右美托咪定對(duì)豬體外循環(huán)下心肌線粒體功能的影響

吳建江，戴曉雯，王 江

心肺轉(zhuǎn)流（cardiopulmonary bypass， CPB）是心臟外科手術(shù)中常用的心臟輔助技術(shù)，同時(shí)可引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征并影響患者預(yù)后，其炎癥反應(yīng)包括激活血小板、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加以及微血管損傷。 這些炎癥反應(yīng)與心肌缺血再灌注（Ischemia／reperfu?sion，I／R）損傷有關(guān)，導(dǎo)致心肌梗死、呼吸衰竭、腎和神經(jīng)功能障礙、出血過多、肝功能改變、多器官衰竭等以及死亡［1］。 右美托咪 定 （Dexmedetomidine，Dex）是一種選擇性的α2－腎上腺素能激動(dòng)劑，被廣泛用于CPB 下心臟手術(shù)患者的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛，Dex 作用于交感神經(jīng)末梢的α2－腎上腺素能受體，抑制去甲腎上腺素的釋放［2］。 已經(jīng)顯示α2－腎上腺素能激動(dòng)劑可以保護(hù)缺血性心肌，Dex 抑制了再灌注后血漿去甲腎上腺素濃度的增加，表明Dex 通過直接作用于心肌而不是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)的心肌，發(fā)揮抗 I／R 損傷的保護(hù)作用［3］。 但 Dex 對(duì) CPB 后心肌線粒體功能的影響仍未完全闡明，本研究旨在評(píng)估Dex 是否能減輕CPB 下心肌線粒體損傷，為降低臨床心臟手術(shù)后高發(fā)病率和死亡率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康小型豬體重（33±3）kg，按數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組（6 只／組）：CPB組（T 組）建立 CPB；CPB＋Dex（D 組）麻醉誘導(dǎo)前給予以 1 μg／kg 的 Dex 輸注，速率為 0.5 μg／（kg·h）并建立CPB。 由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，并依照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院發(fā)布的有關(guān)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)及使用指南（1996 年修改版）。

1.2 CPB 模型的建立 小型豬靜脈注射，行氣管插管后胸部正中切口，電鋸劈開胸骨，切開心包，切緣吊于胸壁，靜脈注射肝素3 mg／kg 系統(tǒng)肝素化后，分別在升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈根部、上腔靜脈、下腔靜脈縫荷包備用。 升主動(dòng)脈（12 F）、上腔靜脈（10 F）、下腔靜脈（12 F）予以插管并固定，連接人工心肺機(jī)。 主動(dòng)脈根部荷包中央插入并固定16 號(hào)套管針，連接冷灌裝置。各組均以羥乙基淀粉130／0.4 氯化鈉注射液預(yù)充，預(yù)充總量 30 ～40 ml／kg，維持流量 120 ～160 ml／（kg·min），將紅細(xì)胞壓積保持在 0.20～0.25。 阻斷升主動(dòng)脈后在主動(dòng)脈根部灌注4℃改良del Nido 心臟停搏液15 ml／kg，停跳 60 min 后開放升主動(dòng)脈，輔助循環(huán)120 min。 復(fù)跳期間酌情使用血管活性藥物維持循環(huán)穩(wěn)定，如有惡性心律失常予以交流電復(fù)律。

1.3 監(jiān)測(cè)時(shí)點(diǎn)及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 兩組的觀察時(shí)間點(diǎn)為麻醉前（T0）、CPB 建立后（T1）、心臟復(fù)跳后5 min（T2）、心臟復(fù)跳后 60 min（T3）和心臟復(fù)跳后120 min（T4）。 Powerlab／8SP 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)于復(fù)灌末分別記錄：心率（heart rate， HR）、左室收縮峰壓（left ventricular systolic pressure， LVPSP）、 左室舒張末壓（left ventricular end－diatolic pressure， LV?EDP）、左心室內(nèi)壓上升最大速率（＋dp／dtmax）和左心室內(nèi)壓下降最大速率（－dp／dtmax）。

1.4 電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)排列形態(tài)改變 心臟灌流結(jié)束后，取下心臟，用雙面刀片在左室游離壁處取材。 心室肌切成1 mm3的小塊，用4℃戊二醛磷酸緩沖液固定液24 h，常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色、制成50～70 nm 的超薄切片，透射電子顯微鏡（trans?mission electron microscopy， TEM）下，觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 ELISA 法檢測(cè) 利用肌酸磷酸激酶同工酶（creatine phosphokinase MB， CKMB）和心肌肌鈣蛋白 I （ cardiac troponin I， cTnI） 試 劑 盒 （ Sigma －Aldrich，美國(guó)）檢測(cè)血清中CKMB 和cTnI 含量。

1.6 Western blot 分析 再灌注末每組取剪取左心室缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌組織，立刻置于液氮保存。 提取心肌組織總蛋白，采用組織裂解液裂解，取樣品30 μg，在 SDS－PAGE 凝膠系統(tǒng)中電泳，轉(zhuǎn)膜，于37℃封閉2 h，加入兔抗豬錳－超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase， Mn－SOD）1 μg／ml（Stressgen Biotechnologies，加拿大）孵育過夜（4℃），TBST 液洗膜后與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗1 ∶5 000 室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光（electro－chemi－luminescence， ECL）顯色成像，應(yīng)用 Quantity One 2.6.2 圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7 心肌ATP 含量測(cè)定 ATP 測(cè)定試劑盒是基于熒光素－熒光素酶反應(yīng)來定量心肌ATP 含量，通過反相高效液相色譜法測(cè)定心肌磷酸肌酸的濃度。 糖原檢測(cè)試劑盒用于測(cè)定心肌中糖原的濃度［4］。

1.8 線粒體活性氧（reactive oxygen，ROS）產(chǎn)生的測(cè)定 通過熒光測(cè)定方法檢測(cè)線粒體ROS 的產(chǎn)生率［5］。 在一個(gè)線粒體反應(yīng)體系中，將 2.9 ml 線粒體ROS 測(cè)定培養(yǎng)基和0.5 mg 線粒體加入到3 ml 石英比色皿中。 在另一個(gè)線粒體反應(yīng)體系中，加入5 mmol／L 2＇，7＇－二氯熒光素二乙酸酯（DCFH－DA）3 μl 之前，使用 3.3 mmol／L 不含線粒體的琥珀酸作為底物，這一反應(yīng)體系在37℃孵育15 min，測(cè)定線粒體反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度（樣品熒光強(qiáng)度）和無(wú)線粒體反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度（基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度），通過從樣品熒光強(qiáng)度中減去基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度來計(jì)算ROS 產(chǎn)生速率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 GraphPad Prism 7.0（Graph?Pad Software，San Diego，CA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（D）表示，所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。 兩組間使用 Student＇st檢驗(yàn)。 多組間采用單因素方差分析，并進(jìn)行圖基（tukey）事后檢驗(yàn)法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心功能指標(biāo) 與 T 組比較，D 組 LVPSP 和＋dp／dtmax在 T2、T3 和 T4 各時(shí)點(diǎn)明顯增加，－dp／dtmax在 T3 和 T4 明顯增加（P＜0.05），而 LVEDP 在再灌注開始時(shí)顯著降低（P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組動(dòng)物血流動(dòng)力學(xué)變化（n＝6，D）

表1 兩組動(dòng)物血流動(dòng)力學(xué)變化（n＝6，D）

注：HR：心率；LVPSP：左室收縮峰壓；LVEDP：左室舒張末壓；＋dp／dtmax：左心室內(nèi)壓上升最大速率；－dp／dtmax 左心室內(nèi)壓下降最大速率

指標(biāo) 時(shí)點(diǎn) T 組 D 組 P 值HR（次／min） T0 93.67±19.77 90.33±17.76 0.944 T1 93.33±10.25 97.33±13.22 0.883 T2 76.50±12.88 81.83±20.31 0.599 T3 84.17±12.40 85.50±17.33 0.881 T4 90.83±13.38 86.67±15.69 0.631 LVPSP（mmHg） T0 122.33±9.54 123.83±5.23 0.944 T1 120.17±9.07 121.50±5.47 0.754 T2 73.67±5.54 86.60±5.57 0.003 T3 83.83±5.42 103.83±5.81 0.001 T4 86.83±5.81 99.17±7.20 0.008 LVEDP（mmHg） T0 15.83±2.32 16.17±2.14 0.792 T1 16.17±1.17 17.18±1.33 0.397 T2 32.33±2.16 23.33±2.23 0.001 T3 30.17±3.49 21.67±1.51 0.001 T4 24.17±1.84 17.83±1.47 0.001＋dp／dtmax（mmHg／s） T0 2 131.67±188.31 2 245±236.37 0.357 T1 2 115±305.00 2 065±174.90 0.698 T2 1 430±278.93 1 918.33±118.22 0.006 T3 1 655±290.16 2 155±180.42 0.005 T4 1 664.83±232.52 2 103.33±189.21 0.004－dp／dtmax（mmHg／s） T0 2 468.33±233.62 2 631.67±239.79 0.143 T1 2 501.67±288.20 2 283.33±670.57 0.686 T2 1 928.33±428.65 2 243.33±284.16 0.164 T3 1 935±290.16 2 423.33±152.67 0.004 T4 2 133.33±140.24 2 392.33±155.13 0.012

2.2 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)與形態(tài) T 組心肌結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，肌絲溶解甚至斷裂；線粒體腫脹明顯，嵴膜間隙增寬、破裂，肌漿網(wǎng)高度擴(kuò)張。 D 組心肌清晰，肌絲排列尚整齊，部分肌絲及肌節(jié)間隙增寬并溶解；線粒體大多數(shù)形態(tài)完整，數(shù)量較多；嵴膜清晰可見，但未見溶解破裂。 見圖1。

圖1 兩組心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)與形態(tài)變化（×30 000）

2.3 心肌 CKMB 和 cTnI 水平 在 T4 時(shí)，兩組的CKMB 值持續(xù)增加，與 T 組相比，D 組中的 CKMB 值顯著降低（P＜0.05）。 在 T3 和 T4 時(shí)，兩組的 cTnI值均增加，與T 組相比，D 組中的cTnI 值顯著降低（P＜0.05）。 見表 2。

表2 兩組樣本血清中CKMB 和cTnI 含量變化（n＝6，D）

表2 兩組樣本血清中CKMB 和cTnI 含量變化（n＝6，D）

注：CKMB：肌酸激酶同工酶；cTnI：肌鈣蛋白I

CKMB（μg／L）cTnI（mg／L）時(shí)點(diǎn)T 組 D 組 P 值T 組 D 組 P 值T0 5.32±0.73 5.43±0.57 0.692 0.37±0.23 0.41±0.27 0.830 T1 6.76±1.17 6.35±0.98 0.488 3.37±0.88 3.59±0.84 0.603 T2 11.24±1.57 11.32±1.24 0.744 10.57±1.78 11.19±1.50 0.381 T3 26.94±3.30 27.34±2.73 0.563 25.40±3.87 21.14±2.90 0.046 T4 41.58±4.38 33.94±3.89 0.019 53.61±7.18 41.84±8.12 0.026

2.4 心肌 Mn－SOD、ROS 產(chǎn)生率和 ATP 含量 在 T4時(shí)檢測(cè)心肌 Mn－SOD、ROS 產(chǎn)生率和 ATP 含量，T 組的線粒體 ROS 產(chǎn)生率明顯高于 D 組（P＜0.001），與T 組相比，D 組中的 Mn－SOD 和 ATP 含量顯著升高（P＜0.001）。 見表 3。

表3 兩組樣本心肌Mn－SOD、ROS 產(chǎn)生率和ATP 含量變化（n＝6，D）

表3 兩組樣本心肌Mn－SOD、ROS 產(chǎn)生率和ATP 含量變化（n＝6，D）

注：Mn－SOD：錳超氧化物歧化酶；ROS：活性氧

指標(biāo) T 組 D 組 P 值Mn－SOD 0.22±0.12 0.76±0.17 ＜0.001 ROS 產(chǎn)生率 ［U／（s·mg）］13.05±2.31 6.95±0.97 ＜0.001 ATP 含量（nmol／g） 2.66±0.78 7.23±1.02 ＜0.001

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)Dex 能減輕CPB 導(dǎo)致的心肌缺血／再灌注損傷，穩(wěn)定心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能，減少線粒體ROS 產(chǎn)生，增加線粒體ATP 含量，從而減少心肌細(xì)胞 I／R 損傷。

前期研究證實(shí)Dex 可以保護(hù)心肌并調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈血流量，Dex 對(duì)冠狀動(dòng)脈張力具有調(diào)節(jié)作用，尤其較低濃度的Dex 的冠狀動(dòng)脈舒張作用可能與內(nèi)皮完整性，一氧化氮合成和大電導(dǎo)鈣激活鉀通道激活有關(guān)，從而起到心肌保護(hù)作用［6］。 然而，遺憾的是CPB下心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重，那么Dex 能否在實(shí)施CPB 的心臟手術(shù)中減輕心肌線粒體功能受損？ 臨床工作中，盡管多種方法能有效改善I／R 損傷，但在接受心臟手術(shù)的患者中，死亡率和發(fā)病率仍居高不下。

CPB 技術(shù)是心臟手術(shù)最為有效的輔助手段，但存在快速恢復(fù)冠脈缺血區(qū)血流量，而再灌注可能會(huì)誘發(fā)心肌I／R 損傷。 為了證實(shí)上述假設(shè)，筆者觀察健康小型豬實(shí)施CPB 中使用Dex 能否減輕心肌I／R損傷，能否上調(diào)并穩(wěn)定心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能，減少線粒體ROS 產(chǎn)生，增加線粒體ATP 含量，從而減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。 研究結(jié)果顯示：與T 組相比，D 組血清中 CKMB 和 cTnI 降低，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，Mn－SOD 水平升高，線粒體 ATP 含量增加、線粒體ROS 產(chǎn)生率降低，表明CPB 中使用Dex能獲得更好的心肌保護(hù)效果。

前期研究顯示Dex 具有多種器官保護(hù)作用，可以保護(hù)心肌并調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈血流量［6］。 Dex 以劑量依賴性方式降低腦電雙頻指數(shù)值、平均動(dòng)脈血壓、心率、心輸出量和混合靜脈血氧飽和度［7］。 Dex 減少了膽堿能電場(chǎng)刺激誘導(dǎo)的豚鼠氣管收縮和乙酰膽堿釋放，同時(shí)也減弱了外源性乙酰膽堿引起的收縮和C－纖維介導(dǎo)的收縮，提示Dex 具有直接氣道平滑肌作用和抑制咳嗽的潛在機(jī)制［8］。 在敗血癥動(dòng)物中使用Dex 后，心率降低，平均動(dòng)脈壓降低得到緩解，膿毒癥動(dòng)物的中心靜脈壓穩(wěn)定，并改善膿毒癥引起的肺功能異常［9］。 但是，大劑量靜脈注射 Dex 可引起中度局部冠狀動(dòng)脈血管收縮，而在幼小家豬中沒有代謝性心肌缺血跡象，同時(shí)在全身循環(huán)中出現(xiàn)明顯的血管收縮反應(yīng)［10］。 本結(jié)果顯示，CPB 中靜脈使用小劑量Dex 能明顯穩(wěn)定心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)，同時(shí)，D 組中 Mn－SOD 水平升高表明，減少心肌I／R 損傷期間ROS 升高引起的心肌組織損傷。

本研究結(jié)果表明，CPB 中靜脈使用小劑量Dex能發(fā)揮良好的心肌保護(hù)作用。 然而，本研究存在一定局限性，只觀察到Dex 在CPB 心肌保護(hù)機(jī)制中線粒體功能和形態(tài)的變化，而未涉及關(guān)鍵信號(hào)通路的作用機(jī)制研究。