天冬酰胺合成酶對移植黑色素瘤APP/PS1小鼠骨骼肌減少的影響

董 營,呂 航,郭家女,鄭 鴻,郭 丹,王力可,王 丹,陳昌捷,孫連坤,張 勇,于春艷

（1.北華大學基礎醫(yī)學院病理教研室，吉林 吉林132013；2.北華大學附屬醫(yī)院檢驗科，吉林 吉林132013；3.吉林大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，吉林 長春130021）

隨著慢性和增齡疾病的進展，患者常表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量、力量和運動功能的進行性下降，最終發(fā)展為肌肉減少癥，伴隨肌肉功能喪失，往往是行動不便，生活質(zhì)量的降低，以及各種疾病的死亡率增加。肌肉減少癥是阿爾茨海默病和惡性腫瘤等慢性疾病的主要并發(fā)癥之一［1-2］，而且隨著腫瘤的不斷增殖，肌肉質(zhì)量和肌力的變化可能早于典型惡病質(zhì)癥狀的出現(xiàn)，肌肉減少癥被認為是影響晚期腫瘤患者生存期的獨立預后指標之一。研究［3-4］提示：阿爾茨海默病與惡性腫瘤發(fā)病風險的降低有關(guān)，研究肌肉減少癥是否發(fā)生對于理解二者之間的關(guān)系可能具有重要意義，可為疾病的預后評價和防治提供理論依據(jù)。

阿爾茨海默病和腫瘤細胞在發(fā)生發(fā)展過程中不可避免地遭受應激。細胞針對饑餓等應激進化出氨基酸反應等多種適應性機制［5］。天冬酰胺合成酶（asparaginesynthetase，ASNS）是氨基酸反應之一，以ATP依賴的氨基轉(zhuǎn)移酶反應方式催化天冬氨酸與谷氨酰胺合成天冬酰胺和谷氨酸［6］，被未折疊蛋白反應所激活［7］，并參與腫瘤生物學過程［8］。骨骼肌是最大的蛋白質(zhì)儲存庫，氨基酸穩(wěn)態(tài)被嚴格調(diào)控，而且骨骼肌擁有豐富的肌漿網(wǎng)。ASNS在同時患有阿爾茨海默病和惡性腫瘤的動物骨骼肌組織中是否被影響，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應是否參與ASNS活性調(diào)節(jié)尚未見報道。

本研究利用C57BL/6J小鼠和淀粉樣蛋白前體蛋白/早老素1（amyloid precursor protein/presenilin 1，APP/PS1）小鼠移植黑色素瘤細胞后，觀察小鼠肌肉組織中ASNS mRNA和蛋白表達水平的變化，并檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的表達，旨在探討ASNS對移植黑色素瘤APP/PS1小鼠骨骼肌減少的影響及其調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器健康C57BL/6J（C57）小鼠14只及APP/PS1小鼠14只，體質(zhì)量約為16～20 g，均為雄性，購自北京華阜康股份有限公司，SPF級，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004。ASNS、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、真核細胞起始因子2α（eukaryotic cell translation initiation factor 2α，eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）和GAPDH單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。ASNS、小鼠肌肉組織特異萎縮相關(guān)基因E3泛素連接酶1（E3 ubiquitin ligases-1，Atrogin-1）、肌肉環(huán)指蛋白1（muscle ring finger protein 1，MuRF1）和GAPDH引物由上海生工生物有限公司合成，TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），PureLink RNA mini試劑盒（美國Ambion公司）。CFX 96實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitiative PCR，RTqPCR）儀、蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、蛋白濃度分析儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 小鼠黑色素瘤模型的建立和動物分組小鼠分為C57對照組、C57移植瘤組、APP/PS1對照組和APP/PS1移植瘤組，每組7只，飼養(yǎng)于通風、安靜環(huán)境中，定時喂食，飲水不限。黑色素瘤B16細胞來自吉林大學病理學與病理生理學系。培養(yǎng)B16細胞，當細胞生長處于對數(shù)期時收集細胞，采用不含EDTA的0.25%胰酶消化。無菌PBS緩沖液清洗2次，再用PBS緩沖液重懸，細胞密度為1×107mL－1，用無菌注射器將100μL細胞懸液接種到C57移植瘤組和APP/PS移植瘤組小鼠背部右側(cè)皮下［1］。小鼠飼養(yǎng)在22℃～24℃恒溫環(huán)境、濕度為40%～60%的動物房中，每天觀察小鼠的狀態(tài)及腫瘤生長狀況。

1.3 小鼠肌肉減少癥指數(shù)（siarcopenia index，SI）計算用10%水合氯醛麻醉小鼠，分離腓腸肌并用手術(shù)刀剔除肌腱等結(jié)締組織，取出腓腸肌后浸入生理鹽水以清洗去掉附著的血液，并且稱量前用濾紙吸除多余的生理鹽水和組織液，稱量骨骼肌質(zhì)量，記錄數(shù)值并保留小數(shù)點后2位，計算小鼠腓腸肌質(zhì)量（mg）與體質(zhì)量（g）的比值，即SI。

1.4 HE染色觀察小鼠腓腸肌形態(tài)表現(xiàn)用10%水合氯醛麻醉小鼠，剪開胸廓，心臟暴露，將灌注針頭經(jīng)左心室刺入至主動脈，并用止血鉗固定，剪開右心房，先用生理鹽水快速灌注沖洗直至肝臟變白，然后用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）對其進行灌注固定，取出兩側(cè)完整的腓腸肌，并放置在4%多聚甲醛中固定24 h。用常規(guī)方法經(jīng)過脫水、透明、包埋和切片制作石蠟切片，接著進行HE染色，封片，Olympus顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

1.5 RT-qPCR法檢測小鼠腓腸肌組織中ASNS、Atrogin-1和MuRF1 mRNA水平取每個凍存的小鼠腓腸肌組織30 mg，加入液氮充分研磨，應用TRIzol試劑提取總RNA，用PureLink RNA mini試劑盒純化。純化后經(jīng)Nanodrop分光光度計NP-1000測定260 nm和280 nm波長處的吸光度（A）值，并計算樣本總RNA濃度及評估純度。應用預混型逆轉(zhuǎn)錄試劑（中國TRANS公司），以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。每個樣本取5 ng cDNA，應用RT-qPCR試劑盒進行PCR擴增，采用CFX96 RT-qPCR儀進行檢測，引物序列見表1。反應條件：50℃、2 min，95℃、2 min預變性；95℃、15 s，64℃、15 s，72℃、45 s，共40個循環(huán)；72℃、10 min。以熔解曲線和產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷反應產(chǎn)物特異性。采用2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA表達水平，ΔCt=目的基因Ct－內(nèi)參照基因Ct。

表1 基因引物序列Tab.1Primer sequence of genes

1.6 Western blotting法檢測小鼠腓腸肌組織中ASNS、GRP78、ATF4、eIF2α和p-eIF2α蛋白表達水平小鼠腓腸肌組織按1 mL/100 mg的量加入RIPA組織裂解液，提取總蛋白。蛋白濃度測定采用Bio-Rad方法，先配制12%聚丙烯酰胺凝膠，以β-actin的水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，取30μg蛋白質(zhì)樣品，SDS-PAGE電泳，并用恒壓100 V將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，之后用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h后，用含0.01%Tween 20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，每次10 min；加入相應的抗體ASNS（1∶200）、GRP78（1∶200）、ATF4（1∶200）、eIF2α（1∶200）、p-eIF2α（1∶200）和GAPDH（1∶5 000），4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），常溫搖床孵育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照。以β-actin為內(nèi)參照，按照下列公式計算目的蛋白表達水平：目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶A值/β-actin條帶A值。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠腓腸肌SI，小鼠腓腸肌組織中ASNS、Atrogin-1和MuRF1 mRNA表達水平及ASNS、GRP78、ATF4、eIF2α和p-eIF2α蛋白表達水平，均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腓腸肌SI與C57對照組比較，C57移植瘤組小鼠腓腸肌SI明顯降低（P＜0.05）；與APP/PSI對照組比較，APP/PSI移植瘤組小鼠腓腸肌SI明顯降低（P＜0.05）；與C57移植瘤組比較，APP/PSI移植瘤組小鼠腓腸肌SI明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠腓腸肌SIFig.1SI of gastrocnemius tissue of mice in various groups

2.2 各組小鼠腓腸肌組織形態(tài)表現(xiàn)C57對照組小鼠腓腸肌細胞橫斷面可見骨骼肌細胞排列規(guī)則，細胞核呈扁橢圓形，圍繞肌膜下排列，肌漿呈紅色和白色肌纖維形態(tài)。C57移植瘤組小鼠腓腸肌細胞呈現(xiàn)玻璃樣變性，肌漿呈現(xiàn)藍染，部分細胞核可見核內(nèi)移現(xiàn)象（箭頭所示）。APP/PS1對照組小鼠腓腸肌組織中細胞排列規(guī)則，細胞核可見少量核內(nèi)移現(xiàn)象，肌漿可見紅色和白色肌纖維形態(tài)。APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌可見部分肌纖維腫脹，部分肌纖維變細，細胞核內(nèi)移現(xiàn)象多見，肌漿顏色以紅色為主。見圖2。

2.3 各組小鼠腓腸肌組織中Atrogin-1和MuRF1 mRNA表達水平與C57對照組比較，C57移植瘤組小鼠腓腸肌組織中Atrogin-1和MuRF1 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與APP/PS1對照組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中的Atrogin-1和MuRF1 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中Atrogin-1 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05），MuRF1 mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腓腸肌組織中Atrogin-1和Mu RF1 mRNA表達水平Tab.2Expression levels of Atrogin-1 and MuRF1 mRNA gastrocnemius tissue of mice in various groups (n=7,±s)

表2 各組小鼠腓腸肌組織中Atrogin-1和Mu RF1 mRNA表達水平Tab.2Expression levels of Atrogin-1 and MuRF1 mRNA gastrocnemius tissue of mice in various groups (n=7,±s)

*P＜0.05 compared with C57 control group；△P＜0.05 compared with APP/PS1 control group；#P＜0.05 compared with C57 transplanted tumor group.

Group C57 control C57 transplanted tumor APP/PS1 control APP/PS1 transplanted tumor Atrogin-1 1.00±0.00 1.25±0.16*0.97±0.11 1.64±0.13△#MuRF1 1.00±0.00 1.27±0.04*0.78±0.02 0.89±0.02△#

2.4 各組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA表達水平與C57對照組比較，C57移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與APP/PS1對照組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA表達水平Fig.3Expressionlevelsof ASNSmRNAin gastrocnemius tissue of mice in various groups

2.5 各組小鼠腓腸肌組織中ASNS蛋白表達水平與C57對照組比較，C57移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與APP/PS1對照組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 Western blotting法檢測各組小鼠腓腸肌組織中ASNS蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.4Electrophoregram(A)andhistogram(B)of expressions of ASNS protein in gastrocnemius tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

2.6 各組小鼠腓腸肌組織中PERK-eIF2α-ATF4信號通路蛋白表達水平與C57對照組比較，C57移植瘤組小鼠腓腸肌組織中GRP78、ATF4蛋白表達水平和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平比值明顯升高（P＜0.05）；與APP/PS1對照組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中GRP78、ATF4蛋白表達水平和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平比值明顯升高（P＜0.05）；與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中GRP78、ATF4蛋白表達水平和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平比值明顯降低（P＜0.05）。見圖5和圖6。

3 討 論

本研究基于同時患有阿爾茲海默病和惡性腫瘤的動物模型，從兩者之間氨基酸適應性反應ASNS轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平角度，探討正常組小鼠和患有阿爾茲海默病小鼠移植黑色素瘤后，骨骼肌發(fā)生肌肉減少的可能分子機制，以明確兩種疾病之間的關(guān)系，也為其預防和治療提供檢測指標和理論基礎。

本研究結(jié)果顯示：C57移植瘤組和APP/PS1移植瘤組小鼠部分骨骼肌細胞核可見核內(nèi)移現(xiàn)象，這是骨骼肌減少的特征性形態(tài)學標志。根據(jù)疾病的嚴重程度將肌肉減少癥分為3期［9-11］：僅有肌肉質(zhì)量減少為肌肉減少癥前期；肌肉質(zhì)量減少伴隨肌肉力量下降或身體活動能力降低為肌少癥期；肌肉質(zhì)量減少伴隨肌肉力量下降和身體活動能力降低為重度肌肉減少癥期。本研究結(jié)果顯示：從小鼠骨骼肌SI和形態(tài)學表現(xiàn)方面看，C57移植瘤組和APP/PS1移植瘤組小鼠表現(xiàn)出肌肉減少癥前期表型，即骨骼肌肌肉減少；與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠發(fā)生的骨骼肌肌肉減少更明顯。

肌肉蛋白質(zhì)合成和降解途徑之間動態(tài)平衡被改變時，就會發(fā)生肌肉減少［12］。肌肉蛋白合成減少和泛素化降解增多［1］是肌肉蛋白質(zhì)減少的主要機制。肌肉組織特異泛素-蛋白酶體系統(tǒng)標志物Atrogin-1和MuRF1表達上調(diào)與骨骼肌萎縮有關(guān)［13-14］。在適應性應激反應中，泛素蛋白酶體途徑也被認為適應性反應之一［5］。本研究結(jié)果顯示：分別與C57和APP/PS1對照組比較，C57移植瘤組和APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中Atrgin-1和MuRF1 mRNA表達水平均升高。泛素連接酶Atrogin-1和MuRF1是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解的重要因子，是骨骼肌特異的與萎縮相關(guān)的基因，也是肌肉蛋白質(zhì)降解的標志［15］。本研究結(jié)果提示：C57移植瘤組和APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中Atrgin-1 mRNA和MuRF1 mRNA表達水平與骨骼肌發(fā)生肌肉減少有關(guān)。

黑色素瘤高度依賴谷氨酰胺水平，骨骼肌的蛋白合成的主要氮源也來自谷氨酰胺，考慮到ASNS催化的反應也影響了其他3個反應物的水平，因此ASNS活性在評價谷氨酰胺穩(wěn)態(tài)時被考慮到。ASNS對實體腫瘤組織具有促進增殖的作用［16-17］，具體作用與ASNS的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與C57對照組比較，C57移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA和蛋白表達水平均升高，與APP/PS1對照組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA和蛋白表達水平均升高，提示移植瘤誘導ASNS mRNA和蛋白表達水平升高，可能與移植瘤組織增殖有關(guān)；與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中ASNS mRNA表達水平降低，蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，提示APP/PS1移植瘤組小鼠肌肉減少更明顯，且與ASNS mRNA轉(zhuǎn)錄活性降低有關(guān)，可能減少了蛋白質(zhì)合成。

圖6 各組小鼠腓腸肌組織中PERK-eIF2α-ATF4信號通路蛋白表達水平Fig.6Expression levels of PERK-eIF2α-ATF signal pathway proteins in gastrocnemius tissue of mice in various groups

腫瘤細胞在生長過程中過度的增殖增加了對蛋白合成的需求，最終超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力，錯誤折疊蛋白的堆積導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激［18］。據(jù)報道ASNS由氨基酸反應和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應（unfolded rotein response，UPR）所 激 活［19］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過UPR也增加了ASNS轉(zhuǎn)錄［20］。有研究［5，21］顯示：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在衰老的小鼠骨骼肌中被誘導，在饑餓時骨骼肌中可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR標志物被高度激活。ATF4結(jié)合CARE，并誘導ASNS轉(zhuǎn)錄［22］。產(chǎn)生的錯誤折疊蛋白由泛素蛋白酶途徑和自噬途徑降解。本研究結(jié)果顯示：與C57移植瘤組比較，APP/PS1移植瘤組小鼠腓腸肌組織中GRP78、p-eIF2α和ATF4蛋白表達水平降低，與ASNS mRNA表達水平降低相一致，提示PERK-eIF2α-ATF4信號途徑可能通過誘導ASNS轉(zhuǎn)錄，在APP/PS1移植瘤組小鼠的肌肉減少中發(fā)揮作用。