后不懈的努力，會研究出更多、更實用的檢測方法，如進一步縮減檢測的花費成本、縮減檢測等待的時間、加強檢驗效率和結果可信度等，并賦予糞大腸菌群檢測更多的使用價值。