夾脊電針對兔退變腰椎間盤神經(jīng)纖維內向生長的影響*

王 科，黃國付，李 李，王力霞△

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065； 2.武漢市武昌醫(yī)院，湖北 武漢 430063)

椎間盤退變廣泛存在于各年齡段人群中，以其為病理基礎的腰椎間盤退行性疾病如盤源性腰痛、腰椎間盤突出癥等因臨床發(fā)病率高且易復發(fā)，嚴重影響患者生活質量甚至導致勞動能力喪失，所以對其防治研究一直是國際相關領域的重點。腰椎間盤退變性疾病屬于我國中醫(yī)學之“腰痛”“痹證”范圍，電針在治療腰椎間盤突出癥(LDH)等以椎間盤退變?yōu)椴±砘A的疾病療效確切，得到了廣泛認可[1-2]。

健康的椎間盤神經(jīng)纖維分布于纖維環(huán)的外1/3，有研究發(fā)現(xiàn)退變椎間盤中存在神經(jīng)纖維內向生長的現(xiàn)象，椎間盤退變釋放大量炎性介質或力學失衡刺激了內向生長的新生神經(jīng)纖維[3-4]，成為椎間盤源性疼痛的病理基礎。神經(jīng)絲蛋白(NF)是構成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細胞骨架的主要成分，脊髓損傷后，其在相關修復過程中扮演了重要角色[5]。P物質(SP)是一種神經(jīng)遞質，廣泛存在于初級神經(jīng)元和神經(jīng)纖維中，感受器興奮而分泌。Netrin-1是一種具有雙向調節(jié)功能的神經(jīng)導向因子。本研究從以上角度研究電針對退變腰椎間盤神經(jīng)纖維內向生長的影響，探析電針預防和治療椎間盤退變性疾病可能的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康成年雄性新西蘭大白兔20只，月齡5～6月，體質量3.5～4 kg，由武漢萬千佳興生物科技有限公司提供(合格證編號:No.42010000002901)，在標準條件下飼養(yǎng)4周后開始實驗，實驗過程通過了武漢市第一醫(yī)院動物倫理委員會的審批。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 GE Signa HDx 3.0T磁共振儀(美國通用電氣)；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(HANS)；脫水機、凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；攤片機、包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；切片機(上海徠卡儀器有限公司)；烘箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司)；微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司)；脫色搖床(北京六一儀器廠)；普通光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)。

1.2.2 試劑 10×EDTA修復液(谷歌生物)；H2O2(國藥集團化學試劑有限公司)；BSA(Roche，北京索萊寶科技有限公司分裝)；抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE(Dako Denmark A/S)；Anti -Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb、Anti-Substance P Rabbit(Servicebio)。

1.3 造模方法

采用Kroeber等[6]及黃國付等[7]的造模方法，用10%水合氯醛(1 mL/kg)沿耳緣靜脈緩慢推注麻醉后，以俯臥位固定，實驗兔背部備皮，找到L4～5并在其同側碘伏消毒后做直切口，鈍性分離椎旁筋肉，顯露椎體后分別在其鉆入一直徑1.5 mm的克氏針，并在每根克氏針兩頭裝配一垂直連接桿，兩個連接桿之間安置一彈簧裝置，并施加200 N的壓力持續(xù)28 d，如圖1，術后予以青霉素4×106U肌注，1次/d，連續(xù)治療5 d，達到造模周期后進行磁共振成像檢測，確認造模是否成功。

圖1 模型的建立和電針治療

1.4 分組及處理

所有動物分為正常組(Control)、模型組(Model)、假模型組(Sham)、模型+電針組(Model+EA)和模型+假電針組(Model+Acu)5組，每組4只。正常組：自然飼養(yǎng)28 d，不作任何治療；模型組：軸向壓力誘導椎間盤退變28 d；假模型組：處理同模型組但不進行椎體間加壓；模型+電針組：軸向壓力誘導椎間盤退變28 d，造模成功后第1天開始針刺治療，每療程治療時間為6 d，療程間期為1 d，共治療4療程；模型+假電針組：處理及治療同電針組，但針刺夾脊穴不通電。

治療方法：參照“實驗針灸學”[8]實驗動物穴位定位標準，取兔L4～5夾脊穴，消毒后開始針刺治療(0.30 mm×25 mm,蘇州產(chǎn)無菌針灸針)，針刺深度5～8 mm，進針后快速捻轉至針下有沉澀感后，在針柄上連接韓式穴位神經(jīng)刺激儀，刺激頻率為2/15 Hz，刺激強度為1～2 mA，20 min/次，1次/d,如圖1。

1.5 觀察指標及方法

正常組、模型組和假模型組處理后28 d拆除加壓裝置，并拔出克氏針，行磁共振檢測后處死動物取出L4～5椎間盤(包括纖維環(huán)和髓核)；模型+電針組、模型+假電針組治療療程結束后處理方法同上。所有組織編號并根據(jù)固定-脫水-透明化-浸蠟包埋-修塊-切片-攤片順序制備包埋切片。通過HE染色方法觀察電針對退變椎間盤的組織學改變：切片置于二甲苯溶液中脫蠟，然后置于梯度遞減濃度酒精中(100%～75%)脫二甲苯，蒸餾水洗去酒精，蘇木素染色，酒精分化，氨水返藍，再將伊紅染液置入染色，再置入梯度遞增濃度酒精中(95%～100%)脫水，二甲苯處理15 min后中性樹膠封片拍照。

運用免疫組化的方法觀察電針對退變椎間盤的保護作用。分別進行NF200、SP和Netrin1組化染色并評分，觀察神經(jīng)纖維在椎間盤的內向生長。每組切片置于65 ℃烘箱2 h，脫蠟后用PBS沖洗，EDTA微波修復，PBS沖洗，再放入3%H2O2孵育10 min，PBS沖洗后充分甩出液體再用5%BSA封閉。除去BSA后每張標本切片置入50 μL一抗：Anti -Netrin1(Abcam,貨號：ab122903)；Anti -Substance P Rabbit(Servicebio；貨號：GB11412)； Anti -Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb (Servicebio；貨號：GB13141)。4 ℃過夜，PBS沖洗并去除后加入同樣劑量相應種屬的二抗，重復處理后加入同樣計量相同種屬的Netrin-1抗體，4 ℃孵育50 min。PBS沖洗后DAB溶液處理。顯色完全后沖洗復染，分化反藍。切片通過濃度遞增酒精(70%～100%)充分脫水后透明化，中性樹膠封固。將切片放在普通顯微鏡下，觀察、采集圖片，每張切片選擇3個高倍鏡視野，應用Image J圖像分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細胞后再進行統(tǒng)計學分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 磁共振成像結果

術后28 d到達造模周期后行GE Signa HDx 3.0T磁共振儀成像檢測，攝取T2加權矢狀位圖像，結果顯示見圖2。正常椎間盤顯示為勻稱明亮的高信號，加壓28 d后L4～5椎間盤顯現(xiàn)顏色深暗的低信號，與相鄰上下椎間盤及正常椎間盤有明顯差異，證明椎間盤退變動物模型建立成功。

圖2 造模前后磁共振檢測椎間盤組織信號變化

2.2 組織學研究

HE染色發(fā)現(xiàn)：正常組椎間盤髓核區(qū)呈橢圓形，纖維環(huán)排列整齊致密有序，與髓核之間界限清楚，髓核為高度凝膠狀物質。退變椎間盤髓核皺縮，纖維環(huán)排列松散，出現(xiàn)較小的裂縫。經(jīng)過針刺28 d治療后，纖維環(huán)重新排列，細胞外基質含量增加，退變椎間盤組織有再生跡象,如圖3，通過電針的干預可使纖維環(huán)營養(yǎng)重新分布，對椎間盤退變有一定的保護作用。

圖3 各組標本HE染色(200×)

2.3 免疫組化

2.3.1 NF200表達 如圖4和表1，正常組及假模型組椎間盤中NF200有少量表達，模型組較正常組及假模型組NF200明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，

模型組與假電針組NF200表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，電針治療后NF200表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3.2 SP表達 如圖5和表1,正常組及假模型組椎間盤標本中P物質(SP)基本不表達，模型組中SP陽性染色可見于纖維環(huán)和髓核之中，較正常組與假模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型組與假電針組SP表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，電針28 d治療后椎間盤SP表達相對減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3.3 Netrin-1表達 定位于細胞膜、細胞漿和細胞外基質中，在椎間盤髓核和纖維環(huán)中均有分布。如圖6、表1,正常組及假模型組椎間盤組織中有少量Netrin-1表達，隨著椎間盤逐漸的退變和衰老，Netrin-1表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可見陽性染色細胞增多，模型組與假電針組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。電針治療可下調椎間盤中Netrin-1的表達，與電針組相比，假電針組中觀察到組織中Netrin-1表達顯著上調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：與正常組及假模型組比較，#P<0.05；與模型組比較,*P<0.05;與模型+電針組相比較，+P<0.05。圖4 各組標本NF200免疫組化(200×)

注：與正常組及假模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與模型+電針組比較,+P<0.05。圖5 各組標本SP免疫組化(400×)

注：與正常組及假模型組比較,#P<0.05；與模型組比較,*P<0.05；與模型+電針組比較,+P<0.05。圖6 各組標本Netrin-1免疫組化(200×)

表1 各組標本NF200、SP及Netrin-1陽性細胞數(shù)

3 討論

在椎間盤退變過程中，最顯著的特點是神經(jīng)纖維沿著纖維環(huán)破裂的縫隙向椎間盤內部生長，這些內向生長的神經(jīng)纖維受到椎間盤退變所釋放大量炎性介質的化學刺激或由椎間盤不穩(wěn)造成的機械刺激成為盤源性疼痛發(fā)生的重要病理基礎。椎間盤結構的完整性決定了其特有的生理功能。軟骨終板、髓核以及纖維環(huán)共同組成了應力緩沖系統(tǒng)，異常應力首先累及軟骨終板，軟骨終板路徑營養(yǎng)供給減少是椎間盤退變的始發(fā)元素[9-10]，隨之出現(xiàn)椎間盤內含水量降低，細胞合成蛋白多糖能力下降，細胞外基質(ECM)分解，椎間盤彈性下降[11]，纖維環(huán)分擔更多的異常應力，長時間重復超負荷作用下纖維環(huán)將出現(xiàn)顯著的板層分離[12]，本研究也證實了這一點，破損的纖維環(huán)失去了正常的生理功能，對髓核的約束力減弱，髓核更容易從破損處突出。Peng B等[13]發(fā)現(xiàn)盤源性腰痛患者椎間盤中新生神經(jīng)纖維沿著椎間盤破裂間隙中的肉芽組織長入纖維環(huán)和髓核，這可能是導致臨床癥狀的主要原因。

腰椎間盤內的神經(jīng)纖維主要為感覺神經(jīng)纖維和交感神經(jīng)纖維[14-18]。NF按分子質量可分為NF68、NF140和NF200 3種，NF200正常情況下只存在于軸索中，胞體中含量極少，故染色呈陰性。椎間盤破裂后產(chǎn)生大量炎性介質以及創(chuàng)傷刺激促使其內神經(jīng)元大量積累NF200以完成神經(jīng)的修復與生長。既往對NF200研究[19-21]在脊髓損傷的恢復中的作用較多。實驗中健康組及假模型組NF200表達基本相同，模型組NF200表達顯著升高，認為NF200參與退變腰椎間盤神經(jīng)纖維內向生長。

SP自身可以誘發(fā)炎癥反應,其可能機制是通過增加椎間盤中白介素-6(IL-6)的表達激活炎癥反應[22]。SP還可以間接激活作用于局部傷害感受器表面的辣椒素受體(VR1),形成疼痛信號向中樞傳遞,使人體感知疼痛，同時局部高濃度聚集的氫離子還可以直接激活感覺神經(jīng)元,通過持續(xù)產(chǎn)生激發(fā)電流,從而加強疼痛信號的傳導；作為神經(jīng)遞質,其自身也參與疼痛信號的傳遞,增強大腦對疼痛的感受[23]。亦有研究[24]證明，電針可降低SP并提高5-HT而緩解偏頭痛。退變的椎間盤髓核或撕裂的纖維環(huán),炎癥反應刺激椎間盤內細胞合成釋放相關神經(jīng)生長因子(NGF和BDNF)[25],通過誘導向內生長的神經(jīng)纖維表達SP等神經(jīng)肽,產(chǎn)生傷害性感受信息，引起盤源性腰痛[18，26]。

Netrin-1雙向調節(jié)功能是通過依靠不同的受體來實現(xiàn)[26]。一個是二環(huán)己基碳二亞胺，介導Netrin-1吸引軸突的作用，促進神經(jīng)纖維長芽和延伸[27]，另一個則是UNC5B，介導其發(fā)揮排斥軸突的作用，抑制神經(jīng)纖維長芽和延伸[28]。筆者推測Netrin-1的兩個受體在椎間盤和DRG中的分布是不同的，經(jīng)文獻檢索后發(fā)現(xiàn)[29-30]：UNC5B受體在成年動物脊髓和DRG感覺神經(jīng)元中的表達量遠遠高于DCC受體，而在椎間盤，DCC受體的含量明顯要高一些。因此，在退變的椎間盤中，Netrin-1與DCC相結合，誘導神經(jīng)定向生長，是導致盤源性腰痛及下腰痛的主要原因，電針能下調退變椎間盤Netrin-1中的表達，抑制神經(jīng)內向生長。在正常椎間盤中，也發(fā)現(xiàn)了少量的Netrin-1，其機制有可能參與椎間盤細胞本身活性的維持及誘導椎間盤內部細胞的遷移，或是Netrin-1的低表達隨時為神經(jīng)血管的內生長做著準備，一旦發(fā)生椎間盤嚴重退變，伴隨纖維環(huán)破裂以及神經(jīng)血管的浸入反應，Netrin-1在這種條件下出現(xiàn)高表達，NF200在其引導下完成內向生長，在退變椎間盤中，Netrin-1免疫陽性盤細胞百分比與神經(jīng)血管評分呈顯著正相關[31]。

本研究應用軸向壓力誘導方法成功制備腰椎間盤退變模型，發(fā)現(xiàn)退變的椎間盤髓核皺縮，纖維環(huán)排列松散，出現(xiàn)較小的裂縫；并且NF200、SP和Netrin-1陽性細胞數(shù)較正常椎間盤明顯增加，提示可能在Netrin-1引導下NF200參與退變椎間盤神經(jīng)纖維的內向生長，SP釋放增多是引起盤源性腰痛的可能原因。電針治療后，纖維環(huán)出現(xiàn)重新排列，細胞外基質增加，椎間盤組織有再生跡象；NF200、SP和Netrin-1陽性細胞數(shù)較模型組明顯減少，說明電針治療可能通過減少NF200、Netrin-1而抑制退變椎間盤神經(jīng)纖維內向生長，并且通過降低SP釋放緩解因退變導致的疼痛。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)電針可以從降低椎間盤組織中MMP-13和增強TIMP-1的表達以及actin、tubulin的表達等方面防治椎間盤退變[32-33]。叢心宇等[34]制備了椎間盤退變大鼠模型，并使用電針干預，發(fā)現(xiàn)電針可以降低退變椎間盤組織中ADAMTS-4的表達進而治療椎間盤退變。夾脊電針可降低以椎間盤退變?yōu)椴±砘A的LDH患者Oswestry功能障礙指數(shù)并緩解其臨床癥狀，改善椎間盤退變Pfirrmann’s MRI分級指數(shù)[35]。本研究闡明了電針夾脊穴治療腰椎間盤退變的可能機制，為臨床治療相關疾病提供理論依據(jù)，但其具體依靠哪一通路以及電針對退變椎間盤內交感神經(jīng)內向生長有無影響尚未明確。