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    外源γ-氨基丁酸對(duì)發(fā)芽大豆酚類物質(zhì)富集及抗氧化能力的影響

    2021-07-29 03:26:50丁羽萱姚羿安李皖梅顧振新楊潤(rùn)強(qiáng)
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:總酚酚酸外源

    丁羽萱,王 堯,姚羿安,李皖梅,王 冕,王 沛,顧振新,楊潤(rùn)強(qiáng)

    (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

    種子萌發(fā)涉及一系列形態(tài)和生理生化的變化。研究表明,大豆萌發(fā)能夠富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)[1]、總酚[2]、總黃酮[3]、異黃酮[4]等成熟大豆籽粒中含量低或不含有的功能成分。其中GABA是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸,最初發(fā)現(xiàn)GABA對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)具有普遍抑制作用[1]。同時(shí),GABA對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響[5],植物在受到冷刺激、缺氧和機(jī)械刺激時(shí)會(huì)大量積累GABA以響應(yīng)生物或非生物的脅迫。

    酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)廣泛存在的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物,是植物抗氧化系統(tǒng)的重要組成成分[6],在逆境脅迫下,植物受到氧化損傷導(dǎo)致酚類物質(zhì)的積累。研究證明,GABA與植物的抗氧化系統(tǒng)之間存在一定關(guān)系。外源GABA處理能顯著提高NaCl脅迫番茄幼苗葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)活力,最高可分別比NaCl處理組提高6.1%、41.3%和72.9%,且外源GABA處理顯著降低了NaCl處理造成的葉片和根系內(nèi)超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,表明外源GABA能夠減輕鹽脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化傷害[7]。李敬蕊等[8]研究表明,外源施加GABA能提高低氧脅迫下CmSOD、CmPOD1、CmPOD2、CmCAT和CmAPX基因的表達(dá)量,而這些基因與抗氧化酶活性密切相關(guān)。外源GABA能促進(jìn)蕓苔屬植物根系吸收和利用土壤硝酸鹽,說(shuō)明GABA可能作為上游信號(hào)分子在植物體內(nèi)起關(guān)鍵作用[9]。Shi Shengqing等[10]在鹽脅迫下用GABA處理錦雞兒根部,發(fā)現(xiàn)外源GABA能激活體內(nèi)信號(hào)傳遞、蛋白質(zhì)降解調(diào)控、激素合成、活性氧的形成和多胺代謝等多重生理生化反應(yīng),進(jìn)一步證明GABA能作為一種上游生物信號(hào)分子,參與植物體內(nèi)與鹽脅迫相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控。

    可見,GABA對(duì)植物生長(zhǎng)和抗逆能力有重要作用。作為植物抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)的大量累積可能受到GABA的調(diào)節(jié)。因此,本實(shí)驗(yàn)擬通過研究外源添加GABA對(duì)發(fā)芽大豆酚類物質(zhì)富集的影響,以明確GABA在酚類富集中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大豆(品種為‘云鶴’)籽粒購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,置于-20 ℃冰柜保藏待用。千粒質(zhì)量為(161.6±0.8)g。

    GABA購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;福林-酚試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BX801發(fā)芽機(jī) 永康市貝欣五金電器廠;755B型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;PYX-DHS-BS型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;冷凍離心機(jī) 上海市安亭科學(xué)儀器廠;LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司;DZF-6020型真空干燥器 上海一恒科技有限公司;818型pH測(cè)量?jī)x 美國(guó)Orion Research公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;WH-3微型旋渦混合儀 上海滬析分析儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 大豆籽粒預(yù)處理

    稱取適量顆粒飽滿、大小均勻的大豆籽粒,經(jīng)去離子水沖洗后,置于體積分?jǐn)?shù)0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡消毒15 min,然后用蒸餾水沖洗至pH 7.0左右,置于30 ℃水浴鍋中用去離子水以液料比5∶1浸泡6 h。浸泡后的大豆均勻攤于發(fā)芽機(jī)的苗盤上,置于30 ℃培養(yǎng)箱中黑暗發(fā)芽。分別配制2.5、5、10、20 mmol/L GABA溶液作為培養(yǎng)液,以去離子水為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。處理過程中,每24 h更換培養(yǎng)液,發(fā)芽時(shí)長(zhǎng)4 d,測(cè)定發(fā)芽大豆生長(zhǎng)指標(biāo)(芽長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量)、總酚含量、酚酸含量及抗氧化指標(biāo)。

    1.3.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

    大豆芽長(zhǎng)的測(cè)定:隨機(jī)選取30 株發(fā)芽大豆,用游標(biāo)卡尺測(cè)定其芽長(zhǎng),以所測(cè)30 株發(fā)芽大豆芽長(zhǎng)平均值表示。大豆鮮質(zhì)量的測(cè)定:隨機(jī)選取10 株發(fā)芽大豆,用吸水紙吸干表面水分,稱量并記錄每10 株發(fā)芽大豆的鮮質(zhì)量,精確到0.001 g。干質(zhì)量的測(cè)定:隨機(jī)選取10 株發(fā)芽大豆,用吸水紙吸干表面水分,冷凍干燥,稱量并記錄每10 株發(fā)芽大豆的干質(zhì)量,精確到0.001 g。

    1.3.3 游離酚提取

    參考Chen Zhijie等[11]的方法。發(fā)芽大豆冷凍干燥后研磨粉碎,過40 目篩。取2 g發(fā)芽大豆粉用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液提取3 次(每次20 mL),在振蕩器上200 r/min振蕩1 h,25 ℃下充氮?dú)獗芄馓崛。缓笤谝?0 000 r/min、4 ℃離心15 min,離心后提取液合并過濾,在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干,用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作為游離酚提取液,充氮?dú)夂笾糜冢?0 ℃,供分析用。

    1.3.4 結(jié)合酚提取

    參考Chen Zhijie等[11]的方法。提取游離酚后的殘余物用40 mL 2 mol/L NaOH溶液水解,混合物200 r/min條件下振蕩水解4 h,25 ℃下充氮?dú)獗芄馓崛?,水解液? mmol/L HCl溶液調(diào)整pH值至1.5~2.0之間,取50 mL乙酸乙酯與水解液充分混合15 min后,靜置5 min,然后混合液在10 000 r/min、4 ℃下離心5 min,取上層乙酸乙酯層,重復(fù)上述操作3 次,合并乙酸乙酯層,于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干,用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL,作為結(jié)合酚提取液,充氮?dú)夂笾糜冢?0 ℃,供分析用。

    1.3.5 總酚含量測(cè)定

    采用福林-酚比色法[12]測(cè)定總酚含量。分別取上述游離酚和結(jié)合酚提取液200 μL(根據(jù)濃度適當(dāng)稀釋),加入1.5 mL 10 倍體積稀釋的福林-酚試劑,漩渦振蕩后靜置5 min,然后加入1.5 mL 75 g/L Na2CO3溶液混勻,置于室溫下暗處反應(yīng)2 h,在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液代替提取液作為空白對(duì)照。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,游離酚和結(jié)合酚含量以每克干質(zhì)量樣品中沒食子酸的質(zhì)量計(jì),單位為mg/g。游離酚或結(jié)合酚含量按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

    式中:ω為游離酚或結(jié)合酚含量/(mg/g);ρ為沒食子酸質(zhì)量濃度/(μg/mL);V為提取液體積/mL;N為稀釋倍數(shù);m為取樣量/g。

    大豆芽菜的總酚含量為各處理?xiàng)l件下所測(cè)得游離酚和結(jié)合酚含量之和,單位為mg/g。

    1.3.6 酚酸含量測(cè)定

    采用高效液相色譜法[12]測(cè)定酚酸含量。分別取20 μL 1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)提取液,經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾后采用高效液相色譜(以外標(biāo)法定量)進(jìn)行分析。采用LC-20A高效液相色譜,配備C18110A(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱,高效液相色譜條件:流速為0.9 mL/min,流動(dòng)相A溶液為0.1%的醋酸溶液,流動(dòng)相B為0.1%的醋酸-甲醇溶液,分離時(shí)間55 min,柱溫35 ℃,測(cè)定波長(zhǎng)280 nm。流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

    表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure of high performance liquid chromatography

    1.3.7 抗氧化能力測(cè)定

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力參照Chen Zhijie等[13]的方法。分別取上述游離酚和結(jié)合酚提取液200 μL(以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液適當(dāng)稀釋),加入3.8 mL DPPH溶液,漩渦后置于室溫下暗處反應(yīng)1 h,在515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液代替各提取液作為空白組測(cè)定吸光度Acontrol。DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算。以不同濃度Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(配制不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定其在515 nm波長(zhǎng)處吸光度,以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2≥0.99),DPPH自由基清除能力以每克干質(zhì)量樣品反應(yīng)生成Trolox的物質(zhì)的量計(jì),單位為μmol/g。

    式中:A為樣品組的吸光度;Acontrol為空白組的吸光度。

    2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(2-2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽(yáng)離子自由基清除能力:參照Chen Zhijie等[13]的方法。取上述游離酚和結(jié)合酚提取液100 μL(以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液適當(dāng)稀釋),加入3.0 mL ABTS溶液,漩渦后置于室溫下暗處反應(yīng)30 min,在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液代替提取液作為空白對(duì)照Acontrol。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按公式(2)計(jì)算。以不同濃度Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(配制不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定其在734 nm波長(zhǎng)處吸光度,以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2≥0.99),ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力以每克干質(zhì)量樣品反應(yīng)生成Trolox的物質(zhì)的量計(jì),單位為μmol/g。

    1.3.8 苯丙氨酸解氨酶活力測(cè)定

    苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)活力參照Ma Yan等[12]的方法。稱取2 g發(fā)芽大豆鮮樣置于預(yù)冷研缽中,加入事先預(yù)冷的4 mL 0.2 mol/L pH 8.8硼酸鈉緩沖液,冰浴研磨。研磨后倒入10 mL離心管內(nèi),在4 ℃條件下,8 000 r/min離心20 min,取上清液作為PAL提取液。PAL活力測(cè)定反應(yīng)體系:2.2 mL 0.05 mol/LL-苯丙氨酸、0.8 mL酶提取液。加入酶提取液后,迅速搖勻,以上述硼酸鈉緩沖液代替PAL提取液作為空白對(duì)照,立即使用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A1)。然后在37 ℃恒溫水浴鍋中水浴90 min,水浴之后滴加0.2 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應(yīng),再次使用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定在290 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A2)。以每克鮮樣每小時(shí)在290 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位(U),PAL活力計(jì)算如式(3)所示。

    1.3.9 抗氧化酶活力測(cè)定

    過氧化物酶(peroxidase,POD)活力的測(cè)定參照Chen Zhijie等[14]的方法并作適當(dāng)修改。稱取5 g發(fā)芽大豆鮮樣,置于研缽中,加入15 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.5,內(nèi)含1 mmol/L聚乙二醇6000、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)和體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100),在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入至離心管中,在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min,上清液即為酶提取液。取3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液和20 μL酶提取液,在37 ℃預(yù)保溫平衡5 min,在上述溶液中加入100 μL 0.5 mol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng),以蒸餾水作為參比空白調(diào)零,測(cè)定反應(yīng)體系在470 nm波長(zhǎng)處吸光度。POD活力以每克鮮樣每分鐘在470 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.1為一個(gè)酶活力單位,結(jié)果表示為U/g。

    過氧化氫酶(catalase,CAT)活力的測(cè)定參照Chen Zhijie等[14]的方法并作適當(dāng)修改。稱取5 g發(fā)芽大豆鮮樣,置于研缽中,加入15 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.5,內(nèi)含5 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% PVP),在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入至離心管中,在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min,上清液即為酶提取液。取2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液,在25 ℃預(yù)保溫平衡5 min,在上述溶液中加入100 μL酶提取液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),以蒸餾水作為參比空白調(diào)零,測(cè)定反應(yīng)體系在240 nm波長(zhǎng)處吸光度。CAT活力以每克鮮樣每分鐘在240 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位,結(jié)果表示為U/g。

    抗壞血酸過氧化物酶(ascorbic acid peroxidase,APX)活力的測(cè)定參照Z(yǔ)hang Zi[15]和曹建康[16]等的方法并作適當(dāng)修改。稱取5 g發(fā)芽大豆鮮樣,置于研缽中,加入15 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.5,內(nèi)含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和1 mmol/L抗壞血酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PVP),在冰浴條件下研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入至離心管中,在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min,上清液即為酶提取液。取2.6 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.5,內(nèi)含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和0.5 mmol/L抗壞血酸)和0.1 mL酶提取液,在25 ℃預(yù)保溫平衡5 min,在上述溶液中加入0.3 mL 2 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng),以蒸餾水作為參比空白調(diào)零,測(cè)定反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處吸光度。APX活力以每克鮮樣每分鐘在290 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位,結(jié)果表示為U/g。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3 次生物學(xué)重復(fù),數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SAS 8.1軟件中Duncan’s多重比較法進(jìn)行方差分析,顯著水平為P<0.05。采用Origin 8.5軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

    從圖1A可以看出,外源GABA能顯著促進(jìn)發(fā)芽大豆的生長(zhǎng)(P<0.05),且隨著GABA濃度的增加促進(jìn)作用越顯著,圖1B表明2.5、5 mmol/L外源GABA能顯著增加發(fā)芽大豆的鮮質(zhì)量(P<0.05),5 mmol/L的GABA促進(jìn)作用最強(qiáng),比對(duì)照提高了8.33%。相應(yīng)地,隨著外源GABA濃度的增加,發(fā)芽大豆的干質(zhì)量則顯著降低(圖1C)。上述結(jié)果表明GABA可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)。

    圖1 GABA對(duì)發(fā)芽大豆芽長(zhǎng)(A)、鮮質(zhì)量(B)和干質(zhì)量(C)的影響Fig. 1 Effect of GABA on sprout length (A), fresh mass (B) and dry mass (C) of germinated soybean

    2.2 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆總酚含量的影響

    在籽粒發(fā)芽過程中,植物細(xì)胞壁周圍的很多成分降解,使游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的酚類化合物得以釋放,進(jìn)而使總酚含量明顯增加,且芽苗生長(zhǎng)過程中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。從圖2可看出,外源GABA能顯著提高總酚含量(P<0.05),且隨著GABA濃度的增加總酚含量顯著增加,20 mmol/L GABA濃度下游離酚及結(jié)合酚含量分別較對(duì)照提高32.07%和26.73%,總酚含量為對(duì)照組的1.39 倍。這與GABA處理促進(jìn)芽苗生長(zhǎng)呈正相關(guān)關(guān)系。

    圖2 GABA對(duì)發(fā)芽大豆總酚含量的影響Fig. 2 Effect of GABA on the content of total phenolics in germinated soybean

    2.3 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆酚酸含量的影響

    由圖3可看出,發(fā)芽大豆中游離酚酸主要是對(duì)香豆酸和香草酸,結(jié)合酚酸含量較多的是對(duì)香豆酸和丁香酸,其次是阿魏酸、香草酸和芥子酸。外源GABA能顯著提高游離酚酸及結(jié)合酚酸含量(P<0.05)。由圖3A可知,GABA濃度越高,游離酚酸含量越高,20 mmol/L濃度下對(duì)香豆酸由2.86 μg/g增加到13.94 μg/g,香草酸則從無(wú)到8.85 μg/g。由圖3B可看出,GABA濃度為2.5 mmol/L時(shí)結(jié)合酚酸含量最高,其中對(duì)香豆酸和阿魏酸分別比對(duì)照增加了96.3%和114.9%。

    圖3 GABA對(duì)發(fā)芽大豆酚酸含量的影響Fig. 3 Effect of GABA on the content of phenolic acid in germinated soybean

    2.4 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆PAL活力的影響

    圖4顯示了不同濃度GABA培養(yǎng)下發(fā)芽大豆PAL活力的變化。隨著GABA濃度的升高,發(fā)芽大豆中PAL活力呈先升高后下降趨勢(shì)。當(dāng)GABA培養(yǎng)液濃度為10 mmol/L時(shí),PAL活力達(dá)到最大值。PAL是植物體苯丙烷類物質(zhì)代謝和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶,在一定程度下能夠降低苯丙烷物質(zhì)代謝的速率。

    圖4 GABA對(duì)發(fā)芽大豆PAL活力的影響Fig. 4 Effect of GABA on PAL activity of germinated soybean

    2.5 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化能力的影響

    由圖5可看出,外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆的抗氧化能力影響顯著。隨著GABA濃度的增加,無(wú)論游離酚酸還是結(jié)合酚的DPPH自由基清除能力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均顯著提高,通過與總酚含量變化結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析,游離酚和結(jié)合酚的DPPH自由基清除能力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均與總酚含量呈正相關(guān)。說(shuō)明外源GABA可以通過調(diào)節(jié)總酚來(lái)影響芽苗的抗氧化能力。

    圖5 GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化能力的影響Fig. 5 Effect of GABA on antioxidant capacity of germinated soybean

    2.6 外源GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化酶活性的影響

    圖6顯示不同濃度的GABA對(duì)發(fā)芽大豆中POD、CAT和APX活力的影響顯著。隨著GABA濃度的升高,3 種抗氧化酶活力均呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)GABA培養(yǎng)液濃度為10 mmol/L時(shí),POD、CAT、APX活力達(dá)到最大值。表明當(dāng)GABA濃度過高時(shí),不利于抗氧化酶活力的持續(xù)增加。

    圖6 GABA對(duì)發(fā)芽大豆抗氧化酶活力的影響Fig. 6 Effect of GABA on antioxidant enzyme activity of germinated soybean

    3 討 論

    GABA在植物體內(nèi)具有多重生理作用,如抵御逆境、臨時(shí)供氮、刺激激素生成、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、傳遞信號(hào)等[17]。近年來(lái),GABA在植物體中的生理作用已成研究熱點(diǎn),尤其在GABA調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、參與抵御逆境反應(yīng)方面的研究較多[18]。正常條件下,植物體中GABA含量低(約為0.03~2.00 μmol/gmf),但在逆境條件(如缺氧、冷害、酸化、干旱、機(jī)械刺激)等多種因素脅迫下GABA含量迅速升高[19]。眾多研究表明,GABA能緩解逆境脅迫對(duì)植物的傷害,外源GABA能夠提高鹽脅迫下番茄種子的發(fā)芽率[7],能夠緩解鹽脅迫對(duì)玉米種子胚芽鞘伸長(zhǎng)的抑制作用[20]及低氧脅迫對(duì)甜瓜根系伸長(zhǎng)的抑制作用[21],增強(qiáng)植物的抗氧化系統(tǒng)。在本研究中,隨著外源GABA濃度的增加,發(fā)芽大豆的芽長(zhǎng)呈增加趨勢(shì),但是鮮質(zhì)量先升高后降低,干質(zhì)量則呈下降趨勢(shì)(圖1)。說(shuō)明外源GABA處理顯著促進(jìn)了發(fā)芽大豆生長(zhǎng),增加了干物質(zhì)消耗,其中,5 mmol/L的GABA處理時(shí)發(fā)芽大豆吸水率高,發(fā)芽大豆鮮質(zhì)量最高。

    目前,研究人員對(duì)GABA在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)理了解甚少,原因在于尚未克隆出植物中的GABA受體基因。已有研究發(fā)現(xiàn),GABA可能是通過與植物體中已知的谷氨酸受體結(jié)合發(fā)揮作用,而這個(gè)谷氨酸受體的調(diào)節(jié)區(qū)域與動(dòng)物體中的GABAB受體結(jié)構(gòu)相似[22],因而GABA可能作為一種信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間發(fā)揮作用。Shi Shengqing等[10]研究發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下添加外源GABA處理錦雞兒根部能夠激活其體內(nèi)多重應(yīng)答機(jī)制,主要包括信號(hào)傳遞、蛋白質(zhì)降解調(diào)控、激素合成、活性氧的形成等其他代謝機(jī)制。Palanivelu等[23]研究發(fā)現(xiàn),不同濃度梯度的GABA可能作為信號(hào)分子引導(dǎo)花粉管的伸長(zhǎng)。GABA與植物的內(nèi)源激素存在互作,可通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平來(lái)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。亦有研究表明,逆境脅迫誘導(dǎo)GABA合成,同時(shí)也促使乙烯的產(chǎn)生,并且GABA的產(chǎn)生要先于乙烯。用外源GABA處理離體向日葵12 h即誘導(dǎo)乙烯含量增加14 倍,同時(shí)促進(jìn)了乙烯合成的關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的基因表達(dá)水平明顯增加,但可以確定GABA不是乙烯合成的前體,推測(cè)GABA是作為一種信號(hào)分子影響相關(guān)酶的基因表達(dá)[24]。Kramer等[25]通過咖啡豆干燥工藝研究發(fā)現(xiàn),GABA積累與干旱脅迫相關(guān)脫水素的編碼基因表達(dá)有關(guān)。馬兆武[26]用GABA和CoCl2、AgNO3(乙烯合成途徑和信號(hào)途徑的抑制劑)處理煙草幼苗,發(fā)現(xiàn)GABA分別參與了CoCl2和AgNO3對(duì)煙草ACO1基因和EIL3/4基因的表達(dá),在6 h時(shí)能夠緩解其抑制作用,并能增強(qiáng)EIL3/4基因的表達(dá),其分子機(jī)制尚不清楚,GABA可能作為某些途徑的信號(hào)分子參與煙草乙烯信號(hào)反應(yīng)途徑??梢?,GABA促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增強(qiáng)抵抗逆境的能力與其作為信號(hào)分子調(diào)控活性氧代謝、調(diào)節(jié)激素合成有關(guān)。

    隨著外源GABA濃度的提高,總酚含量持續(xù)增加(圖2),游離酚酸含量的變化趨勢(shì)與總酚含量變化趨勢(shì)一致,結(jié)合酚酸含量先升高后下降,但均高于對(duì)照(圖3)。說(shuō)明GABA促進(jìn)了總酚含量的提高,同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)合酚酸向游離酚酸的轉(zhuǎn)化。當(dāng)2.5 mmol/L的GABA處理時(shí)效果最佳。作為酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶,大豆經(jīng)GABA處理后PAL活力升高,這是酚類物質(zhì)含量升高的重要因素,但是其變化趨勢(shì)與總酚含量不一致,說(shuō)明GABA對(duì)PAL的作用具有時(shí)空性[12]。此外,GABA處理還促進(jìn)了抗氧化酶活性的升高,從而增強(qiáng)了抗氧化系統(tǒng)(圖5、6)。推測(cè)其機(jī)理也與GABA調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、傳遞信號(hào)有關(guān),也可能與GABA刺激乙烯產(chǎn)生有關(guān)[24],而乙烯可誘導(dǎo)植物PAL基因的表達(dá)[27],進(jìn)而引起酚類物質(zhì)的富集。因此,GABA促進(jìn)發(fā)芽大豆生長(zhǎng)代謝的同時(shí),增強(qiáng)了苯丙烷代謝途徑,促進(jìn)了酚類物質(zhì)的合成和結(jié)合酚酸的釋放及其向游離酚酸的轉(zhuǎn)化,并提高了抗氧化酶活力以增強(qiáng)其活性氧清除能力。

    外源GABA能顯著提高發(fā)芽大豆的芽長(zhǎng)、鮮質(zhì)量,促進(jìn)發(fā)芽大豆的生長(zhǎng)。隨著GABA濃度升高,發(fā)芽大豆的總酚和游離酚酸含量逐漸增加。隨著GABA濃度的升高,結(jié)合酚酸逐漸釋放,并向游離形態(tài)轉(zhuǎn)化。GABA處理提高了DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力和POD、CAT、APX等抗氧化酶活力。可見,外源GABA顯著促進(jìn)苯丙烷代謝途徑誘導(dǎo)酚類物質(zhì)累積,且增強(qiáng)抗氧化能力與其促進(jìn)發(fā)芽大豆生長(zhǎng)有關(guān)。

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