玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉IAA 的測定及其發(fā)酵液對煙草的影響

福建中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心 張燁

河南科技大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院 楊雅雯

吲哚乙酸（IAA）是生長素中最為普遍的一種，是在植物體內(nèi)自然合成、能促進細胞伸長的微量高效有機物，屬于農(nóng)藥范疇，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。IAA具有調(diào)節(jié)植物生長，使細胞的體積和質(zhì)量增加、促進細胞分裂和分化、調(diào)節(jié)生根等生理功能。植物體中的IAA 主要來自兩方面：通過色氨酸和非色氨酸前體的生物合成以及IAA 結(jié)合物的水解。而微生物在代謝過程中產(chǎn)生的IAA 主要來自于色氨酸合成途徑和非色氨酸合成途徑。利用IAA 產(chǎn)生菌作為微生物肥料具有重要的生產(chǎn)意義。鏈霉菌隸屬于原核生物界、放線菌目（Actinobacterales）鏈霉菌科（Streptomycetaceae），是具有非常復(fù)雜生命周期的革蘭氏陽性菌。鏈霉菌以菌絲體的形式定殖于多種植物體的根、莖、葉等部位而發(fā)揮功能。鏈霉菌屬也是一類重要的生防菌，其次級代謝產(chǎn)物不僅能產(chǎn)生各種抗生素，而且能產(chǎn)生植物激素類物質(zhì) 。目前，已知的鏈霉菌產(chǎn)生的9000 多種具有生物活性的物質(zhì)中，超過120 多種物質(zhì)得到了應(yīng)用，占微生物來源的生物活性物質(zhì)應(yīng)用品種數(shù)量的75%。目前已知抗生素種類有16 500 種，其中51%是由鏈霉菌產(chǎn)生。鏈霉菌分泌的農(nóng)用抗生素作為低毒、低殘留的生物農(nóng)藥逐步受到關(guān)注。近年，關(guān)于玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus）的報道大多數(shù)也是農(nóng)用抗生素的挖掘及其防病機制的研究，而對于微生物源植物生長調(diào)節(jié)劑開發(fā)的報道較為少見，因此我們期望能夠通過分離提取玫瑰黃鏈霉菌菌株代謝產(chǎn)生的IAA 來開發(fā)微生物源植物生長調(diào)節(jié)。木霉菌（Trichodermaspp）隸屬于半知菌（Deuteromycotina）亞門、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetales）、從梗孢科（Moniliaceae），是世界分布性真菌。近年來，木霉菌在工業(yè)、制藥業(yè)、環(huán)境保護、農(nóng)業(yè)等方面都有廣泛應(yīng)用，是具有重要經(jīng)濟價值的生防菌?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多具有重要價值的木霉菌，主要包括黃綠木霉（T.aureovirde）、綠色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningii）等。哈茨木霉（T.harzianum）也屬于木霉屬的真菌，普遍存在于自然界中，其能夠有效的防治鐮刀菌（Fusarium）、腐霉菌（Pythium）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等引起的植物白絹病、疫霉病、幼苗枯病等，是多種植物病原菌的拮抗菌和寄生菌，已作為生防制劑廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

我國是一個煙草大國，煙草業(yè)在國民經(jīng)濟中占有重要地位。自20 世紀50 年代末期，我國烤煙品質(zhì)有所下降，主要表現(xiàn)是煙葉薄、油潤差、香氣不足、盡頭小等。鏈霉菌和哈茨木霉在煙草上的應(yīng)用有很多，鏈霉菌可抑制煙草上的多種病原菌，如炭疽病原菌、赤星病菌（Alternaria alternata）、花葉病毒等，哈茨木霉生防菌不僅可防治多種煙草上的病害，也對煙草的生長具有一定的促進作用。煙草種子萌發(fā)和幼苗生長是烤煙優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培的基礎(chǔ)，提高種子萌發(fā)率，增強幼苗生長能力對提高煙葉質(zhì)量意義重大。本文研究玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus）和哈茨木霉（T.harzianum）菌株發(fā)酵液對煙草種子萌發(fā)和煙苗生長的作用，可為煙草生產(chǎn)中利用生防菌劑及生物菌肥提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

供試菌株玫瑰黃鏈霉菌、哈茨木霉由河南科技大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院植物病理實驗室保存。供試煙草品種為LY1306，由河南省煙草公司洛陽市分公司提供。培養(yǎng)基為大豆酵母培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

（二）方法

1.菌株發(fā)酵液的制備。將保存的玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉菌株分別接種在高氏1 號培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃下分別培養(yǎng)4～5 d、5 d，用打孔器分別在分離純化培養(yǎng)的玫瑰黃鏈霉菌、哈茨木霉菌菌落邊緣打孔，制成菌餅。每100 mL 大豆酵母培養(yǎng)基接入5個玫瑰黃鏈霉菌菌餅，每100 mL 真菌液體培養(yǎng)基打入3～4 個哈茨木霉菌餅。均置28℃恒溫培養(yǎng)箱180 r/min下振蕩培養(yǎng)4～5 d，進行種子初步擴繁，制備搖瓶種子液。分別取4%種子液接種于100 mL 大豆酵母液體培養(yǎng)基、真菌液體培養(yǎng)基中，另按1%接種量需要加入500 μL 色氨酸標準值，在每100 mL 大豆酵母液體培養(yǎng)基、真菌液體培養(yǎng)基中分別加入2 mL 色氨酸，28 ℃下220 r/min 分別搖培7 d、5～6 d，得到待測菌株發(fā)酵液。

2.菌株發(fā)酵液中IAA 的測定。

（1）制作IAA 標準曲線。取0.05g 的IAA 標準品，用50 mL 容量瓶定容成1000 mg/L 母液。分別取250 mL、500 mL、750 mL、1000 mL、1250 mL 母液配成10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L 工作液。上述溶液分別取2.5 mL 加入等體積Salkowski 比色液，用5 mL 容量瓶定容。室溫避光靜置30 min 后取出立即用分光光度計測定其OD535 值，以加入了比色液的培養(yǎng)基調(diào)零，重復(fù)3 次。以IAA 濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

（2）IAA 定性檢測。取1mL 懸浮菌液8000 r/min離心5 min，取100 μL 上清液滴于白色陶瓷板中并與等體積的Salkowski 比色劑混合進行顯色反應(yīng)。同時以50 mg/L 的IAA 標準品溶液100 μL 為陽性對照，以不加菌的培養(yǎng)基為陰性對照。室溫避光放置30 min，觀察顏色變化，顏色變?yōu)榉奂t色表示有IAA 產(chǎn)生。

（3）IAA 定量檢測。取菌株發(fā)酵液10 mL，8000 r/min 離心5 min。取5 mL 上清液等體積加入Salkowski 比色液，用10 mL 容量瓶定容。以未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基與Salkowski 比色液等體積混合作對照。室溫避光靜置30 min，測定OD535 值，根據(jù)IAA 標準曲線，計算發(fā)酵液中IAA 的含量。

3.菌株發(fā)酵液促生效果的測定。

（1）處理液的制備。制備的菌株發(fā)酵液與無菌水混合，配制成10%、20%、30%、40%、50% 和60%不同濃度梯度，分別裝在三角瓶中，在4℃冰箱中保存。

（2）煙草種子的處理。選取大小均一的種子，先用70%酒精和1%次氯酸鈉分別處理5 min、1 min，再用無菌水沖洗3 次。種子干燥后放在不同濃度的菌株發(fā)酵液中浸泡12 h，無菌水作對照（CK）。浸泡后的種子晾干后均勻置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿（加相應(yīng)處理液5 mL）中，置25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后定時統(tǒng)一補加處理液。每處理50 粒種子。重復(fù)3 次。注意保持發(fā)芽試驗過程中的足夠水分，種子四周的相對濕度應(yīng)在90%～95%。

（3）煙草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的測定。種子分別處理7 d、14 d 后記錄發(fā)芽數(shù)，以胚根伸出與種子等長時為發(fā)芽標準。發(fā)芽勢（%）=（7 d 內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/受檢種子數(shù)）×100，發(fā)芽率（%）=（14 d 內(nèi)全部發(fā)芽種子粒數(shù)/受檢種子數(shù)）×100。

（4）菌株對煙苗生長的影響。選取大小均勻一致的種子播種，生長25 d 后，選取長勢和葉片大小相對一致的煙苗栽在裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽內(nèi)（基質(zhì)填滿缽高的2/3，基質(zhì)成分是土壤與草炭土，比例為1：1），每缽1 株。放在一個育苗盤中的12 株煙苗分別用玫瑰黃鏈霉菌菌株、哈茨木霉菌株發(fā)酵液澆灌，每缽澆10 mL；9 株煙苗用自來水澆灌作對照，每缽澆10 mL。育苗盤在開始處理時澆上水，水的高度為1～2 cm。處理后的煙苗其生長需在室溫且相對濕度90%～100%育苗室中進行。處理后的煙苗在營養(yǎng)缽中培育14d 后測定其新生并展開的兩片葉（正一葉、正二葉）的長度（葉尖到莖基部）和葉寬（葉片最寬處）。在煙苗生長過程中要定期在育苗盤中澆水，控制其外部生長條件的一致，且要及時清除一些爛葉和雜葉。在育苗室定期交換煙苗位置，使每一株煙苗所接受的光照是均勻和充分的。

二、結(jié)果與分析

（一）IAA 標準曲線

通過Salkowski 比色試驗，確定了玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉代謝的過程中可以產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA），以吸光值OD535 為縱坐標（y），IAA 的濃度為橫坐標（x）制作標準曲線（圖1），并得到線性回歸方程y=0.043 1x-0.366 6，R2=0.997 7。

圖1 IAA 標準曲線

（二）菌株發(fā)酵液中IAA 的含量

根據(jù)所制的標準曲線得到玫瑰黃鏈霉菌基礎(chǔ)發(fā)酵液中IAA 的含量是9.60 mg/L，哈次木霉基礎(chǔ)發(fā)酵液中IAA 的含量是12.03 mg/L（表1）。

表1 玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉菌株發(fā)酵液中IAA 含量

（三）菌株發(fā)酵液的促生效果

1.玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液對煙草的促生效果。由表2 可看出，玫瑰黃鏈霉菌菌株發(fā)酵液濃度在10%～60%時的發(fā)芽勢和發(fā)芽率都高于或等于CK，但濃度大于40%時其整體煙草種子的發(fā)芽勢是趨于下降的，而發(fā)芽率和對照的持平。表明玫瑰黃鏈霉菌菌株發(fā)酵液具有促生能力。菌液對煙草種子萌發(fā)的促進作用最顯著的濃度是20%和30%，在菌液濃度大于40%時其促生作用減弱。說明較高濃度的菌株發(fā)酵液會表現(xiàn)出對煙草種子萌發(fā)的抑制作用。

表2 玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液下煙草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

2.哈茨木霉發(fā)酵液對煙草的促生效果。從表3 可知，菌液濃度10%～40%時的煙草種子發(fā)芽勢都高于CK，但濃度在50%和60%時煙草種子的發(fā)芽勢低于CK。菌液濃度在10%～60%時的煙草種子發(fā)芽率都高于CK，但濃度大于30%時發(fā)芽率是逐漸下降的。表明哈茨木霉菌株發(fā)酵液對煙草種子的發(fā)芽具有促進作用，促進作用在菌液濃度為30%時最為顯著。

表3 哈茨木霉發(fā)酵液下煙草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率

3.在一定濃度下的玫瑰黃鏈霉菌、哈茨木霉菌株發(fā)酵液對煙草種子的發(fā)芽有促進作用，而高濃度對煙草種子的發(fā)芽表現(xiàn)出現(xiàn)抑制作用。

（四）菌株發(fā)酵液對煙苗生長的影響

從表4 可以看出，對照組煙苗在14 d 內(nèi)的長勢均較好，正一葉的平均長度都在12.8 cm、寬度6.7 cm，正二葉的平均長度接7.6 cm，寬度接近4 cm。用玫瑰黃鏈霉菌菌株發(fā)酵液處理后的煙苗葉片大于對照組的正一葉的長度和寬度，但是這種促進作用在煙苗14 d的生長期內(nèi)表現(xiàn)的不是特別顯著。用哈茨木霉菌株發(fā)酵液處理的煙苗正一葉和正二葉的長度和寬度均小于對照組的，表明哈茨木霉菌株發(fā)酵液在此用量下對煙苗生長沒有促進進用，甚至會對煙苗的生長表現(xiàn)出抑制的作用。

表4 移栽14d 的煙苗葉片性狀

三、結(jié)論

玫瑰黃鏈霉菌和哈茨木霉發(fā)酵液IAA 的產(chǎn)量分別為9.60 mg/L、12.03 mg/L。玫瑰黃鏈霉菌培養(yǎng)液濃度在20%和30%時對煙草促生作用較為明顯，大于40%對煙草種子萌發(fā)有抑制作用；哈茨木霉培養(yǎng)液濃度在30%時對煙草促生作用最為明顯，大于30%時對種子萌發(fā)有抑制作用。兩種菌的發(fā)酵液處理煙苗14 d 后，經(jīng)玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液處理的煙苗正一葉的長度與寬度大于對照，在本試驗濃度范圍內(nèi)對煙苗生長具有一定的促生作用；哈茨木霉菌株發(fā)酵液處理的煙苗正一葉和正二葉的葉片長度和寬度接近甚至小于對照，在濃度范圍內(nèi)對煙苗生長幾乎無促生作用。