生大黃、清蒸熟大黃與熟大黃炮制品總黃酮含量的比較研究?

蘇華珍，謝 臻，魏江存，譚親友，羅昱瀾，鐘 文△，黃冬美

1 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541001；2 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院

大黃Rheumofficinale Baill.是我國特產(chǎn)中藥之一，包括45個品種和2個亞種，其中只有唐古特大黃、正品大黃和藥用大黃的根莖及干燥根［1］可作為藥用大黃，已經(jīng)載入《中華人民共和國藥典》2015 年版。大黃適宜內(nèi)服外用，能攻邪、能止血、能通阻、能解毒，在祖國醫(yī)學(xué)中藥方中為常用藥物［2］。早在秦漢時期，《神農(nóng)本草經(jīng)》就將其列為中品，后在明代李時珍編寫的《本草綱目》中也有記載［3］。臨床上應(yīng)用的飲片常有大黃炭、醋大黃、熟大黃、生大黃及酒大黃［4-5］。就瀉下而言，酒制后其苦寒瀉下的作用稍微緩和，以分解熱毒，清上焦血作用為主；醋制后消積化瘀作用顯著而瀉下作用較弱；大黃炭以涼血化瘀作用顯著而瀉下作用甚微［6-8］?？芍煌嬈幕瘜W(xué)成分、藥效性能及臨床作用因其炮制的方法、溫度、時間、輔料的改變而改變。研究表明［9］，大黃具有止血作用的主要藥效成分是鞣質(zhì)中含有的沒食子酸和兒茶素；大黃中的蒽醌含量密切影響其泄下、解熱作用［4，10-13］。大黃素及大黃酸具有顯著的利尿作和抗炎作用。以往的研究多是對生大黃及大黃炮制品前后蒽醌類的成分含量的研究［4，14-15］。中藥炮制后，藥性改變，毒副作用降低［16-18］。

總黃酮是黃酮類化合物的總稱，黃酮類化合物與糖結(jié)合形成苷，具有良好的鎮(zhèn)痛消炎作用。以往研究對炮制前后大黃總黃酮類成分含量差異性比較研究較少。本研究采用紫外-可見分光光度計法對生大黃與熟大黃炮制品的總黃酮含量進(jìn)行測定，明確其兩種不同炮制品的總黃酮含量是否發(fā)生了變化，為其質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)研究提供試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器UV1780 型紫外分光光度計［島津儀器（蘇州）有限公司］；電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；純水儀（法國，密理博）；TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥與試劑中藥飲片大黃（產(chǎn)地：四川，廣東康美藥業(yè)有限公司，批號：170307001），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室李斌副教授鑒定，中藥大黃為蓼科植物藥用大黃的根莖。清蒸熟大黃和熟大黃按照2015 年版《中華人民共和國藥典》（四部）炮制通則（0213）和相關(guān)參考文獻(xiàn)自行炮制。蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201106）；甲醇、乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20180603、20170327）；磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20170502）；亞硝酸鈉（天津博迪化工股份有限公司，批號：20180806）；硝酸鋁（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20170510）；氫氧化鈉［重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號：20170905］；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液制備精密稱取大黃藥材粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇30 mL，稱取質(zhì)量，超聲2 h 后，補重，過濾，取續(xù)濾液8 mL 轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進(jìn)行定容，搖勻，即得用于測總黃酮含量的大黃樣品溶液［19-20］。

2.2 線性方程的制定精密稱取蘆丁對照品11.96 mg，加體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，得到濃度為0.2392 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，再加0.4 mL10%硝酸鋁搖勻，放置6 min后，再加4 mL4%的氫氧化鈉，加水至刻度，搖勻，室溫靜置15 min，然后分別在最優(yōu)波長508 nm進(jìn)行測定。得出結(jié)果以吸光度對濃度做線性方程為y=11.125x+0.030 8，r=0.999 2，可得出線性濃度范圍在0.004 784～0.095 68 mg/mL，此范圍表明濃度與吸收度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系［21］。

2.3 精密度試驗精密稱取生大黃1.0 g，按“2.1”項下操作步驟制備供試品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定項下相同的方法顯色測定（每間隔5 min測1次，連續(xù)進(jìn)樣6次）。于508 nm波長處連續(xù)進(jìn)樣6次測定其吸光度，測定結(jié)果RSD 值為2.46%，表明該方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗精密稱取大黃1.0 g，按“2.1”項下操作步驟制備供試品，測定同一供試液在不同時間下的吸收度，按于508 nm 波長處平行測定其吸光度，分別在0、10、20、30、40、60 min 測定吸光度，計算大黃的RSD值為2.91%，結(jié)果表明，吸收度值在60 min內(nèi)基本不變。可見在60 min內(nèi)樣品穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗精密稱取6 份大黃樣品1 g，按“2.1”項下操作步驟制備供試品，制備6 份供試品溶液，依法測定，于508 nm波長處平行測定不同供試液在相同顯色時間下的吸收度，計算大黃總黃酮的含量，其中生大黃含總黃酮221.58 mg/g，清蒸熟大黃含總黃酮215.64 mg/g，熟大黃含總黃酮190.82 mg/g，RSD值分別為1.98%、2.63%和2.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗精密量取已知總黃酮含量的供試品溶液6 份，每份0.5 mL 于10 mL 容量瓶中，精密加入適當(dāng)?shù)奶J丁對照品，于508 nm波長處依法提取、平行測定其吸光度，計算總黃酮的含量。生大黃平均回收率為98.91%，清蒸熟大黃平均回收率為98.86%，熟大黃平均回收率為99.97%，其RSD 分別為2.07%、2.62%和2.92%（n=6）該方法回收率良好。見表1—3。

表1 生大黃加樣回收率試驗結(jié)果

2.7 樣品含量測定精密稱取大黃藥材粉末1.0 g，置錐形瓶中，加30 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，稱重并進(jìn)行記錄，超聲2 h 后，補重，過濾，取續(xù)濾液8 mL 于100 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻，即得大黃樣品溶液。精密吸取大黃樣品溶液1.0 mL，轉(zhuǎn)入10 mL 容量瓶中，按樣品測定方法操作，測定不同供試液在相同顯色時間下的吸收度；將所測得數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。見表4。

表4 大黃不同炮制品含量測定結(jié)果

表2 清蒸熟大黃加樣回收率試驗結(jié)果

表3 熟大黃加樣回收率試驗結(jié)果

3 討論

生大黃和黃酒攪拌均勻燜潤后蒸制就變成了熟大黃，熟大黃的瀉下作用稍微降低，而生大黃直接在蒸籠蒸制炮制為清蒸熟大黃后，其瀉下作用幾乎沒有什么變化。不同的炮制方法對大黃的成分產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而改變大黃的療效及藥性，因此分析研究不同的大黃炮制品成分，可更加深入認(rèn)識大黃及其炮制品［22-23］。不同的炮制方法對大黃總黃酮含量有明顯的影響。由于蒸制時間、高溫和輔料（黃酒）等原因，熟大黃總黃酮和總蒽醌含量會明顯下降。生大黃、清蒸熟大黃的總黃酮含量較熟大黃稍高，生大黃和清蒸大黃由于炮制條件相對緩和，其成分變化相對較?。?4］。大黃炮制條件的不同對其鞣質(zhì)含量也會產(chǎn)生一定的影響，鞣質(zhì)含量在生大黃和清蒸熟大黃中相對較高，但在熟大黃中明顯下降，這與炮制過程中溫度、輔料、炮制時間等條件有關(guān)［25］。炮制大黃時，由于炮制溫度較高及其輔料的影響，鞣質(zhì)、蒽醌類含量受到影響，甚至出現(xiàn)其他成分的變化，從而導(dǎo)致藥效的改變［26］。

在中藥的提取工藝中廣泛運用了超聲技術(shù)，尤其在總黃酮的提取中應(yīng)用尤多［27］，可以有效優(yōu)化從藥材提取總黃酮的提出率。超聲技術(shù)提取藥材通常在常溫下操作，避免了黃酮由于高溫引起的分解。超聲波使得浸提過程能耗低、效率高，同時被浸提的物質(zhì)在一定時間內(nèi)不被破壞，具有穩(wěn)定的生物活性，由此可保證在結(jié)構(gòu)改變的情況下，研究藥理活性時結(jié)論的正確性。

綜上所述，經(jīng)過不同的炮制方法對中藥大黃進(jìn)行炮制，其成分會發(fā)生一定的變化，在臨床應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)患者的具體情況使用不同的炮制品。