氯喹通過影響胰腺癌細(xì)胞自噬和線粒體功能對(duì)吉西他濱耐藥細(xì)胞的作用及其機(jī)制

陸 路,黎東明,王學(xué)國(guó),宋 丹,王太成,趙紅巖,吳曉勇

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，海南 ?？?70100）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是臨床上常見的惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤之一，但由于PC早期無明顯臨床癥狀，且臨床缺乏有效藥物等多種因素，導(dǎo)致其具有較高的致死率和較低的術(shù)后5年生存率［1-2］。吉西他濱（gemcitabine，GEM）是臨床上PC患者化療標(biāo)準(zhǔn)一線治療藥物，但近年來PC對(duì)GEM的耐藥性不斷增加，而臨床聯(lián)合使用其他藥物能有效增加PC細(xì)胞對(duì)GEM的化療敏感性，提高患者的總生存率［3］。研究［4］顯示：GEM在治療過程中會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬，而自噬作為一種廣泛存在于細(xì)胞中的保護(hù)性機(jī)制，能夠通過參與調(diào)控細(xì)胞的能量和物質(zhì)代謝，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的化療抵抗。

氯喹（chloroquine，CQ）是一種經(jīng)典的自噬抑制劑，其主要通過阻滯溶酶體與自噬體的結(jié)合從而發(fā)揮抑制自噬的作用［5］。近年來研究［6-9］顯示：將CQ與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)惡性腫瘤的治療效果較好。既往對(duì)PC的研究［9］顯示：GEM聯(lián)合CQ能明顯改善腫瘤細(xì)胞對(duì)GEM的敏感性，但對(duì)于已發(fā)生GEM耐藥的PC細(xì)胞，CQ是否還能發(fā)揮作用及其相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究建立GEM耐藥PC細(xì)胞株，觀察CQ對(duì)GEM耐藥PC細(xì)胞株的作用和影響，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑人PC PANC1細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM/HG和0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司），CQ（美國(guó)Sigma公司），GEM（上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司），胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（均為100 U·mL－1）（杭州四季青生物公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Pierce公司），CCK-8試劑盒（北京索萊寶生物公司），JC-1線粒體膜電位試劑盒（美國(guó)Biovision公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢側(cè)試劑盒（DCFH-DA）（南京凱基生物公司），AnnexinⅤ-FITC試劑盒（江蘇碧云天生物公司），大鼠抗B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）和GAPDH單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），大鼠抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）多克隆抗體和兔抗P62單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（廣州晶彩生物科技有限公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和GEM耐藥PANC1細(xì)胞株的建立及分組常規(guī)復(fù)蘇PANC1細(xì)胞后采用含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至90%時(shí)用含有EDTA的0.25%胰酶進(jìn)行消化后傳代。根據(jù)文獻(xiàn)［10］方法采用低濃度依次遞增法建立GEM耐藥PANC1細(xì)胞株。GEM的起始濃度為1μmol·L－1，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代1周后，依次將 藥 物 濃 度 遞 增（2、4、8、16、32、64、100、200和400μmol·L－1），連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5個(gè)月后，確定PANC1最終能夠存活及穩(wěn)定傳代的最高GEM濃度。將建立的GEM耐藥PANC1細(xì)胞記為PANC1/GEM，正常PANC1細(xì)胞記為親代細(xì)胞。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⑸鲜黾?xì)胞分為4組：GEM耐藥（PANC1/GEM）組，使用含100μmol·L－1GEM的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的PANC1/GEM細(xì)胞；CQ組，使用20μmol·L－1CQ和100μmol·L－1GEM進(jìn)行處理的PANC1細(xì)胞；PANC1/GEM+CQ組，使用20μmol·L－1CQ和100μmol·L－1GEM進(jìn)行處理的PANC1/GEM細(xì)胞；對(duì)照組，使用100μmol·L－1GEM進(jìn)行處理的PANC1細(xì)胞。若無特殊說明，上述各組細(xì)胞均于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)GEM對(duì)PANC1細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC 50）取上述各組細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)消化細(xì)胞后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/孔，并向每孔中加入100μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞貼壁后，去除原培養(yǎng)液，再向每孔加入100μL含不同濃度GEM的RPMI-1640培養(yǎng)液（其中PANC1細(xì)胞中加入含0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和10.0μmol·L－1GEM的培養(yǎng)液，PANC1/GEM細(xì)胞中加入含10、50、100、200和400μmol·L－1GEM的培養(yǎng)液），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后向每孔加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)每孔吸光度（A）值。每個(gè)濃度組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并以未使用GEM處理的PANC1細(xì)胞為空白對(duì)照組。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（空白對(duì)照組A值－各濃度組A值）/空白對(duì)照組A值×100%，計(jì)算并分析各組細(xì)胞的IC50值（細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到細(xì)胞正常生長(zhǎng)水平50%時(shí)的藥物濃度）。

1.4 透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察細(xì)胞中自噬小體數(shù)量取上述各組細(xì)胞，2.5%戊二醛室溫下固定12 h后，于1%鋨酸中再次進(jìn)行固定2 h，梯度酒精脫水，加入70%醋酸鈾于室溫下染色6 h，環(huán)氧樹脂包埋，采用超微切片機(jī)進(jìn)行切片，3%櫞酸鉛-醋酸鈾雙染后，于TEM下觀察各組細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量。

1.5 JC-1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位取上述各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL－1，取1 mL細(xì)胞懸液于EP管中并加入0.5 mL JC-1染色工作液，37℃孵育20 min，4℃、12 000 r·min－1離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，重懸于1 mL的JC-1染色緩沖液中，300目濾膜過濾細(xì)胞團(tuán)塊后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平取上述各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL－1，加入1 mL終濃度為10μmol·L－1的DCFH-DA溶液，37℃避光孵育30 min，PBS緩沖液充分洗滌細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取上述各組細(xì)胞，1 250 r·min－1離心5 min，棄上清，4℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，再次離心后，收集細(xì)胞沉淀，用195μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL－1，依次加入5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育30 min。300目濾膜過濾細(xì)胞團(tuán)塊后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平取上述各組細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次后，加入RIPA細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞中總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量，按照1∶4比例向上清液中加入5×上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后，分別加入LC3B（1∶500）、P62（1∶500）、Bcl-2（1∶300）、Bax（1∶300）、Cleaved caspase-3（1∶300）和GAPDH（1∶1 000）一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，每次5 min，以HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，以TBST溶液清洗3次，每次5 min。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。采用Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組PC細(xì)胞GEM的IC50值，自噬小體數(shù)量，細(xì)胞線粒體膜電位，ROS水平，細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞中胞漿型LC3/膜型LC3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）蛋白 表達(dá)水平比值，P62、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平，均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞GEM的IC 50值經(jīng)終濃度為1、2、4、8、16、32、64、100、200和400μmol·L－1的GEM培養(yǎng)液處理，PANC1細(xì)胞能夠在含100μmol·L－1GEM的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)及傳代，提示成功建立了PANC1/GEM細(xì)胞株。GEM處理PANC1細(xì)胞36 h后，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組、PANC1/GEM組、CQ組和PANC1/GEM+CQ組GEM的IC50值 分 別 為（6.23±0.41）、（171.18±10.09）和（2.76±0.12）和（81.33±9.71）μmol·L－1，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。CQ組和PANC1/GEM+CQ組GEM的IC50值分別低于對(duì)照組和PANC1/GEM組（P＜0.01）。

2.2 各組細(xì)胞的自噬水平TEM觀察結(jié)果顯示：與對(duì)照組（0.09±0.03）比較，PANC1/GEM組（0.41±0.07）、CQ組（0.15±0.02）和PANC1/GEM+CQ組（0.28±0.04）細(xì)胞中自噬小體數(shù)量均明顯增加（P＜0.05）；與PANC1/GEM組比較，PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中自噬小體數(shù)量明顯降低（P＜0.05），見圖1。Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，PANC1/GEM組、CQ組和PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比 值 均 明 顯 升 高（P＜0.05），PANC1/GEM組和PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），CQ組細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與PANC1/GEM組比較，PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低（P＜0.05），P62蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖1 TEM觀察各組胰腺癌細(xì)胞中的自噬小體（Bar=0.5μm）Fig.1Autophagy bodies in pancreatic cancer cells in various groups observed by TEM(Bar=0.5μm)

圖2 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B，C）Fig.2Electrophoregram(A)and histogram(B,C)of expressions of LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ,and P62 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.3 各組細(xì)胞線粒體膜電位與對(duì)照組（26.7%±4.1%） 比 較，PANC1/GE組和PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞線粒體膜電位（10.7%±2.4%和18.1%±3.6%）均明顯降低（P＜0.05），CQ組細(xì)胞線粒體膜電位（35.6%±5.0%）明顯升高（P＜0.05）；與PANC1/GEM組比較，PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞線粒體膜電位明顯升高（P＜0.05）。見圖3。

2.4 各組細(xì)胞中ROS水平與對(duì)照組（37.3%±5.4%）比較，PANC1/GEM組和PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中ROS水平（14.2%±3.7%和21.8%±4.0%）明顯降低（P＜0.05），CQ組細(xì)胞中ROS水平（46.1%±7.3%）明顯升高（P＜0.05）；與PANC1/GEM組比較，PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中ROS水平明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS水平Fig.4ROS levels in cells in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組（30.5%±6.7%）比較，PANC1/GEM組和PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞凋亡率（9.7%±3.2%和16.1%±4.1%）明顯降低（P＜0.05），CQ組細(xì)胞凋亡率（48.6%±7.5%） 明 顯 升 高 （P＜0.05）；與PANC1/GEM組比較，PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.5Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.6 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，PANC1/GEM組和PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），CQ組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與PANC1/GEM組比較，PANC1/GEM+CQ組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of apoptosis-related proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

由于PC早期發(fā)病隱匿，腫瘤進(jìn)展較快且缺乏特異的臨床癥狀等，致使超過75%的PC患者在首次就診時(shí)已發(fā)生腫瘤的局部侵犯或轉(zhuǎn)移。此外，即使部分患者能夠早期診斷并治療，仍有約90%的患者將于術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)［2］。化療在PC的臨床治療上占有極為重要地位。GEM是PC治療的一線化療藥物，作為一種人工合成的胞嘧啶衍生物，主要通過殺傷處于有絲分裂的DNA合成期細(xì)胞而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其發(fā)生凋亡［3］。近年來，在臨床中發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)對(duì)GEM的耐藥性現(xiàn)象，其中自噬的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用。抑制自噬被證明能夠明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)GEM的敏感性，阻止腫瘤的進(jìn)展［6-9］。在膀胱癌中，CQ能夠抑制GEM通過蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，從而改善腫瘤細(xì)胞的化療抗性［8］。在三陰性乳腺癌中，GEM通過誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生自噬，繼而改變P53蛋白和Bcl-2蛋白家族的表達(dá)以下調(diào)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性，而CQ能夠抑制自噬逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)改變現(xiàn)象，促進(jìn)GEM產(chǎn)生的細(xì)胞損傷，增加MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率［11］。有研究［9］證實(shí)：暴露于GEM中的PC細(xì)胞自噬能力明顯增強(qiáng)，且呈劑量依賴性，而聯(lián)合使用CQ能夠明顯增加GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，但對(duì)于已發(fā)生GEM耐藥的PC細(xì)胞作用尚無相關(guān)研究報(bào)道。

在本研究中，通過低濃度依次遞增法建立GEM耐藥PANC1細(xì)胞株，通過檢測(cè)細(xì)胞IC50值進(jìn)行驗(yàn)證。通過TEM觀察細(xì)胞中自噬小體數(shù)量及Western blotting法檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3和P62的表達(dá)水平證實(shí)：GEM能夠促進(jìn)PC細(xì)胞產(chǎn)生自噬，且GEM耐藥細(xì)胞的自噬水平明顯增強(qiáng)，而CQ不僅能夠降低親代PC細(xì)胞的自噬水平，同樣能夠降低GEM耐藥細(xì)胞的自噬程度。本研究進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位、ROS水平和細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明：CQ能夠同時(shí)通過改變親代和GEM耐藥PC細(xì)胞的線粒體膜電位和ROS水平，促進(jìn)GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，即增強(qiáng)及改善上述細(xì)胞的GEM敏感性。本研究結(jié)果顯示：CQ可能通過下調(diào)親代和GEM耐藥PC細(xì)胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved caspase-3的表達(dá)。

線粒體作為細(xì)胞中廣泛存在的一種重要細(xì)胞器，不僅能夠?yàn)榧?xì)胞提供正常代謝所需的能量物質(zhì)，同時(shí)還參與影響細(xì)胞的眾多功能，如蛋白的合成、遺傳、免疫、氧化還原、自噬和耐藥性的產(chǎn)生等。而線粒體功能或結(jié)構(gòu)的損傷可導(dǎo)致細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生及凋亡相關(guān)因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至發(fā)生凋亡［12］。自噬能夠通過阻止受損的蛋白或細(xì)胞器（尤其是線粒體）的毒性累積，限制氧化應(yīng)激反應(yīng)及損傷的擴(kuò)大，誘導(dǎo)細(xì)胞在不利的環(huán)境中繼續(xù)生存并增殖。研究［13］證實(shí)：在腫瘤的放化療過程中均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬，而自噬水平的異常增加是腫瘤耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)重要機(jī)制。線粒體膜電位的降低是線粒體功能受損的早期事件，提示細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。而細(xì)胞中ROS水平的升高則表明線粒體的功能嚴(yán)重受損，且增加的ROS能夠放大細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)［14］。LC3-Ⅰ脂質(zhì)化形成膜結(jié)合的LC3-Ⅱ是自噬體形成的關(guān)鍵步驟，同時(shí)也被用來作為自噬發(fā)生的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，且LC3-Ⅱ水平與胞內(nèi)的自噬小體數(shù)量成正比。P62是細(xì)胞內(nèi)自噬過程中的特異性底物和調(diào)節(jié)蛋白，同時(shí)也被用來衡量自噬的完成情況［15-16］。研究［5］表明：自噬抑制劑CQ不僅能夠抑制溶酶體與自噬體的結(jié)合，還能通過改變?nèi)苊阁w內(nèi)的酸堿性，降低其水解功能。此外，CQ同樣還能通過“芬頓反應(yīng)”產(chǎn)生羥自由基，促進(jìn)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步損傷線粒體功能，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［17］。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡途徑中一類重要的蛋白，在多種惡性腫瘤中的表達(dá)異常增加。Bcl-2主要通過結(jié)合胞質(zhì)中的促凋亡蛋白Bax，抑制后者發(fā)生構(gòu)象改變及對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的損傷而發(fā)揮抗凋亡作用。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中各種凋亡途徑的樞紐，也是細(xì)胞凋亡的指示劑，其激活表示細(xì)胞已進(jìn)入不可逆的凋亡進(jìn)程［18-19］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：CQ不僅能夠促進(jìn)PC細(xì)胞對(duì)GEM的敏感性，還能改善GEM耐藥細(xì)胞株的化療抗性，其可能通過抑制PC細(xì)胞自噬和降低細(xì)胞線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，最終促進(jìn)GEM所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用CQ治療GEM耐藥PC的有效性，有望為臨床改善PC患者預(yù)后提供新的策略及方案。