基于油-水界面行為解析蛋白質(zhì)乳液絮凝機制及其控制方法研究進展

紀(jì)雪花，杜啟偉，蘇琪皓，陳玉峰，丁玉庭，周緒霞,*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.國家遠洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（杭州），浙江 杭州 310014；3.蘇州錦華寵物用品有限公司，江蘇 蘇州 215105）

乳液是食品加工業(yè)中最重要的體系之一，一般指一種液體以液珠形式均勻分散在另一種與其互不相溶的液體中形成的體系。作為一種多相分散體系，乳液的分散相粒徑一般在0.1～100 μm之間，且存在較大的油-水界面，為熱力學(xué)不穩(wěn)定體系[1]。為了提高乳液的穩(wěn)定性，通常需要向體系中加入表面活性劑或乳化劑。蛋白質(zhì)作為兩親分子，能夠通過在油-水界面形成吸附層降低界面張力而起到乳化作用，是優(yōu)良的天然乳化劑來源。但蛋白質(zhì)乳化特性易受其存在形態(tài)、溫度、pH值和離子強度等內(nèi)外因素的影響而導(dǎo)致乳液絮凝等失穩(wěn)現(xiàn)象的產(chǎn)生。本文綜述了蛋白質(zhì)乳液絮凝類型及其影響因素，基于油-水界面行為闡釋了乳液絮凝及穩(wěn)定機制，概述了蛋白與多糖、多酚的二元及三元復(fù)合物的抗絮凝機制及應(yīng)用進展，旨在為穩(wěn)定型蛋白質(zhì)乳液的制備提供理論依據(jù)。

1 蛋白質(zhì)乳液絮凝機制及其影響因素

1.1 蛋白質(zhì)乳液絮凝的類型及其機制

乳液絮凝現(xiàn)象指水包油乳液中很大一部分分散的液滴以小簇或大簇（絮凝物）的形式緊密相鄰存在的狀態(tài)。根據(jù)酪蛋白酸鈉穩(wěn)定乳液的微觀和流變動力學(xué)變化分析可將乳液絮凝分為兩種類型，即橋接絮凝和耗散絮凝[2]。橋接絮凝指的是當(dāng)乳液中蛋白質(zhì)濃度較低時，液滴之間產(chǎn)生共享蛋白質(zhì)的現(xiàn)象[3]；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度超過一定臨界值時，連續(xù)相中未吸附的或過量的蛋白質(zhì)會通過滲透作用使得液滴間吸引力增大從而導(dǎo)致耗散絮凝[4]。乳液絮凝機制目前主要有電荷中和作用和吸附架橋作用兩種理論，其中前者認為吸附在油-水界面處的蛋白質(zhì)分子間靜電斥力降低使大分子相互碰撞而產(chǎn)生絮凝，而后者將絮凝解釋為多個蛋白質(zhì)通過“架橋”方式束縛在一起而形成絮凝體[1]。

1.2 基于界面行為解析影響蛋白質(zhì)乳液絮凝的因素

蛋白質(zhì)乳液中具有兩親性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子無論在油-水還是在氣-水界面都會自發(fā)從體相內(nèi)向界面吸附，且該吸附過程是一個復(fù)雜的動態(tài)過程（圖1），受蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、形態(tài)等內(nèi)部因素和蛋白濃度、溫度、pH值和離子強度等外部因素的共同影響，而其影響機制在一定程度上都可通過界面行為進行解析。

圖1 蛋白質(zhì)油-水界面吸附過程示意圖[5]Fig. 1 Schematic diagram of protein adsorption process at oil-water interface[5]

1.2.1 蛋白質(zhì)種類及濃度對乳液絮凝的影響

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會影響其在油-水界面的吸附動力學(xué)和蛋白膜的結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生不同的乳液絮凝現(xiàn)象[6]。乳蛋白因其結(jié)構(gòu)、柔韌性、聚集狀態(tài)以及油-水界面組成的差異會有不同的乳化能力。其中乳清蛋白具有緊密的球狀結(jié)構(gòu)，表面存在大量親水性殘基[7]，吸附后界面層球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開導(dǎo)致界面膜厚度變薄，以及分子內(nèi)疏水基團如半胱氨酸等暴露，從而增強乳液的絮凝作用。而酪蛋白具有無序的柔性結(jié)構(gòu)，當(dāng)吸附在油-水界面時會因酪蛋白膠束次級結(jié)構(gòu)被破壞，二硫鍵和巰基交換反應(yīng)的發(fā)生導(dǎo)致蛋白構(gòu)象變化而引起乳液絮凝[8]。植物蛋白如大豆蛋白[9]、豌豆蛋白[10]和玉米醇溶蛋白[11]等會因界面功能性差、水溶性差等問題而產(chǎn)生乳液絮凝現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是影響乳液絮凝的內(nèi)部因素，而乳液中蛋白質(zhì)的濃度則是影響乳液絮凝的外部重要因素。Hu Miao等[12]對大豆蛋白-紫蘇油乳液的研究表明，蛋白質(zhì)濃度對乳液絮凝有顯著影響，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和4%的乳液在25 ℃貯藏5 d后均出現(xiàn)絮凝，而蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的乳液保持穩(wěn)定。通常研究蛋白質(zhì)濃度對乳液的影響是假定在界面飽和的情況下，而Delahaije等[13]結(jié)合吸附速率和吸附量對乳液穩(wěn)定性的影響提出了新的表面覆蓋模型，即在蛋白質(zhì)濃度遠低于單層飽和覆蓋所需濃度的乳液中，體系表現(xiàn)出時間依賴性的橋接絮凝，而較高的蛋白質(zhì)濃度會因存在大量未吸附蛋白從而造成蛋白包被的油滴產(chǎn)生耗散絮凝，導(dǎo)致體系穩(wěn)定性的降低。Hebishy等[14]對酪蛋白酸鈉-植物油乳液微觀結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的蛋白乳液未達到界面飽和而出現(xiàn)橋接絮凝，這與Delahaije等[13]的結(jié)論一致。另外，Delahaije[15]、Mcclements[16]等對乳清分離蛋白穩(wěn)定乳液的研究發(fā)現(xiàn)，過低的蛋白質(zhì)濃度不能完全覆蓋界面導(dǎo)致不可逆的絮凝，而在蛋白質(zhì)充足的情況下絮凝則是可逆的。

1.2.2 pH值對乳液絮凝的影響

pH值主要通過影響乳液體系中電荷含量而影響界面吸附層蛋白構(gòu)象、表面疏水性和粒徑[17]。當(dāng)乳液體系pH值向蛋白質(zhì)等電點pI轉(zhuǎn)移時，體系中電荷數(shù)和靜電斥力減少，蛋白質(zhì)的疏水殘基暴露，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的完全展開和迅速聚集，乳液粒徑也相應(yīng)增大，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)乳液液滴絮凝的發(fā)生；相反，當(dāng)乳液體系pH值遠離蛋白質(zhì)等電點pI的情況下，帶有較多電荷數(shù)的蛋白質(zhì)會增強吸附層之間的靜電排斥作用，蛋白質(zhì)趨于折疊化，疏水殘基被掩埋，從而防止乳液絮凝[18-19]。蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液會在蛋白質(zhì)等電點pI附近因界面特性的改變而發(fā)生絮凝。Zhang Shuning等[18]通過對豌豆蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，乳液體系pH值在豌豆蛋白等電點（pH 5.0左右）時，ζ電位為零，在油-水界面處吸附的蛋白質(zhì)聚集而增強了乳液液滴間絮凝。Delahaije等[15]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白乳液在較低ζ電位（即低于臨界ζ電位9 mV）時極易產(chǎn)生絮凝，這是因為pH值向pI 4.4移動，空氣-水界面的表面張力由19.5 mN/m增加到26.2 mN/m，界面蛋白吸附量達到最大，為11.3 mg/m2，乳清蛋白乳液產(chǎn)生顯著絮凝現(xiàn)象。Owens等[20]同樣發(fā)現(xiàn)乳清蛋白乳液在接近pI（pH 5.0）時由于缺乏凈靜電荷乳液，界面蛋白吸附量增大而導(dǎo)致乳液液滴大量絮凝。

1.2.3 離子強度對乳液絮凝的影響

乳液體系中離子強度對乳液絮凝的影響取決于離子濃度和離子化合價。不同類型的離子影響乳液穩(wěn)定性的機制不同，一價離子如K＋、Na＋是通過靜電屏蔽作用導(dǎo)致乳液油滴的絮凝，而二價離子如Ca2＋則通過靜電屏蔽和離子表面吸附的交互作用導(dǎo)致乳液的絮凝現(xiàn)象。二價陽離子比一價陽離子能更有效地誘導(dǎo)凝膠化，因為它們可以特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。

二價離子可通過屏蔽作用降低靜電排斥力或通過與液滴表面上帶相反電荷的基團結(jié)合而導(dǎo)致蛋白質(zhì)乳液絮凝[19]，例如二價陽離子（Ca2＋、Mg2＋等）與蛋白質(zhì)的結(jié)合使乳液絮凝[21]。Ca2＋和蛋白質(zhì)結(jié)合能夠降低分子之間的靜電斥力，促進疏水區(qū)域之間的相互作用，降低能壘，從而影響蛋白質(zhì)在油-水界面的吸附行為和形成乳液的穩(wěn)定性。Ravindran等[22]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白乳液中由于乳清蛋白與Ca2＋的結(jié)合以及靜電屏蔽作用導(dǎo)致分子間靜電排斥力減弱，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)絮凝。Ca2＋含量的增加會降低乳清蛋白的表面電荷數(shù)量，從而降低蛋白之間的靜電排斥力，這種相互作用是由天冬氨酸和谷氨酸的羧酸基團之間鈣介導(dǎo)的橋連引起的，導(dǎo)致各個乳清蛋白分子的交聯(lián)，最終導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性降低[23]。而如果Ca2＋與特定的分子內(nèi)結(jié)合位點牢固結(jié)合，Ca2＋也可以提高所選蛋白的穩(wěn)定性，例如與乳清蛋白中α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）的鈣結(jié)合態(tài)相比，α-La在鈣貧化態(tài)下對Ca2＋的親和力要高得多，Ca2＋的結(jié)合有利于蛋白質(zhì)的折疊，增強了α-La的熱穩(wěn)定性[24]。另外，王耿等[25]指出，若乳化前添加Ca2＋，吸附在油滴表面的蛋白質(zhì)發(fā)生聚集限制了表面蛋白的有效擴散，從而導(dǎo)致液滴產(chǎn)生絮凝[26]，而在乳化后添加Ca2＋，親和Ca2＋基團的暴露使得界面層蛋白質(zhì)-鈣-蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，從而導(dǎo)致乳液絮凝。Ca2＋的存在也能夠使酪蛋白分子間形成“鈣橋”，降低膠束的靜電排斥作用和空間位阻作用，導(dǎo)致酪蛋白穩(wěn)定的乳液產(chǎn)生絮凝[27]。Dickinson等[28]的研究證明酪蛋白穩(wěn)定的乳液對鈣敏感并且超過極限濃度后會發(fā)生絮凝，乳化前Ca2＋的臨界濃度為7 mmol/L，而乳化后Ca2＋的臨界濃度為10 mmol/L。此外，Li Meng等[29]對β-酪蛋白乳液的研究表明因Ca2＋比Mg2＋有更強特異性結(jié)合到磷酸絲氨酸基團上的能力，更易引起乳液中的β-酪蛋白的聚集，從而發(fā)生絮凝。

一價離子的加入會降低乳化液滴表面雙電子層的厚度，通過靜電屏蔽作用減弱粒子之間的靜電排斥，從而影響界面蛋白的吸附特性[30]。一價離子（Na＋等）雖然化合價低于二價離子（Ca2＋等），但研究表明一價離子的添加仍與乳液絮凝顯著相關(guān)，例如盧菊慧[31]對不同NaCl濃度下制備的豌豆蛋白乳液分析發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl的添加，NaCl通過靜電作用屏蔽了蛋白質(zhì)表面的電荷，減弱了蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥作用，阻礙了蛋白質(zhì)吸附到油滴表面及結(jié)構(gòu)重排，導(dǎo)致油滴粒徑大幅增加，乳液絮凝程度加劇。張瀟元等[32]發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl濃度增至0.2 mol/L時，大豆蛋白乳液的平均粒徑達到最大值（193.3 nm），說明NaCl的添加會導(dǎo)致蛋白質(zhì)周圍的雙電子層被破壞，引起乳液出現(xiàn)液滴聚合，進而使得乳液的平均粒徑增大。而張亞珍等[33]發(fā)現(xiàn)不一致的結(jié)果，是由于花生粕分離蛋白的耐NaCl特性，加入NaCl后產(chǎn)生靜電屏蔽效應(yīng)，從而使其疏水性增加，但不會發(fā)生明顯的聚集。

1.2.4 溫度對乳液絮凝的影響

在食品乳液中，蛋白質(zhì)乳液通常會經(jīng)過熱處理以避免微生物影響，從而延長保質(zhì)期。其中，蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液在熱處理后經(jīng)常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性從而影響界面吸附層特性，進而導(dǎo)致乳液絮凝。例如，食品乳液中常用酪蛋白和乳清蛋白作為乳化劑，乳清蛋白乳液經(jīng)熱處理可產(chǎn)生大量二硫鍵連接的聚集體[34-35]，酪蛋白乳液則產(chǎn)生更多疏水作用介導(dǎo)的聚集體[36]。熱處理后的蛋白質(zhì)乳液液滴體積通常會變大，并且液滴的絮凝程度取決于加熱溫度和時間[37]。當(dāng)高于蛋白質(zhì)變性溫度時，未吸附的球狀蛋白質(zhì)展開并與界面蛋白質(zhì)和其他未吸附的蛋白質(zhì)通過疏水相互作用形成較大的絮凝物[38]。例如，在高于65 ℃加熱時乳清蛋白乳液會解開并暴露出以前隱藏的疏水基團[39]，隨后乳清蛋白能夠與自身或κ-酪蛋白相互作用形成熱誘導(dǎo)的蛋白聚集體，從而導(dǎo)致絮凝現(xiàn)象。Ye Aiqian等[40]將乳清蛋白乳液經(jīng)90 ℃熱處理20 min后通過微觀共聚焦發(fā)現(xiàn)加熱后的乳液出現(xiàn)明顯耗散絮凝。而酪蛋白大多數(shù)以球形復(fù)合物（酪蛋白膠束）的形式存在，加熱時易形成凝膠結(jié)構(gòu)[41]，并且加熱的時間和溫度顯著影響與酪蛋白膠束相結(jié)合的α-乳白蛋白/κ-酪蛋白和β-乳球蛋白/κ-酪蛋白的數(shù)量，從而影響乳液的絮凝程度[42]。Li Meng等[29]比較了兩種不同加熱條件下（55 ℃處理20 min與25 ℃處理20 min）β-酪蛋白/Ca2＋穩(wěn)定乳液的絮凝情況，微觀共聚焦和界面蛋白質(zhì)負載分析結(jié)果表明β-酪蛋白/Ca2＋乳液絮凝歸因于β-酪蛋白聚集體間相互作用，且高度依賴于溫度誘導(dǎo)的β-酪蛋白聚集的程度。

2 基于界面行為控制蛋白乳液絮凝的原理及方法

2.1 基于界面行為闡釋蛋白質(zhì)乳液穩(wěn)定機制及分析方法

具有兩親性質(zhì)的蛋白質(zhì)通過在油-水界面的吸附降低界面張力或界面吸附層形成的物理屏障，能有效地抑制乳液絮凝，從而提高乳液的穩(wěn)定性。經(jīng)典的靜電和空間穩(wěn)定理論為抑制乳液絮凝提供了參考。靜電穩(wěn)定指的是由吸附的聚合物層上存在的電荷引起的液滴間排斥，空間穩(wěn)定指的是與吸附在不同液滴上聚合物層的壓縮和重疊相關(guān)的液滴間排斥。蛋白質(zhì)可以與多糖等相互作用形成較厚的界面層，從而增強液滴間的靜電和/或空間斥力[43]，有效抑制乳液絮凝。例如，Klein等[44]使用乳清蛋白-阿拉伯膠混合物增強了乳液空間穩(wěn)定性。Zhao Jingjing等[9]采用甜菜果膠和大豆多糖，運用逐層靜電組裝的方式，吸附的聚合物層通過增強的靜電和空間斥力抑制乳液液滴聚集，提高了乳鐵蛋白乳液的靜電空間穩(wěn)定性[45]。

乳液通常由水相、油相以及油/水界面3 個部分組成，現(xiàn)提出的乳液穩(wěn)定機制主要都基于界面行為理論，而乳化劑間的相互作用顯著影響乳液界面膜的結(jié)構(gòu)、形貌和動態(tài)特性（松弛現(xiàn)象和黏彈性）[46]。了解在油-水界面處吸附的乳化劑靜態(tài)（吸附、結(jié)構(gòu)和形貌等）和動態(tài)（動態(tài)界面張力和界面流變學(xué)）特性是控制食品乳液絮凝的關(guān)鍵因素。粒度儀（測量乳液平均粒徑）、顯微鏡（光學(xué)或激光共聚焦觀察油滴粒徑以及蛋白質(zhì)吸附情況）是分析油-水界面處吸附的蛋白質(zhì)靜態(tài)特性的常用手段。盧菊慧等[47]通過對豌豆蛋白-大豆油乳液的粒徑和絮凝指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白質(zhì)量濃度從1.0 mg/mL增至30.0 mg/mL，乳液的平均粒徑從31.22 μm降至0.84 μm，絮凝指數(shù)從2.54降至0.91，說明乳液中油滴表面逐漸形成緊密的蛋白吸附層，有效抑制了油滴的絮凝和聚集。激光共聚焦則能形象地觀察乳液是否存在絮凝情況，例如Li Junhua等[48]通過激光共聚焦觀察到蛋黃-角叉菜膠乳液存在嚴(yán)重絮凝，而加入NaCl后，乳液絮凝現(xiàn)象明顯減輕。

顯微鏡觀察是研究絮凝最直接的方法，界面流變學(xué)則為檢測乳液的絮凝性質(zhì)和程度提供了強有力的間接方法[49]。油-水界面動態(tài)特性的評價通常采用界面張力和界面流變學(xué)分析。界面張力用于評價乳化劑穩(wěn)定界面的能力，主要有兩種測定方法[50]：一種是用微量天平或毛細管壓力法來量化兩個不混溶相之間界面處的排斥力；另一種方法是分析液滴形狀受界面張力的影響。Silva等[36]通過第二種方法確定了酪蛋白與乳清蛋白質(zhì)量比為1∶1時乳液具有最低界面張力，穩(wěn)定性最高。宮曉玥等[51]使用全自動DropMeterTMProfessional A-200系列光學(xué)張力儀測定待測酪蛋白酸鈉-椰奶乳液體系的界面張力，結(jié)果表明當(dāng)體系中加入適量酪蛋白酸鈉時，油-水界面之間形成的一層致密界面膜可以降低兩相之間的界面張力，保持乳液穩(wěn)定，但當(dāng)濃度較低時，酪蛋白酸鈉不能完全覆蓋油-水界面，導(dǎo)致部分油-水界面的界面張力依然很大，而酪蛋白酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.6%時，油-水界面產(chǎn)生的多層吸附破壞了酪蛋白酸鈉與兩相之間的平衡，從而導(dǎo)致界面張力上升，產(chǎn)生耗散絮凝。界面流變學(xué)則可以監(jiān)測吸附時的界面結(jié)構(gòu)以及界面處不同乳化劑之間的相互作用程度[52]。界面剪切流變反映了分子間橫向相互作用，Murray等[53]發(fā)現(xiàn)食品級表面活性顆粒與蛋白質(zhì)結(jié)合作為表面活性劑時存在協(xié)同效應(yīng)，通過界面剪切流變測量的吸附膜強度顯著增加。通過皂苷和β-乳球蛋白的界面剪切實驗發(fā)現(xiàn)，僅用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%β-乳球蛋白制備的界面層的黏性模量（G′）與彈性模量（G′）之比為0.30，而皂苷/β-乳球蛋白制備的界面層G′與G′之比為0.56，說明皂苷和β-乳球蛋白相互作用形成強黏彈性界面膜[54]。Xiong Wenfei等[55]測定了卵白蛋白/殼聚糖復(fù)合物在pH 5.5時的動態(tài)膨脹彈性模量，結(jié)果表明與僅含卵白蛋白的乳液相比，卵白蛋白/殼聚糖復(fù)合物顯著提高了界面膨脹彈性模量，進一步說明蛋白-多糖間相互作用能夠提高油-水界面吸附層機械強度，是一種有效抑制絮凝的手段。

2.2 蛋白質(zhì)乳液抗絮凝的方法

在實際生產(chǎn)中原料（乳化劑等）和環(huán)境條件（pH值、離子強度、熱處理等）都是影響乳液絮凝的重要因素，針對蛋白乳液的絮凝行為總結(jié)了一些制備高穩(wěn)定性乳液的策略：1）使用足夠的乳化劑使界面完全飽和；2）避免存在大量的非吸附蛋白；3）乳液pH值遠離蛋白等電點pI；4）避免多價離子的存在；5）避免蛋白變性。除了上述策略，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有高靜電和空間穩(wěn)定性的蛋白-多糖或多酚二元及三元復(fù)合物等也可有效地抑制絮凝，提高乳液的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)和多糖或多酚通過非共價作用形成的復(fù)合物主要通過靜電作用、疏水作用、氫鍵和范德華力產(chǎn)生凝聚層，增強靜電穩(wěn)定性。例如，殼聚糖與蠶豆蛋白的逐層組裝形成了逐層界面結(jié)構(gòu)，增加了界面層厚度/致密性并保持了界面蛋白質(zhì)的吸附，從而改善了乳液物理穩(wěn)定性，抑制了絮凝的產(chǎn)生[56]。而與蛋白質(zhì)共價連接的碳水化合物嵌段或多酚的酚羥基則延伸至連續(xù)相，從而提供額外的空間排斥力，在油-水界面形成空間屏障以抑制乳液絮凝。

2.2.1 蛋白-多糖復(fù)合物的抗絮凝機制及應(yīng)用

在乳化過程中，蛋白質(zhì)和多糖通過在油-水界面形成穩(wěn)固的界面膜防止液滴聚集從而穩(wěn)定乳液。蛋白-多糖復(fù)合物目前可分為3 類[57]：1）天然存在的復(fù)合物，其中蛋白質(zhì)殘基與多糖鏈共價連接，例如阿拉伯膠；2）通過多糖的還原端與蛋白質(zhì)上的氨基相互作用產(chǎn)生共價鍵而形成，主要有美拉德反應(yīng)和酶促反應(yīng)兩種途徑；3）多糖和具有相反凈電荷的蛋白質(zhì)之間形成的靜電復(fù)合物。由蛋白質(zhì)-多糖通過靜電相互作用穩(wěn)定的乳液主要依靠兩種方式形成，傳統(tǒng)上使用預(yù)混合的凝聚層制備乳液（圖2A），例如Klein等[44]用乳清蛋白和阿拉伯膠預(yù)混合的凝聚層穩(wěn)定乳液，而另一種方法是多層組裝法（圖2B），即多糖吸附到蛋白質(zhì)層上形成雙層，吸附的聚合物層通過增強的空間斥力抑制乳液液滴聚集[45]。蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物非共價結(jié)合的兩種途徑如圖2所示[58]。而蛋白質(zhì)和多糖共價交聯(lián)形成的共軛物具有較強的乳化性，能吸附在油-水界面形成空間屏障以防止乳液絮凝，改善乳液液滴的空間穩(wěn)定性，例如小麥蛋白和葡聚糖共軛物增加了界面吸附層的有效厚度，增強了空間斥力，提高了乳液穩(wěn)定性[59]。不同的蛋白質(zhì)和多糖可以通過不同的作用途徑改善蛋白質(zhì)的功能特性（表1），從而有效控制乳液絮凝，提高乳液穩(wěn)定性。

圖2 蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物非共價結(jié)合的兩種途徑[58]Fig. 2 Two methods of noncovalent binding between proteinpolysaccharide complexes[58]

表1 不同蛋白和多糖間相互作用方式及功能特性Table 1 Interaction and functional properties of complexes formed between different proteins and polysaccharides

2.2.2 蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的抗絮凝機制及應(yīng)用

蛋白質(zhì)與多酚間的研究主要集中在二者的結(jié)合機理及二者復(fù)合后對蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響等方面。蛋白和多酚間相互作用有共價和非共價作用[64]。多酚與蛋白通常通過氫鍵（酚羥基和蛋白的C＝O基團）、疏水作用（疏水性氨基酸與多酚的非極性芳香環(huán)相互作用）、離子相互作用（帶正電荷的蛋白質(zhì)基團如賴氨酸的ε-氨基與多酚帶負電荷的羥基反應(yīng)）和范德華力等非共價作用發(fā)生可逆性結(jié)合。Shpigelman等[65]研究發(fā)現(xiàn)兒茶素與β-乳球蛋白通過疏水相互作用和氫鍵進行結(jié)合。多酚還可與蛋白質(zhì)通過共價鍵發(fā)生不可逆結(jié)合形成共軛物。

近年來，蛋白質(zhì)-多酚共軛物作為新型乳化劑被廣泛用于改善食品乳液的穩(wěn)定性。多酚和蛋白的結(jié)合改善了蛋白的熱穩(wěn)定性，例如，乳鐵蛋白通過自由基介導(dǎo)的方法與兒茶素、綠原酸或沒食子酸接枝后，乳鐵蛋白的熔融溫度Tm升高了5～15.2 ℃[66]。牛奶蛋白和兒茶素的共軛物也顯示出較低的表面疏水性和升高的Tm以及界面吸附行為的增強，從而抑制了乳液絮凝[67]。蛋白質(zhì)-多酚共軛物具有改善的界面特性，可以有效地吸附在油滴的表面，并能夠通過空間位阻和靜電排斥作用使液滴穩(wěn)定，避免產(chǎn)生絮凝[68]，如β-乳球蛋白和兒茶素共價結(jié)合制備的共軛物比單獨的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更優(yōu)異的界面特性，能更有效地抑制水包油型乳液絮凝[69]。

2.2.3 蛋白質(zhì)-多酚-多糖復(fù)合物的抗絮凝機制及應(yīng)用

蛋白質(zhì)-多酚二元復(fù)合物雖然可以改善熱穩(wěn)定性和界面吸附特性，但有部分蛋白質(zhì)和多酚復(fù)合后一定程度上降低了熱穩(wěn)定性和界面特性，如卵清蛋白和兒茶素接枝反應(yīng)后Tm顯著降低，蛋白質(zhì)二級構(gòu)象穩(wěn)定性下降[70]，而蛋白質(zhì)-多酚-多糖三元復(fù)合物則表現(xiàn)出比純蛋白質(zhì)或二元復(fù)合物更優(yōu)異的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)-多糖-多酚三元共軛物通?？梢允褂妹福ㄆ崦福71]或化學(xué)試劑（碳二亞胺）制備[72]，還可以通過堿處理和美拉德反應(yīng)制備（圖3）[73]。蛋白質(zhì)-多糖-多酚三元共軛物比二元共軛物能更有效提高熱穩(wěn)定性，Liu Fuguo等[73]通過差示掃描量熱法發(fā)現(xiàn)綠原酸-乳鐵蛋白-葡聚糖三元綴合物的熱變性溫度高于純?nèi)殍F蛋白及二元綴合物（乳鐵蛋白-綠原酸和乳鐵蛋白-葡聚糖）。此外，β-乳球蛋白-兒茶素-果膠三元復(fù)合物具有優(yōu)異的界面特性，在界面所形成的膜具有更高的彈性，其表面膨脹模量約為60 Pa，顯著高于β-乳球蛋白的表面膨脹模量（45 Pa）[74]。另外，Zhao Yue等[75]研究發(fā)現(xiàn)多酚的添加使得維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵被破壞，β-折疊含量的減少導(dǎo)致疏水基團暴露，而陰離子多糖的添加所形成的三元復(fù)合物中蛋白質(zhì)的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能性提高，三元復(fù)合物乳液如大豆分離蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯-果膠（－20.5 mV）和大豆分離蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯-羧甲基纖維素的ζ電位（－21.2 mV）絕對值要高于二元復(fù)合乳液大豆分離蛋白-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（－18.03 mV），且三元復(fù)合物乳化性能增強，表現(xiàn)出更優(yōu)異的抑制乳液絮凝的能力。多糖因結(jié)構(gòu)不同而分為離子型多糖和中性多糖，它們對蛋白質(zhì)和多酚相互作用的影響程度不同[76]。離子多糖能夠與蛋白質(zhì)和多酚形成“蛋白質(zhì)-多酚-多糖三元復(fù)合物”，其中離子多糖主要通過增加復(fù)合物的水溶性或是通過削弱蛋白和多酚間的相互作用而抑制不溶性聚集物的產(chǎn)生，但中性多糖如瓜爾豆膠等不能有效抑制蛋白質(zhì)和多酚的聚集，從而導(dǎo)致乳液穩(wěn)定性下降。原料的添加順序能夠直接影響蛋白、多酚和多糖形成的三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特性，從而影響乳液的穩(wěn)定性，例如Yang Jie等[77]發(fā)現(xiàn)，以乳鐵蛋白、兒茶素和果膠為原料采用3 種添加順序自組裝構(gòu)建3 種結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、多酚和多糖三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、濁度、流變特性和物理化學(xué)穩(wěn)定性有顯著差異，其中乳鐵蛋白-兒茶素-果膠復(fù)合物能有效抑制乳液絮凝。

圖3 綠原酸-乳鐵蛋白、綠原酸-乳鐵蛋白-葡聚糖反應(yīng)機理[73]Fig. 3 Reaction mechanism between chlorogenic acid and lactoferrin,and between chlorogenic acid-lactoferrin conjugate and dextran[73]

3 結(jié) 語

絮凝現(xiàn)象嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的感官品質(zhì)并引起質(zhì)量問題，而界面吸附層特性是影響蛋白質(zhì)乳液絮凝的最主要因素。蛋白質(zhì)在油-水界面吸附層易受自身結(jié)構(gòu)、形態(tài)以及環(huán)境pH值、離子強度和溫度等的影響而產(chǎn)生乳液絮凝等失穩(wěn)現(xiàn)象。通過對界面吸附層上的乳化劑靜態(tài)動態(tài)特性的分析可為優(yōu)化乳液形成并提高乳液穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。近年來，蛋白質(zhì)與多糖、多酚形成的二元及三元復(fù)合物用于穩(wěn)定乳液的研究較多，復(fù)合物通常通過優(yōu)化蛋白質(zhì)界面吸附層的特性而增強空間斥力并抑制乳液絮凝，但蛋白質(zhì)和多糖或多酚不同的結(jié)構(gòu)特性和復(fù)合方式會對這些二元及三元復(fù)合物乳化性能產(chǎn)生較大影響，未來可借助界面探測等技術(shù)進一步探究新型蛋白質(zhì)和其他乳化劑的復(fù)合特性及其機制，以期得到更穩(wěn)定的復(fù)合物。此外，還可以通過界面行為學(xué)分析建立乳液絮凝程度預(yù)測模型。