嬰幼期大自然聲音組合干預對大鼠成年后焦慮樣行為的影響

王 倩,莊似玥,吳貴龍,李勝天

（1.上海交通大學Bio-X研究院,上海200240；2.復旦大學附屬上海市第五人民醫(yī)院麻醉科，上海200240）

焦慮癥是精神類疾病中重要的病種，其癥狀通常表現(xiàn)為全身不適、神經(jīng)性疼痛、歇斯底里、焦慮和憂郁等，全球患病率約為7.3%［1］，是僅次于抑郁癥的第二大心理疾?。?］。輕度焦慮癥影響日常生活和工作，嚴重焦慮患者甚至會出現(xiàn)驚恐、瀕死感和暈倒等癥狀。若焦慮癥長期得不到緩解，則40%～50%的患者可能會發(fā)展為抑郁癥。對于焦慮癥的治療主要有藥物治療［3］和非藥物性干預。音樂療法是一種主要的非藥物性干預，近年來研究［4-6］顯示：動聽的音樂能減少癌癥患者、燒傷患者、孕婦和術前患者的焦慮情緒。研究者［7］發(fā)現(xiàn)：除了音樂以外，包括鳥叫聲、小雨聲、溪流聲和海浪聲等大自然環(huán)境的聲音也能夠明顯緩解人們的焦慮情緒，并影響血壓和血氧飽和度等多種生理指標。但音樂干預的人類特殊性限制了其機制的研究，因此建立合適的實驗動物模型成為亟待解決的問題。本研究中通過對雄性SD大鼠進行出生前后為期30 d、每天2 h的大自然聲音組合的干預，建立嬰幼期自然界環(huán)境聲音干預緩解成年后焦慮樣情緒的大鼠模型，檢測其成年后的焦慮樣行為，并與同一時期采用莫扎特D大調(diào)雙鋼琴奏鳴曲K448干預的大鼠進行比較，為進一步研究焦慮癥的發(fā)病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Sprague-Dawley（SD）大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK 2017-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2018-0028，嚴格按照上海交通大學實驗動物中心飼養(yǎng)管理技術規(guī)范飼養(yǎng)?？紤]到大鼠是夜行動物，夜間處于其行為的活躍期，從購買之日起開始，SD大鼠在飼養(yǎng)房接受日夜顛倒的光照（光照時間為21：00－9：00），并且之后所有的行為學實驗均在其夜間活躍期進行。大鼠飼養(yǎng)及測試期間自由進食和飲水。飼養(yǎng)室及行為學實驗室室內(nèi)溫度為22℃～25℃，濕度為50%～60%。

1.2 主要儀器曠場箱由上海嘉巖實業(yè)有限公司制作，為50 cm×50 cm×50 cm的有機玻璃箱，箱底黑色，周壁白色。明暗穿梭箱由上海軟隆科技發(fā)展有限公司制作，由白色封閉箱（21 cm×25 cm×42 cm）和黑色封閉箱（21 cm×25 cm×42 cm）組成，中部有一穿梭孔。高架十字迷宮由上海軟隆科技發(fā)展有限公司制作，由2個相對的敞開臂（四周均敞開，50 cm×10 cm）、2個相對的閉臂（僅頂部敞開，50 cm×10 cm×40 cm）和一個連接4個臂的中間區(qū)域組成，迷宮距離地面70 cm高。攝像系統(tǒng)為JVC彩色攝像機（日本JVC建伍株式會社）。以上所有行為學實驗的測試、視頻錄制和視頻分析均應用ANY-maze動物行為學實驗分析軟件（美國Stoelting公司）。

1.3 模型的建立從孕鼠懷孕14～15 d開始，針對孕鼠給予不同聲音環(huán)境的干預。根據(jù)聲音環(huán)境的不同，孕大鼠分為正常噪聲環(huán)境對照組（normal noise，NN）、莫扎特D大調(diào)雙鋼琴奏鳴曲K448組（Mozart K 448，MK）和大自然聲音組合組（natural sound，NS）。NN組大鼠不給予任何特殊的聲音刺激，僅放置于正常的飼養(yǎng)環(huán)境下，環(huán)境噪聲為45 d B左右；MK組大鼠每天給予莫扎特D大調(diào)雙鋼琴奏鳴曲K448聲音刺激2 h，音量為50～70 dB；NS組大鼠每天給予大自然聲音組合（包括風聲、雨聲、鳥鳴聲和海浪聲4種自然界的聲音）刺激2 h，音量為65～75 dB。以上干預持續(xù)30 d。干預結(jié)束5周后（即出生后9周）開始進行行為學測試，選取體質(zhì)量較為接近（312～463 g）的NN組11只、MK組8只和NS組11只雄性子代大鼠依次進行曠場實驗、明暗箱實驗和高架十字迷宮實驗。

1.4 曠場實驗實驗前將待測小鼠安置于實驗房間中1 h，以充分適應空間環(huán)境。測試時隨機沿著曠場箱壁放入大鼠，自由探索10 min，記錄并分析其總運動路程、站立次數(shù)、進入中央?yún)^(qū)域次數(shù)和進入中央?yún)^(qū)域的時間。

1.5 明暗箱實驗測試時將大鼠置于明箱中并面向穿梭孔，自由探索10 min，記錄其在明箱停留時間百分率、在明暗箱間的穿梭次數(shù)和總運動路程。

1.6 高架十字迷宮實驗測試時將大鼠從中央?yún)^(qū)域面朝開臂放入，使其在高架十字迷宮中自由探索5 min，記錄其在開臂的時間百分率、進入開臂的次數(shù)和在開臂的運動路程。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。曠場實驗、明暗箱實驗和高架十字迷宮實驗檢測指標均符合正態(tài)分布以及方差齊性，均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠曠場實驗檢測指標與NN組和MK組比較，NS組大鼠總運動路程、站立次數(shù)、進入中央?yún)^(qū)域次數(shù)和進入中央?yún)^(qū)域的時間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1和表1。

圖1 曠場實驗中各組大鼠總運動路程示意圖Fig.1Typical locus diagram of total distance in open field experiment of rats in various groups

表1 各組大鼠曠場實驗檢測指標Tab.1Indications of open field experiment of rats in various groups±s）

表1 各組大鼠曠場實驗檢測指標Tab.1Indications of open field experiment of rats in various groups±s）

Group NN MK NS n 11 8 11 Total distance(l/m)13.52±0.90 12.11±0.93 11.50±1.40 Number of rearing 39.27±3.88 34.38±3.49 32.63±4.98 Number of entering central area 14.18±2.61 16.63±3.72 8.82±2.12 Time of entering central area(t/s)24.34±4.12 25.41±5.60 15.75±4.70

2.2 各組大鼠明暗箱實驗檢測指標與NN組比較，NS組大鼠在明箱停留時間百分率明顯升高（P＜0.05）；與NN組和MK組比較，NS組大鼠在明暗箱之間的穿梭次數(shù)和總運動路程明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2和表2。

圖2 明暗箱實驗中各組大鼠行為示意圖Fig.2Typical locus diagram of behaviors in light-dark transition test of rats in various groups

表2 各組大鼠明暗箱實驗檢測指標Tab.2Indications of light-dark transition test of rats in various groups±s）

表2 各組大鼠明暗箱實驗檢測指標Tab.2Indications of light-dark transition test of rats in various groups±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with NN group；△P＜0.05 compared with MK group.

Group NN MK NS n 11 8 11 Percentage of time in light box(η/%)32.28±3.46 34.38±1.91 41.38±2.53*Number of transition 15.73±1.41 17.88±1.73 26.27±2.17**△Total distance(l/m)7.35±1.29 6.43±0.33 9.16±0.99*△

2.3 各組大鼠高架十字迷宮實驗檢測指標與NN組比較，NS組大鼠在開臂的時間百分率明顯升高（P＜0.05）；與NN組和MK組比較，NS組大鼠進入開臂的次數(shù)和在開臂的總運動路程差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3和表3。

圖3 高架十字迷宮實驗中各組大鼠行為示意圖Fig.3Typical locus diagram of of behaviors in elevated plus-maze test of rats in various groups

表3 各組大鼠高架十字迷宮實驗檢測指標Tab.3Indicators of elevated plus maze test of rats in various groups±s）

表3 各組大鼠高架十字迷宮實驗檢測指標Tab.3Indicators of elevated plus maze test of rats in various groups±s）

*P＜0.05 compared with NN group.

Group NN MK NS n 11 8 11 Percentage of time in open arms(η/%)11.99±3.94 23.52±6.85 25.06±2.45*Number of open arms entries 4.73±1.07 6.28±1.33 4.82±0.46 Distance of open arms(l/m)0.83±0.25 1.28±0.39 1.24±0.17

3 討 論

焦慮癥是一種全球范圍內(nèi)十分常見的心理疾病，2019年，中國精神衛(wèi)生組織［8］對31個省級行政區(qū)的調(diào)查顯示：我國焦慮癥的終身發(fā)病率為7.6%，成為僅次于抑郁癥的第二大心理疾?。?］。而焦慮癥的藥物治療長期有效性不高，而且治療時間常常需持續(xù)12個月以上［10］。此外，現(xiàn)有的一線和二線藥物存在包括惡心、腹瀉、頭痛和性功能障礙等不良反應。因此開發(fā)新的焦慮癥治療方法具有廣泛的社會意義。

音樂療法是一種利用音樂元素（包括節(jié)奏、曲調(diào)或者聲響）對患者進行干預的方式。諸多研究［11-19］顯示：音樂治療能夠明顯緩解抑郁癥狀、緊張和焦慮情緒。研究者［10］通過對421例參與者進行分析發(fā)現(xiàn)：音樂療法可為抑郁癥患者帶來短期的有益影響，與單獨使用常規(guī)療法比較，加入音樂療法可以改善患者抑郁癥狀，且無不良事件發(fā)生。研究［20］顯示：針對平日里有聽音樂習慣的大學生，測試聆聽其喜愛的音樂對腦電功率的影響以及其與焦慮緩解之間的關系，發(fā)現(xiàn)左額葉β節(jié)律的增強與音樂舒緩焦慮情緒有關，為今后進一步闡明音樂緩解焦慮的機制提供了線索。盡管音樂療法顯示出緩解焦慮水平和改善抑郁的功效，但其機制尚未明確［4，10，18］。

構(gòu)建有效的實驗動物模型可促進探討音樂影響焦慮情緒的機制。動物行為學實驗中，常用曠場實驗測試實驗動物在新異環(huán)境中的自主行為和探索行為，且大鼠在曠場中的總運動路程及進入中央?yún)^(qū)域的時間分別可以作為抑郁樣行為和焦慮樣行為的判斷指標之一［7，21］。此外，嚙齒類動物對新環(huán)境具有好奇心，但對高懸的開臂環(huán)境具有恐怖心理，因此高架十字迷宮測試大鼠是評估試驗動物焦慮樣行為的主要方法之一。明暗箱測試系統(tǒng)根據(jù)嚙齒類動物喜暗厭光的特性檢測其焦慮樣行為［22］。有研究［23］顯示：莫扎特D大調(diào)雙鋼琴奏鳴曲K448可減緩大鼠的焦慮情緒。研究［22］顯示：如果將剛出生的SD大鼠置于有貓但兩者無實際軀體接觸的環(huán)境中，會引起SD大鼠的焦慮樣行為，且對其成熟后的焦慮和抑郁樣行為產(chǎn)生影響，提示實驗動物雖然從出生開始就處于實驗動物中心飼養(yǎng)環(huán)境中，富于水和食物的供應，而且遠離天敵的威脅，但是自然環(huán)境仍然可以明顯影響其焦慮情緒。本研究結(jié)果顯示：NS干預使大鼠成年后在明暗箱測試中明箱停留時間百分率、穿梭次數(shù)和總運動路程增加，且高架十字迷宮測試中在開臂的時間百分率明顯升高，說明其焦慮樣行為減少，而MK干預無上述作用。

嬰幼期持續(xù)的大自然聲音干預減少其成年后的焦慮樣行為，可能是通過對大腦發(fā)育或者基因的表觀修飾等產(chǎn)生了影響。此外，音樂可以抑制腎上腺素和去甲腎上腺素的分泌，誘導外周生成和釋放一氧化氮［24］；而音樂的心理效應可能是通過尾狀核的多巴胺釋放增加發(fā)揮功能［25］。因此，進一步研究大腦發(fā)育、基因的表觀修飾等可能揭示自然環(huán)境的聲音緩解焦慮的機制。本研究成功建立了自然界聲音環(huán)境緩解大鼠焦慮的模型，有助于進一步研究包括音樂的聲音影響焦慮情緒的機制。