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    姜黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)血小板凋亡的抑制作用及分子機(jī)制

    2021-07-29 03:27:00牙甫禮XINYu張春梅陳彬林李瑋琪馬永潔
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:姜黃孵育活化

    牙甫禮,XIN Yu,張春梅,陳彬林,李瑋琪,馬永潔

    (1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所,云南 大理 671000;2.大理大學(xué)代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,云南 大理 671000;3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000;4.河口海關(guān),云南 河口 661300;5.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院營(yíng)養(yǎng)科,廣西 南寧 530000)

    心血管疾?。╟ardiovascular diseases,CVDs)的發(fā)病率和死亡率逐年上升,嚴(yán)重威脅人民的健康,動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成是CVDs致死的主要原因[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,近年來大量報(bào)道證明了血小板凋亡在其中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[3-4]。在某些CVDs患者的外周血中,機(jī)體高水平的氧化應(yīng)激(如活性氧(reactive oxygen species,ROS)和超氧化物水平)等因素可促使血小板發(fā)生線粒體凋亡[5-6]。在血小板發(fā)生線粒體凋亡的過程中,Bcl-2家族的抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL等)和促凋亡蛋白(Bax和Bak等)在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中重新分布,能夠引起血小板線粒體膜電位(ΔΨm)發(fā)生去極化和線粒體通透轉(zhuǎn)換孔的形成,繼而導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放增多,并激活Caspase-9和Caspase-3,引起細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)暴露,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。鑒于血小板凋亡在CVDs中的重要作用,抑制血小板凋亡極有可能成為防治CVDs的重要途徑之一。

    營(yíng)養(yǎng)膳食干預(yù)在CVDs的早期防治中一直起著重要的作用[8-9]。姜黃素(curcumin,Cur)是存在于姜科植物根莖中的一種多酚類化合物,也是香料姜黃中最重要的組成成分[10-11]。研究表明,Cur具有多種生物學(xué)活性,如在CVDs防治方面,Cur可改善糖脂代謝紊亂、抑制動(dòng)脈斑塊和血栓形成等[12-13]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Cur可抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板聚集和活化[14]。對(duì)于Cur調(diào)控細(xì)胞凋亡方面,大部分的研究主要集中在探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[15-16],但是Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡是否起調(diào)控作用尚鮮見報(bào)道。因此,鑒于血小板凋亡在CVDs發(fā)生發(fā)展中的重要作用,本研究主要通過體外實(shí)驗(yàn)來探討Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的健康人血小板凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    ROS檢測(cè)試劑盒、超氧化物檢測(cè)試劑盒 英國(guó)Abcam公司;Cur粉末、H2O2美國(guó)Sigma-Aldrich公司;一抗Bax、Bak、細(xì)胞色素c、β-actin以及相應(yīng)的二抗 美國(guó)CST公司;5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(JC-1) 美國(guó)Enzo Life Sciences公司;Caspase-3和Caspase-9活力檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司;PE-Annexin V檢測(cè)試劑盒 美國(guó)eBioscience公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CytoFlex流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman Coulter公司;BCD-4.8.5低溫冰箱 中國(guó)青島海爾有限公司;POLARstar OPTIMA多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG Labtech公司;低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

    1.3 方法

    1.3.1 研究對(duì)象篩選

    從大理大學(xué)校內(nèi)招募到15 名符合條件的健康志愿者(25~40 歲)。在志愿者篩選的過程中,志愿者出現(xiàn)以下至少一種情況將給予排除:現(xiàn)在或曾經(jīng)患有CVDs、免疫缺陷、惡性腫瘤等疾病;酗酒、吸煙、濫用藥物半年以上;在至少兩周內(nèi)未服用任何抗血小板的藥物,且近半年內(nèi)未服用維生素等膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[17]。

    1.3.2 健康人血樣及純化血小板的制備

    本研究完全按照《赫爾辛基宣言》人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則進(jìn)行,在實(shí)施前,每個(gè)志愿者均已簽署知情同意書,且該研究已通過大理大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下,抽取健康志愿者靜脈血15 mL,注入含枸櫞酸鈉的真空抗凝管中,然后在22 ℃、300×g離心7 min,小心吸取上清液,可得到富血小板血漿,并將其保存在37 ℃恒溫孵育箱中備用。純化血小板的制備過程采用本實(shí)驗(yàn)室成熟的分離方法,具體方法參照文獻(xiàn)[17-18]。

    1.3.3 Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響

    采用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性影響的測(cè)定。用不同濃度(1、5、10、20、40、80、100、120、150、200 μmol/L)的Cur、溶劑對(duì)照(體積分?jǐn)?shù)為0.05%的DMSO,即對(duì)照組)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate,SDS)分別與健康人純化血小板共同孵育30 min,然后22 ℃、12 000×g離心5 min,利用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度,并以吸光度表征LDH的含量。實(shí)驗(yàn)過程中,將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS作為陽性組,用來刺激血小板釋放全部LDH(即血小板LDH總量)。血小板LDH漏出率按下式計(jì)算[17]。

    1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組

    血小板功能調(diào)控實(shí)驗(yàn)分組包括靜息組:不經(jīng)任何處理(既不經(jīng)H2O2激活,也不經(jīng)DMSO處理)的血小板懸液;對(duì)照組:即溶劑對(duì)照組,因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中,Cur粉末用DMSO溶解,所以對(duì)照組血小板中僅加入體積分?jǐn)?shù)0.05%的DMSO;Cur組:分為3 個(gè)濃度梯度,分別為Cur(1 μmol/L)、Cur(10 μmol/L)和Cur(100 μmol/L);其中對(duì)照組和Cur組均經(jīng)H2O2(100 μmol/L)刺激。

    1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板線粒體膜電位

    用不同濃度(1、10、100 μmol/L)的Cur與純化血小板在體外共同孵育30 min后,12 000×g離心5 min,棄上清液,重懸血小板,加入H2O2(100 μmol/L)繼續(xù)孵育60 min,孵育完成后,將純化血小板懸液(1×106個(gè)/mL)加入流式上樣管中,并加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的JC-1工作液,并迅速?gòu)梽?,在室溫下避光孵?0 min后加入磷酸鹽緩沖液,立即使用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm水平[18]。用JC-1單體相對(duì)含量來表示血小板ΔΨm去極化水平,以此衡量細(xì)胞凋亡程度。

    1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面PS暴露水平

    將經(jīng)不同濃度的Cur(1、10、100 μmol/L)和H2O2(100 μmol/L)干預(yù)的血小板懸液(1×106個(gè)/mL)以每管50 μL的體積加入流式上樣管中,同時(shí)避光加入終質(zhì)量濃度為1 mmol/L的CaCl2溶液以及2.5 μL的Annexin V抗體,混勻后避光孵育15 min,加入終止液,在30 min內(nèi)用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面PS的暴露水平,并使用CytExpert 2.0軟件分析結(jié)果[18]。

    1.3.7 血小板Caspase-3和Caspase-9活化水平的測(cè)定

    血小板Caspase-3和Caspase-9的活化水平按照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。將不同濃度的Cur或溶劑對(duì)照與健康成人純化血小板在體外共同孵育30 min后,12 000×g離心5 min,棄上清液,重懸血小板,加入H2O2(100 μmol/L)繼續(xù)孵育60 min,孵育完成后,加入相應(yīng)的底物,室溫下避光孵育30 min后,在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm的條件下讀取熒光值,用來反映細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活化水平。檢測(cè)Caspase-9的活化水平時(shí),將處理好的純化血小板在4 ℃、12 000×g下離心5 min,對(duì)血小板沉淀進(jìn)行冰浴裂解15 min后,收取上清液,測(cè)定蛋白濃度后加入Ac-LEHD-pNA,并于37 ℃孵育60 min,然后在405 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度的測(cè)定,用來反映Caspase-9的活化水平。

    1.3.8 血小板總ROS和超氧化物生成水平的測(cè)定

    將不同濃度的Cur或溶劑對(duì)照與健康人純化血小板(1×106個(gè)/mL)共同孵育30 min,12 000×g離心5 min,棄上清液后,重懸血小板,加入H2O2(100 μmol/L)繼續(xù)孵育60 min,各個(gè)組吸取80 μL的血小板懸液至新的離心管中,然后加入10 μL的氧化應(yīng)激檢測(cè)液(20 μmol/L)和10 μL的超氧化物檢測(cè)試劑液(20 μmol/L),避光孵育,然后在4 ℃、12 000×g離心5 min,棄上清后重懸血小板,再次在4 ℃、12 000×g離心5 min,然后用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)潤(rùn)洗血小板3 次,最后在激發(fā)波長(zhǎng)490 nm和發(fā)射波長(zhǎng)525 nm條件下讀取熒光強(qiáng)度,以反映胞內(nèi)總ROS水平,在激發(fā)波長(zhǎng)550 nm和發(fā)射波長(zhǎng)620 nm條件下讀取熒光強(qiáng)度,以反映超氧化物水平[17]。

    1.3.9 Western blot蛋白免疫印跡分析

    經(jīng)Cur和H2O2處理后,將純化血小板懸液4 ℃、10 000×g離心15 min,收集血小板沉淀,冰上裂解30 min,再次4 ℃、10 000×g離心15 min后收集上清得到血小板蛋白,并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜并分別加入一抗(Bax、Bak、細(xì)胞色素c和β-actin)和相應(yīng)的二抗后,對(duì)條帶進(jìn)行曝光,其灰度則用Quantity One分析軟件進(jìn)行計(jì)算分析[17-19]。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組間兩兩比較,采用單因素方差分析,雙側(cè)P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響

    如圖1所示,用不同濃度的Cur干預(yù)血小板后,與對(duì)照組(體積分?jǐn)?shù)0.05% DMSO)相比,Cur濃度在1~120 μmol/L范圍內(nèi),各組LDH漏出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但均顯著低于10% SDS組(P<0.05);而Cur濃度為150、200 μmol/L時(shí),其LDH漏出率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),因此可以認(rèn)為在1~120 μmol/L的濃度范圍內(nèi),Cur對(duì)健康人純化血小板無明顯的細(xì)胞毒性作用。另外,結(jié)合其他文獻(xiàn)報(bào)道中所用的Cur濃度[20],本實(shí)驗(yàn)最終選擇1、10 μmol/L和100 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖1 Cur對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響Fig. 1 Cytotoxic effect of Cur on platelets

    2.2 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化和PS暴露水平的影響

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,H2O2刺激后,與靜息組血小板相比,血小板JC-1單體相對(duì)含量明顯提高,如圖2A所示。說明H2O2可促進(jìn)血小板ΔΨm去極化,血小板發(fā)生凋亡。而經(jīng)不同濃度的Cur干預(yù)后,Cur組與對(duì)照組相比,JC-1單體相對(duì)含量顯著降低(P<0.05),但是不同濃度Cur組之間相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化;同時(shí),如圖2B所示,10 μmol/L和100 μmol/L的Cur可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的血小板表面PS暴露水平(P<0.05),相對(duì)于1 μmol/L的Cur,100 μmol/L組對(duì)PS暴露的降低作用更顯著(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一定濃度的Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡。

    圖2 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板ΔΨm去極化(A)和PS暴露水平(B)的影響Fig. 2 Effect of Cur on H2O2-induced platelet ΔΨm depolarization (A)and PS exposure (B)

    2.3 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9和Caspase-3活化的影響

    如圖3所示,與對(duì)照組相比,10 μmol/L和100 μmol/L的Cur均可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9和Caspase-3活化(P<0.05),但是低濃度(1 μmol/L)的Cur并不能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9和Caspase-3活化(P>0.05);此外,100 μmol/L的Cur相對(duì)于1 μmol/L的Cur,對(duì)血小板Caspase-9和Caspase-3活化的抑制作用更為顯著(P<0.05)。

    圖3 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板Caspase-9(A)和Caspase-3(B)活化水平的影響Fig. 3 Effect of Cur on H2O2-induced platelet caspase-9 (A) and caspase-3 (B) activation level

    2.4 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    如圖4A、B所示,H2O2可明顯上調(diào)血小板Bax和Bak的相對(duì)表達(dá)量,10 μmol/L和100 μmol/L的Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的Bax相對(duì)表達(dá)量提升(P<0.05),各Cur組間相比,100 μmol/L相對(duì)于1 μmol/L的Cur對(duì)Bax表達(dá)的抑制作用更為顯著(P<0.05)。只有100 μmol/L的Cur可顯著抑制Bak的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05);10 μmol/L和100 μmol/L兩組間相比,對(duì)Bak表達(dá)的抑制作用也存在顯著差異(P<0.05)。如圖4C所示,Western blot分析結(jié)果表明,H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞色素c蛋白相對(duì)表達(dá)量可被10 μmol/L和100 μmol/L的Cur顯著下調(diào)(P<0.05),各Cur組間的比較結(jié)果與Bak比較結(jié)果一致。

    圖4 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板Bax(A)、Bak(B)和細(xì)胞色素c(C)表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of Cur on the expression of Bax (A), Bak (B) and cytochrome c (C) in H2O2-induced platelets

    2.5 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板氧化應(yīng)激水平的影響

    如圖5A、B所示,H2O2刺激血小板后,胞內(nèi)總ROS水平和超氧化物水平較靜息組血小板明顯升高,經(jīng)不同濃度的Cur干預(yù)后,10 μmol/L和100 μmol/L的Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板內(nèi)ROS水平和超氧化物生成(P<0.05),通過對(duì)各Cur組間進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)各組間無顯著劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果說明,Cur可顯著降低H2O2誘導(dǎo)的血小板氧化應(yīng)激水平。

    圖5 Cur對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血小板總ROS水平(A)和超氧化物生成水平(B)的影響Fig. 5 Effect of Cur on total ROS (A) and superoxide generation (B) in H2O2-induced platelets

    3 討 論

    大量的研究表明,血小板凋亡參與多種CVDs的發(fā)生和發(fā)展過程,例如在高脂血癥、糖尿病、心肌梗死等疾病中,高水平的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)血小板發(fā)生凋亡,進(jìn)而加速血栓的形成[5]。血小板凋亡后可釋放大量的血小板微粒(platelet-derived microparticles,PMPs),近年來大量的研究已經(jīng)證實(shí)了循環(huán)中的PMPs是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化以及血栓形成進(jìn)而加速CVDs發(fā)生發(fā)展最重要的因素之一[21-23]。主要原因是PMPs表面的PS具有很強(qiáng)的促凝血功能,通過增加促凝活性,進(jìn)而促進(jìn)凝血酶的生成與釋放,從而加速血栓的形成和發(fā)展[22,24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板凋亡,更重要的是,可抑制血小板表面PS的暴露水平,這很有可能是Cur防治CVDs中血栓形成和發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。然而,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,膳食補(bǔ)充Cur對(duì)血小板凋亡以及PMPs產(chǎn)生是否有影響則需要進(jìn)一步證實(shí)。另外,大量的研究表明,血小板內(nèi)源性凋亡通路對(duì)于介導(dǎo)CVDs中血小板凋亡起主要作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn),Cur能夠抑制內(nèi)源性凋亡通路,例如抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板Bax、Bak和細(xì)胞色素c的表達(dá),并抑制ΔΨm發(fā)生去極化,進(jìn)而抑制Caspase-9和Caspase-3的活化,最終抑制血小板凋亡。但是Cur是否作用于血小板外源性凋亡通路及其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。此外,研究表明,凋亡的血小板在形態(tài)上表現(xiàn)為質(zhì)膜起泡、偽足延伸以及細(xì)胞體積收縮等[7],而Cur對(duì)血小板凋亡過程中形態(tài)學(xué)的影響需要更深一步的研究和探討。

    在CVDs中,盡管調(diào)控血小板凋亡的機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的,但是大多數(shù)研究認(rèn)為氧化應(yīng)激對(duì)于調(diào)控血小板凋亡起關(guān)鍵作用[5,25]。例如在糖尿病患者中,血小板凋亡水平提高,與其細(xì)胞內(nèi)過量的ROS密切相關(guān)[26];體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),H2O2可直接促進(jìn)血小板凋亡[27]。本研究發(fā)現(xiàn),Cur可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的血小板內(nèi)總ROS水平和超氧化物生成,這可能是Cur抑制H2O2誘導(dǎo)血小板凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。大量的研究也證實(shí),Cur具有較強(qiáng)的抗氧化能力,這也是Cur發(fā)揮防治CVDs的重要機(jī)制之一[28-29]。然而,在本研究中,Cur經(jīng)抑制氧化應(yīng)激調(diào)控血小板凋亡的機(jī)制尚不清楚,仍需要進(jìn)一步探討。另外,研究表明,在某些CVDs狀態(tài)下,機(jī)體外周血中可檢測(cè)到的H2O2濃度范圍為5~200 μmol/L,因此本研究選擇的H2O2濃度為100 μmol/L,與其他文獻(xiàn)報(bào)道的用于刺激血小板的H2O2濃度相一致[27]。

    中藥材姜黃中的有效成分很多,其中Cur、去甲氧基姜黃素和二去甲氧基姜黃素對(duì)血小板凋亡的作用是不一樣的,例如Cur和去甲氧基姜黃素不影響靜息的血小板凋亡,而二去甲氧基姜黃素可顯著促進(jìn)靜息的血小板凋亡[30]。說明Cur類化合物的生物活性可能具有多樣性,而且其中各成分的藥理作用可能不盡相同。Cur作為膳食補(bǔ)充劑在CVDs中發(fā)揮重要作用[31-33],咖喱中富含Cur,日常生活中經(jīng)常食用咖喱的人群,Cur日攝入量可達(dá)260 mg,并且膳食補(bǔ)充Cur的安全劑量也是相對(duì)較高的,研究表明,健康成人每日攝入10 g的Cur也未觀察到毒副作用[34]。本研究所用的Cur濃度范圍為1~100 μmol/L,與其他報(bào)道的體外研究中所使用的Cur濃度相近[20]。值得注意的是,盡管有研究表明Cur具有防治多種慢性病的作用,但是通過膳食補(bǔ)充Cur,其生物利用度很低,這是Cur在臨床上使用受限的最主要因素。大量研究表明,膳食攝入Cur后,發(fā)揮對(duì)健康有益作用的物質(zhì)極有可能是其腸道代謝物[10]。有研究表明,代謝物四氫姜黃素具有吸收性好、活性強(qiáng)等特點(diǎn),因此在有些疾病的防治中可能比Cur具有更大的使用價(jià)值[34]。目前學(xué)者們也不斷研發(fā)出新的技術(shù)以提高Cur的生物利用度和穩(wěn)定性,如采用納米粒子或者脂質(zhì)體與Cur結(jié)合可大大提高Cur的生物利用度和生物活性[10]。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Cur具有抑制H2O2誘導(dǎo)血小板凋亡的作用,但是膳食補(bǔ)充Cur對(duì)血小板凋亡的調(diào)控作用仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探討。綜上,本研究從營(yíng)養(yǎng)膳食或從功能食品途徑為Cur防治CVDs提供了一定的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。

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