納爾遜灣正呼腸孤病毒非結(jié)構(gòu)蛋白μN(yùn)S和σNS表達(dá)特性的分析

李藤菲,王詩雨,蔣欣如,孫 淼,李婷婷,林家鋒,王 穎,李永剛,陶曉莉

（錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 錦州121000）

納爾遜海灣正呼腸孤病毒（Nelson Bay orthoreoviruses，NBV），屬于呼腸孤病毒科，為膜融合正呼腸孤病毒，所含核酸具有大中小3類共10段雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）。研究［1-6］證實(shí)：部分NBV是人類呼吸道感染的病原體，一些急性呼吸道疾病患者體內(nèi)分離出的病原體檢測(cè)結(jié)果顯示NBV已經(jīng)進(jìn)化為人畜共患病的形式，且可在人類中傳播。對(duì)哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒（mammalian orthoreovirus，MRV）和禽呼腸孤病毒（avian orthoreovirus，ARV）的研究［7-8］結(jié)果表明：在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NS）μN(yùn)S形成的病毒工廠（viral factories，VF）即包涵體，與感染細(xì)胞中形成的VF相似。隨著對(duì)MRV和ARV的研究可知，μN(yùn)S可以在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和感染的細(xì)胞中形成包涵體，而另一種NSσNS在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和感染的細(xì)胞中也定位于包涵體［9-10］。研究［8，10-11］表明：呼腸孤病毒的復(fù)制和重組均發(fā)生在VF中，但目前尚無有關(guān)NBV中μN(yùn)S和σNS的相關(guān)報(bào)道。本研究分別在重組病毒株NBV-MB病毒感染的細(xì)胞及M 3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)μN(yùn)S和σNS蛋白的表達(dá)特性，通過熒光共定位以及免疫沉淀等技術(shù)檢測(cè)2種蛋白之間的相互作用以及其結(jié)合區(qū)域，以期為進(jìn)一步研究NBV的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和主要試劑幼地鼠腎BHK細(xì)胞購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection Center，ATCC），用 含5%FBS、100 mg·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。重組病毒株為錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室通過將含有NBV全部遺傳信息的10個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-T 7細(xì)胞后成功制備，為與野生病毒株區(qū)分，將其命名為NBV-MB。NP-40裂解液購自上海Beyotime公司，Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國賽默飛世爾科技有限公司，血凝素（hemagglutinin，HA）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶抗鼠和抗兔二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購自美國Gibco公司。

1.2 免疫熒光法檢測(cè)病毒感染性能將單層BHK細(xì)胞接種至玻片上，第2天使細(xì)胞感染NBV，維持培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞用含4%多聚甲醛的PBS緩沖液室溫固定1 h。PBS緩沖液洗滌后，用實(shí)驗(yàn)室自己制備的μN(yùn)S和σNS抗血清孵育；孵育完成后用PBS緩沖液洗滌3次，將細(xì)胞與CF488山羊抗兔IgG熒光二抗或Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG熒光二抗孵育，稀釋比例為1∶1 000。細(xì)胞與4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）共同孵育以標(biāo)記細(xì)胞核，然后用PBS緩沖液洗滌3次。用FluoView FV 1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3 Western blotting法檢測(cè)μN(yùn)S和σNS蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)將NBV感染的BHK細(xì)胞用NP-40裂解液［25 mmol·L－1Tris-HCl、p H 7.4，150 mmol·L－1NaCl，1%NP-40，1%脫 氧 膽 酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）］進(jìn)行裂解，12 000 r·min－1離心5 min，取上清按比例加入4×變性緩沖液后沸水浴5 min進(jìn)行蛋白變性。通過10%SDS-聚丙烯酰胺（polyacry lamide，PAGE）凝膠電泳檢測(cè)。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，用1∶2 000稀釋的σNS、μN(yùn)S抗血清特異性抗體和HA單克隆抗體作為一抗，HRP偶聯(lián)的抗小鼠或稀釋度為1∶2 000的抗兔IgG二抗體孵育后，使用ECL顯影技術(shù)檢測(cè)μN(yùn)S和σNS蛋白表達(dá)量。

1.4 免疫沉淀法檢測(cè)μN(yùn)S和σNS蛋白的相互作用為了進(jìn)一步檢測(cè)μN(yùn)S和σNS蛋白的相互作用，用Lipo 3000轉(zhuǎn)染試劑將p CAG M 3和p EFHAσNS質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，用未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染p EFHAσNS質(zhì)粒組作為對(duì)照，48 h后收集細(xì)胞分別置于1.5 mL離心管并進(jìn)行免疫沉淀。將免疫沉淀獲得的樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，用μN(yùn)S抗血清特異性抗體作為一抗，采用Western blotting法檢測(cè)BHK細(xì)胞中μN(yùn)S蛋白表達(dá)情況并分析μN(yùn)S與σNS蛋白的相互作用。

1.5 σNS的N末端氨基酸（amino acid，aa）缺失質(zhì)粒的載體構(gòu)建為了確定μN(yùn)S和σNS蛋白相互作用結(jié)合區(qū)域，分別制備了σNS的N末端10、20、30、40、50和60個(gè)aa缺失的S3質(zhì)粒，分別命名為pEFHAσNS △ N10、 pEFHAσNS △ N20、p EFHAσNS △ N30、 p EFHAσNS △ N40、pEFHAσNS△N50和pEFHAσNS△N60（表1）。用截短的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，并孵育48 h。通過免疫印跡法分析細(xì)胞裂解物。質(zhì)粒PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證各個(gè)質(zhì)粒的正確性。采用抗HA的單克隆抗體采用Western blotting法檢測(cè)N末端10、20、30、40、50和60個(gè)aa缺失的σNS各個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的蛋白表達(dá)情況。

表1 PCR檢測(cè)中各目的基因引物序列Tab.1Primer squences of each target gene in PCR detection

將pEF1a-HA真核表達(dá)載體通過用BamHI限制性內(nèi)切酶處理獲得線性化載體，將aa截短的序列通過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后采用In-Fusion方法（日本TaKaRa公司）分別將截短的突變體σNS（缺失了N末端10～60個(gè)aa）克隆至線性化真核表達(dá)載體p EF1a-HA中，具體方法按In-Fusion?HD Cloning Kit說明書操作，引物序列見表2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH 5-α感受態(tài)細(xì)胞中，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)菌落。分別挑取測(cè)序正確的陽性菌落進(jìn)行LB培養(yǎng)基搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，并采用AxyPrep質(zhì)粒中量制備試劑盒（美國AXYGEN公司）進(jìn)行質(zhì)粒提取，－20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 各目的基因的上下游引物序列Tab.2Sequences of upstream and downstream primers of each target gene

1.6 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證μN(yùn)S和σNS蛋白相互作用的結(jié)合區(qū)域酵母雙雜交克隆載體p GBKT 7［GAL 4（1-147）DNA-BDTRP1Kan rc-mycepitope標(biāo)簽］用于誘餌構(gòu)建體，pGADT 7［GAL 4（768-881）DNA-ADLEU 2Ampr流感病毒HA表位標(biāo)簽］用于獵物構(gòu)建體（美國Clontech公司）。用BamHI限制性酶切分別處理p GBKT 7、p GADT 7和獲得線性化載體。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行酵母菌轉(zhuǎn)化，AH 109感受態(tài)細(xì)胞購于北京華越洋生物公司，操作方法按照說明書進(jìn)行。分別將酵母轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒涂在相應(yīng)的缺乏色氨酸（－Trp）和缺乏亮氨酸/Trp（－Leu/－Trp）缺陷型培養(yǎng)基上，置于29℃條件下培養(yǎng)；挑取雜交培養(yǎng)結(jié)束的單個(gè)酵母菌落，用蒸餾水稀釋后涂在缺乏腺嘌呤、組氨酸、Leu和Trp（－Ade/－His/－Leu/－Trp）缺陷型培養(yǎng)基上，于29℃條件下培養(yǎng)檢測(cè)。呼腸孤病毒μN(yùn)S編碼的誘餌和獵物（P）質(zhì)粒，編碼σNS或截短的σNS，以成對(duì)組合轉(zhuǎn)化酵母菌株AH 109。通過在－Leu/－Trp缺陷型培養(yǎng)基上生長來選擇表達(dá)誘餌和獵物質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。通過在－Ade/－His/－Leu/－Trp缺陷型培養(yǎng)基上生長來驗(yàn)正μN(yùn)S和σNS蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合區(qū)域。

2 結(jié) 果

2.1 μN(yùn)S和σNS蛋白在BHK細(xì)胞中的表達(dá)和分布為確定μN(yùn)S是否可以在其他NBV-MB蛋白不存在的情況下表達(dá)并形成類似于VF的病毒包涵體，用p CAG M 3轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該載體包含NBV的M 3基因，并用免疫熒光法通過共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染48 h后μN(yùn)S（pt）的亞細(xì)胞分布。轉(zhuǎn)染p CAG M 3質(zhì)粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到小點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的病毒包涵體。用含有來自NBV的S3基因的表達(dá)載體（pEFHAσNS）轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，則σNS蛋白在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中均呈彌散分布，但未形成病毒包涵體。而在共同轉(zhuǎn)染pCAG M 3和pEFHAσNS質(zhì)粒的BHK細(xì)胞中，μN(yùn)S和σNS蛋白可以共同定位于細(xì)胞質(zhì)中，并形成包涵體結(jié)構(gòu)。表明μN(yùn)S蛋白參與形成病毒包涵體。見圖1。

圖1 免疫熒光法檢測(cè)μN(yùn)S和σNS蛋白在BHK細(xì)胞中的表達(dá)和分布（×400）Fig.1Expressions and distribution ofμN(yùn)S andσNS proteins in BHK cells detectef by immunofluorescence method(×400）

2.2 μN(yùn)S和σNS在BHK細(xì)胞中的共定位為了確定μN(yùn)S和σNS是否在病毒包涵體中共定位，分別用兔和小鼠制備的μN(yùn)S和σNS多克隆抗體免疫染色，同時(shí)使用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，檢測(cè)NBV-MB病毒感染24 h后BHK細(xì)胞中μN(yùn)S和σNS的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示：2種蛋白均以類似的點(diǎn)樣模式共定位于細(xì)胞質(zhì)中，尤其是在病毒包涵體中（圖2）。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：μN(yùn)S和σNS蛋白在感染的BHK細(xì)胞中均有表達(dá)，而未感染的BHK細(xì)胞中μN(yùn)S和σNS表達(dá)陰性（圖3）。

圖2 NBV的μN(yùn)S和σNS蛋白在BHK細(xì)胞中的定位（×400）Fig.2Location ofμN(yùn)S andσNS proteins of NBV in BHK cells（×400）

圖3 Western blotting法檢測(cè)BHK細(xì)胞中μN(yùn)S和σNS蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3Electrophoregramof expressionsofμN(yùn)S protein andσNS protein in BHK cells

2.3 免疫沉淀法檢測(cè)結(jié)果將pCAG M 3和pEFHAσNS質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，48 h后收集BHK細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，并用Western blotting法檢測(cè)免疫沉淀結(jié)果。用HA標(biāo)簽蛋白抗體作為免疫沉淀抗體，抗μN(yùn)S特異性兔血清作為Western blotting檢測(cè)一抗。共同轉(zhuǎn)染p CAG M 3和pEFHAσNS質(zhì)粒組BHK細(xì)胞中檢測(cè)到有μN(yùn)S蛋白表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEFHAσNS組BHK細(xì)胞中則未檢測(cè)到μN(yùn)S蛋白表達(dá)（圖4），表明μN(yùn)S蛋白通過與σNS蛋白結(jié)合而被沉淀下來，μN(yùn)S和σNS之間存在相互作用。

圖4 免疫沉淀法檢測(cè)μN(yùn)S與σNS蛋白的相互作用Fig.4Interaction ofμN(yùn)S andσNS proteins detected by immunoprecipitation assay

2.4 σNS的N末端aa缺失質(zhì)粒的構(gòu)建本研究分別制備了σNS的N末端aa缺失的6種S3質(zhì)粒。圖5A為編碼截短的S3質(zhì)粒構(gòu)建的示意圖，用于確認(rèn)σNS與μN(yùn)S共定位的結(jié)合區(qū)。質(zhì)粒PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證了各個(gè)質(zhì)粒的正確性。采用抗HA的單克隆抗體通過Western blotting法檢測(cè)σNS的N末端aa缺失的各個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后μN(yùn)S蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染N末缺失的S3質(zhì)粒（△S3-10aa～△S360aa）后，細(xì)胞中μN(yùn)S蛋白表達(dá)水平依次降低（圖5B）。

圖5 N末端10～60個(gè)aa殘基截短后質(zhì)粒構(gòu)建示意圖（A）和μN(yùn)S蛋白表達(dá)電泳圖(B)Fig.5Schematicdiagramof plasmidconstruction after truncation of 10－60 aa residues at N-terminal(A)and electrophoregram of expression ofμN(yùn)S protein(B)

2.5 σNS與μN(yùn)S共定位的結(jié)合區(qū)域NBV的μN(yùn)S在病毒感染過程中形成包涵體，μN(yùn)S和σNS通過相互作用在感染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒包涵體中共定位。通過pCAG M 3分別與截短了10～60個(gè)aa的pEFHAσNS△N10…△N60質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。24 h后進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)，分別用抗μN(yùn)S和σNS多克隆血清抗體對(duì)μN(yùn)S和σNS進(jìn)行免疫染色，然后再分別用抗兔Alexa 488偶聯(lián)抗體和小鼠Alexa 594偶聯(lián)抗體進(jìn)行免疫染色，共聚焦顯微鏡下觀察μN(yùn)S和σNS的表達(dá)。當(dāng)p CAG M 3與ΔS3-10、20、30、40和50 aa缺失的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時(shí)，μN(yùn)S和σNS蛋白清晰地共定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖6）。ΔS3-60aa缺失的p EFHAσNS△N60質(zhì)粒和pCAG M 3共同轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中均有σNS表達(dá)，并未與μN(yùn)S共同定位于包涵體中（圖6F），表明與μN(yùn)S相互作用需要σNS的N末端的10～60個(gè)aa殘基。

2.6 μN(yùn)S和σNS蛋白酵母雙雜交檢測(cè)結(jié)果μN(yùn)S與σNS或與缺失N末端10～60 aa的σNS共表達(dá)時(shí)，酵母菌可以在選擇性培養(yǎng)基上生長。僅當(dāng)μN(yùn)S與σNS蛋白或與缺失N末端10～50 aa的σNS共同表達(dá)時(shí)，誘餌蛋白和獵物蛋白載體以成對(duì)組合的方式轉(zhuǎn)化到營養(yǎng)缺陷型酵母（AH 109）中。在－Ade/－His/Leu－Trp缺陷型培養(yǎng)基上，μN(yùn)S的單獨(dú)轉(zhuǎn)化或與缺失N末端60 aa的σNS共轉(zhuǎn)化不能觸發(fā)酵母菌報(bào)告基因的激活，酵母菌不能生長。見圖7。

3 討論

病毒的復(fù)制和組裝是在一個(gè)被稱為VF的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行的，在病毒感染期間ARV和MRV的μN(yùn)S可能形成包涵體。眾所周知，雖然呼腸孤病毒科的所有成員都編碼NS，但其在感染細(xì)胞中的確切功能尚不清楚。而μN(yùn)S蛋白可能在病毒生命周期的不同階段都起著非常重要的作用。MRV的μN(yùn)S是支架蛋白，可以與其他核心蛋白形成VF；σNS蛋白有助于構(gòu)建核心粒子以及隨后的粒子組裝［12］。本研究證明：單獨(dú)的NBVμN(yùn)S可以在單獨(dú)的μN(yùn)S轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中以及在NBV感染的細(xì)胞中形成包涵體。在NBV感染的細(xì)胞以及被μN(yùn)S和σNS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，NBV的σNS與μN(yùn)S在包涵體內(nèi)共表達(dá)。盡管在感染過程中σNS與VF中的μN(yùn)S共定位，但當(dāng)單獨(dú)表達(dá)時(shí)，其分散在整個(gè)細(xì)胞中；當(dāng)σNS與μN(yùn)S共表達(dá)時(shí)，σNS重新分布并與μN(yùn)S形成包涵體而共定位。在穩(wěn)定和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，σNS會(huì)散布在在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。因此，σNS對(duì)于功能性病毒包涵體的形成是必需的，但如果無μN(yùn)S蛋白則無法形成包涵體。在無其他病毒蛋白表達(dá)的情況下，μN(yùn)S與σNS締合，表明該締合可能促使σNS在感染細(xì)胞時(shí)定位于VF。

μN(yùn)S是一個(gè)主要由M 3基因組片段編碼的相對(duì)分子質(zhì)量為69 000的呼腸孤病毒NS。研究［13］表明：MRV的μN(yùn)S與VF的形成有關(guān)。μN(yùn)S可以在體外與核心顆粒結(jié)合，形成大的復(fù)合物，在病毒轉(zhuǎn)錄及RNAs正鏈加帽時(shí)發(fā)揮作用［14］。μN(yùn)S對(duì)VF的形成非常重要，而VF對(duì)病毒復(fù)制起至關(guān)重要的作用。研究［15-16］表明：通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）可以降低μN(yùn)S的表達(dá)進(jìn)而阻礙病毒復(fù)制，并且通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒能夠恢復(fù)μN(yùn)S表達(dá)而挽救被RNAi抑制的病毒的復(fù)制。上述研究表明：VF的形成對(duì)于MRV復(fù)制至關(guān)重要。

另一個(gè)呼腸孤病毒的主要非結(jié)構(gòu)蛋白σNS是由S3基因組片段編碼的蛋白，包含363個(gè)aa殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為41 000。呼腸孤病毒σNS充當(dāng)RNA穩(wěn)定因子，可促進(jìn)病毒基因組復(fù)制［17］，在MRV研究［18］中，已經(jīng)從與病毒單鏈RNA（single strand，ssRNA）形成復(fù)合體的受感染細(xì)胞中分離出了σNS和μN(yùn)S以及結(jié)構(gòu)蛋白σ3，表明上述蛋白參與制備負(fù)鏈合成的病毒轉(zhuǎn)錄本并包裝至子代病毒中。σNS在整個(gè)病毒感染過程中均位于VF內(nèi)，因此最近有研究者［18］提出σNS使VF成核。ARV的σNS不僅以高親和力與ssRNA結(jié)合，而且還與部分雙鏈RNA結(jié)合［19］。

圖6 免疫熒光法檢測(cè)μN(yùn)S和σNS蛋白共定位的結(jié)合區(qū)域（×400）Fig.6 Binding region of co-location ofμN(yùn)S andσNS proteins detected by immunofluorescence method(×400)

圖7 －Ade/－His/－Leu/－Trp缺陷型培養(yǎng)基檢測(cè)μN(yùn)S與σNS蛋白相互作用Fig.7 Interaction betweenμN(yùn)S andσNS proteins detected by －Ade/－His/－Leu/－Trp-deficient medium

最近的研究［20］表明：末端缺少38個(gè)aa的UsingσNS突變體是RNA結(jié)合所必需的。研究［20-22］表明：σNS是一種RNA分子伴侶，σNS作為RNA結(jié)合蛋白可增加病毒RNA半衰期，與ssRNA一起可形成絲狀結(jié)構(gòu)，并且σNS可以以不依賴ATP的方式非特異性結(jié)合核酸，類似于輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2。在功能上與哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒σNS同源的禽呼腸孤病毒σNS蛋白可以在體外充當(dāng)RNA伴侶［22］。因此，呼腸孤病毒科病毒將蛋白質(zhì)編碼為RNA伴侶，以修飾RNA構(gòu)象并促進(jìn)病毒復(fù)制［23］。上述情況與MRV和ARV的μN(yùn)S和σNS蛋白相同，本研究結(jié)果顯示：μN(yùn)S和σNS蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)時(shí)，μN(yùn)S具有形成內(nèi)含物的能力而σNS則不具有該能力，表明μN(yùn)S也是NBV感染過程中包涵體成核的關(guān)鍵因素，并且該蛋白是包涵體形成所需的最小病毒成分。因此，在NBV復(fù)制的早期階段，μN(yùn)S通過形成病毒復(fù)制位點(diǎn)以及募集病毒復(fù)制和組裝所必需的成分而起重要作用。當(dāng)NBV的σNS單獨(dú)表達(dá)時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中呈分散分布，但在與μN(yùn)S基因共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和NBV感染的細(xì)胞中可與μN(yùn)S相互作用，繼而形成包涵體。σNS通過與μN(yùn)S的相互作用而聚集至包涵體中。本研究結(jié)果也證實(shí)：在被μN(yùn)S和σNS轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及NBV感染的細(xì)胞中μN(yùn)S和σNS存在相互作用并共定位。

對(duì)MRV的研究［24］證實(shí)：σNS的aa殘基1～11對(duì)于與μN(yùn)S的相互作用非常重要，而μN(yùn)S的aa殘基1～40對(duì)于與σNS的相互作用至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示：σNS的N末端的10～60個(gè)aa殘基對(duì)于μN(yùn)S很重要。當(dāng)刪除σNS N末端的60個(gè)aa殘基時(shí)，不能觀察到μN(yùn)S和σNS的共定位。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：當(dāng)去除σNS的N末端60個(gè)aa殘基時(shí)，μN(yùn)S與σNS之間的相互作用也被消除，σNS也可能有助于病毒復(fù)制。本研究結(jié)果證實(shí)：NBV的μN(yùn)S蛋白不僅與病毒感染細(xì)胞后增強(qiáng)細(xì)胞自噬有關(guān)，也可以在μN(yùn)S的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和NBV病毒感染的細(xì)胞中形成包涵體；σNS蛋白可以與μN(yùn)S蛋白相互作用，σNS N末端區(qū)域的60個(gè)aa殘基對(duì)于其相互作用至關(guān)重要。σNS的10～60個(gè)aa缺失可能會(huì)影響RNA與該蛋白的結(jié)合。目前尚不清楚NBV的σNS是否具有與MRV和ARV的σNS相同的RNA分子伴侶功能，NBV的σNS作為分子伴侶的功能有待進(jìn)一步研究。