不同單一酸化劑及復(fù)合酸化劑體外抑菌能力比較研究

雷 燕，李瀚林，曾凡坤，孔 凌

（1.宜賓學(xué)院質(zhì)量管理與檢驗(yàn)檢測(cè)學(xué)部，四川宜賓644000；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川成都611130；3.英國(guó)百沃英生物科技有限公司上海代表處，上海201600；4.西南科技大學(xué)，四川綿陽(yáng)621010）

酸化劑替代抗生素的效果較為穩(wěn)定，在動(dòng)物腸道健康中扮演著重要角色[1]。酸化劑在飼料中可以酸化飼料，降低飼料系酸力，改善飼料的適口性，從而提高動(dòng)物采食量。酸化劑在幼齡動(dòng)物機(jī)體中，可以起到補(bǔ)充胃酸不足，提高飼料的消化利用率，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等作用[2-4]。目前，市場(chǎng)上主流產(chǎn)品分為以補(bǔ)充胃酸不足的消化酸和以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的殺菌酸，形式以單一酸和復(fù)合酸為主。禁抗背景下，對(duì)于酸化劑的評(píng)估主要考慮提供氫離子的能力、殺菌能力、適口性等特點(diǎn)。

大腸桿菌（G-）、金色葡萄球菌（G+）是引起畜禽疾病的主要細(xì)菌，其流行范圍廣、發(fā)病率高，給畜禽養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。研究表明，不同的酸化劑可抑制大腸桿菌和金色葡萄球菌的生長(zhǎng)[8-10]。酸化劑抑菌作用主要通過(guò)2個(gè)路徑實(shí)現(xiàn)：一是在水溶液中通過(guò)解離出的H+，降低有害微生物生存環(huán)境的pH值，從而抑制有害微生物的生長(zhǎng)；另一路徑是小分子的有機(jī)酸可以透過(guò)病原菌細(xì)胞壁，進(jìn)入其細(xì)胞內(nèi)解離出H+，病原菌因極力排除H+消耗ATP耗能而死，同時(shí)酸根離子還能干擾細(xì)菌DNA和RNA的合成，破壞病原菌細(xì)胞膜的完整性，達(dá)到抑菌殺菌的作用[1,11-13]。本試驗(yàn)通過(guò)菌落法考察不同單一酸化劑以及復(fù)合酸在同等酸度的條件下抑菌能力的大小，為酸化劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

不同的單一酸化劑及復(fù)合酸化劑均由成都大帝生物科技有限公司提供。

無(wú)水乙醇（99.8%，分析純）；0.9%生理鹽水；LB肉湯培養(yǎng)基（杭州百思生物科技有限公司；活化菌種）；大腸桿菌、金色葡萄球菌抑菌圈培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂（杭州百思生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液配置

配置LB肉湯，經(jīng)滅菌后分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，放至好氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，用滅菌生理鹽水稀釋原菌液至10-3，作為試驗(yàn)用菌懸液。對(duì)照選用無(wú)菌蒸餾水。

1.2.2 樣品前處理

酸化劑及復(fù)合酸酸度均以5 kg/t乳酸計(jì)。樣品前處理見(jiàn)表1。

表1 樣品前處理Tab.1 Samplepretreatment

1.2.3 涂布菌懸液

按照說(shuō)明書(shū)要求配制選擇培養(yǎng)基，稀釋原菌液至10-3，用移液槍準(zhǔn)確吸取150μL制備好的菌懸液，分別均勻涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

分別將不同酸化劑，按照表1設(shè)計(jì)添加量，準(zhǔn)確稱取（感量0.001 g）至100 mL無(wú)菌容量瓶中，用無(wú)菌LB肉湯培養(yǎng)基（熱）溶解，待冷卻后再用LB肉湯稀釋至刻度，然后采用超聲50°C助溶30 min，制備成酸化劑溶解液。在無(wú)菌條件下，準(zhǔn)確移取酸化劑制備溶解液9 mL于滅菌試管中，再用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL制備好的大腸桿菌、金色葡萄球菌10-3菌懸液接種于盛有9 mL酸化劑溶解液的試管中，混勻蓋塞，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)；取出培養(yǎng)好的LB抑菌培養(yǎng)菌懸液，在無(wú)菌條件下，用移液管分別準(zhǔn)確移取經(jīng)培養(yǎng)后LB抑菌培養(yǎng)菌懸液1 mL接種于盛有9 mL生理鹽水中做10-1稀釋，選擇10-3稀釋倍數(shù)菌懸液作為涂布用菌懸液，用移液槍準(zhǔn)確吸取150μL制備好的菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中涂布均勻，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h，取出，觀察菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

不同酸化劑對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果（見(jiàn)表2、表3）

金色葡萄球菌和大腸桿菌平板37℃培養(yǎng)20～24 h后，計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)（CFU）。

由表2可知，在同等酸度（以乳酸計(jì)）條件下，不同酸化劑對(duì)金色葡萄球菌的抑菌強(qiáng)弱順序?yàn)椋簭?fù)合酸化劑＞甲酸＞苯甲酸＞富馬酸＞磷酸、乳酸、檸檬酸＞空白。

表2 不同酸化劑對(duì)金色葡萄球菌抑菌效果Tab.2 Antibacterial effects of different acidifierson Staphylococcusaureus

由表3可知，在同等酸度（以乳酸計(jì)）條件下，不同酸化劑對(duì)大腸桿菌的抑菌效果由強(qiáng)到弱的排列順序?yàn)椋簭?fù)合酸化劑＞富馬酸＞檸檬酸＞磷酸、苯甲酸、甲酸、乳酸＞空白。

表3 不同酸化劑對(duì)大腸桿菌平板菌落數(shù)計(jì)數(shù)Tab.3 Antibacterial effects of different acidifierson E.coli

3 討論

研究表明，單一酸化劑對(duì)于動(dòng)物的生長(zhǎng)性能可以起到促進(jìn)效果，比如甲酸、檸檬酸以及苯甲酸在斷奶仔豬日糧以及育成豬日糧中添加，可以促進(jìn)生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率[14-16]。富馬酸可以提高仔豬的回腸消化率，有效促進(jìn)仔豬平均日增重以及飼料轉(zhuǎn)化率[17-19]。酸化劑促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能與其抑菌殺菌作用密切相關(guān)[1,11-13]。本試驗(yàn)中，單一酸化劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金色葡萄球菌抑菌能力依次為：甲酸＞苯甲酸＞富馬酸＞磷酸、乳酸、檸檬酸；對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌抑菌能力依次為：富馬酸＞檸檬酸＞磷酸、苯甲酸、甲酸、乳酸。有研究報(bào)道，甲酸、乙酸和丙酸的復(fù)合使用可以顯著降低家禽腸道內(nèi)的彎曲桿菌數(shù)量[20]，并且復(fù)合酸化劑可以有效降低肉雞腸道中的大腸桿菌數(shù)量[21]。本試驗(yàn)研究表明，在同等酸度條件下，復(fù)合酸化劑的抑菌能力優(yōu)于單一酸化劑。在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)也得到類似結(jié)果，在早期斷奶仔豬日糧中，添加復(fù)合酸化劑的效果優(yōu)于單一酸化劑[22]。

不同的單一酸化劑，其溶解性及理化性質(zhì)不同。因此，對(duì)不同的病原菌表現(xiàn)出不同的抑菌性能[23]，幾種單一酸化劑復(fù)配在一起，起到一定的協(xié)同作用，可起到協(xié)同增效的效果。使用檸檬酸以及山梨酸可以提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，調(diào)節(jié)腸道代謝[24]；有機(jī)酸以及無(wú)機(jī)酸的混合可以減低大腸桿菌數(shù)量，同時(shí)提高乳酸菌數(shù)量[25]。因此，很多的商業(yè)產(chǎn)品使用酸化劑或其鹽的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。然而，在使用每種酸化劑之前，需要具體考慮其抑制作用及效果[26]，更需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合酸以及單一酸化劑在體外抑菌試驗(yàn)中，對(duì)大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，復(fù)合酸的效果優(yōu)于單一酸化劑。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，需要對(duì)單一酸化劑以及復(fù)合酸化劑進(jìn)行綜合評(píng)估，選擇最佳的酸化劑品種及劑量。