• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面法優(yōu)化輔助降糖降脂的海藻果蔬提取物復(fù)配配方

    2021-07-29 03:26:50周賽楠王發(fā)合王曉梅李兆杰薛長湖唐慶娟
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:水提物脂肪酶糖苷酶

    周賽楠,張 青,王發(fā)合,王曉梅,李兆杰,薛長湖,3,唐慶娟,*

    (1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266100;2.青島明月海藻集團有限公司,海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室,山東 青島 266400;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東 青島 266237)

    如今超重和肥胖成為一種全球性的“流行病”,中國已成為世界上肥胖人口最多的國家[1]。肥胖使人易患冠心病[2]、高血壓[3]、內(nèi)分泌及代謝性疾病[4]。肥胖者患病率比常人高,如患糖尿病的概率約為常人的5 倍[5]。部分肥胖患者服用減肥和降脂藥來達(dá)到減肥降脂的目的,然而這些藥物都具有較為明顯的副作用,如運用最多的減肥藥奧利司他會導(dǎo)致服用者體內(nèi)脂溶性維生素缺乏[6]、肝臟損傷[7]、形成油性便[8]。他汀類降脂藥物會損害人體肌肉和肝臟[9]。這些藥物不能滿足如今人類對健康的要求。因此,研發(fā)輔助減肥、降糖降脂的綠色天然健康食品及配方來代替減肥降脂藥物是食品科學(xué)與人類健康領(lǐng)域的重要研究課題之一,也是當(dāng)下的研究熱點。

    近年來海洋生物資源漸漸被開發(fā)利用。海藻產(chǎn)量豐富、易獲得,是一種具有食藥兩用價值的海洋生物資源[10]。來自海藻的許多天然產(chǎn)物具有抗炎、降血脂、降血糖等活性[11]。羊棲菜(Sargassum fusiforme)是褐藻門馬尾藻科馬尾藻屬植物,在我國沿海地帶均有分布,是一種低脂低熱、高蛋白、高膳食纖維和富含礦物元素的天然食品[12]。研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜具有抗氧化、抗癌和減肥等功效[13]。與此同時,對果蔬中天然產(chǎn)物的開發(fā)利用也越來越多。從姜科植物姜黃中提取的姜黃素是一種常見的食用色素,具有抗氧化、抗炎等功能,還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝[14]。從石榴皮中提取的多酚物質(zhì)安石榴苷在抗炎抗癌等方面具有重要作用,同時也具有降脂減肥的功效[15]。這些海藻、果蔬來源的天然產(chǎn)物安全無毒、無害、社會認(rèn)可度高[16]。利用上述海藻、果蔬開發(fā)輔助降糖降脂的綠色天然健康食品及配方對自然資源開發(fā)利用和人類健康都具有重要意義。

    從天然產(chǎn)物中篩選糖脂代謝關(guān)鍵酶抑制劑,是開發(fā)輔助降糖降脂食品的有效途徑[17]。α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶,將淀粉、蔗糖等水解為單糖后被吸收進(jìn)入血液[18]。胰脂肪酶是人體脂質(zhì)消化的關(guān)鍵酶,能夠?qū)⒅|(zhì)大分子分解成小分子、形成乳糜微粒吸收入腸[19]。精準(zhǔn)靶向抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性,可抑制葡萄糖和脂質(zhì)的吸收,控制血糖[20]、減少脂質(zhì)攝入[21]。Wang等[22]使用響應(yīng)面法以α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-4的體外抑制活性為評價指標(biāo)優(yōu)化配方,動物實驗顯示配方能顯著降低肥胖小鼠的血糖水平,改善了糖耐量。由此可知消化代謝酶抑制活性可以作為配方設(shè)計的依據(jù)[23]。因此本實驗以羊棲菜水提物為主,姜黃、石榴提取物(姜黃素、安石榴苷)為輔,以體外α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制率為依據(jù),通過響應(yīng)面法優(yōu)化輔助降糖降脂的配方,為開發(fā)輔助降糖降脂的保健食品提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羊棲菜(Sargassum fusiforme)采摘自浙江溫州沿海。

    α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖(純度≥98%)、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside,PNPG)、奧利司他(純度≥98%)上海源葉生物科技有限公司;豬胰脂肪酶、4-甲基傘形酮油酸酯(4-methylumbelliferyl oleate,4-MUO)美國Sigma公司;姜黃素(純度95%) 河北天旭生物科技有限公司;安石榴苷(純度98%) 四川維克奇生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    GIPP-4000FD真空冷凍干燥機 上海繼譜電子科技有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;MR-23i型高速冷凍離心機 法國Jouan公司;MB100-4A微孔板恒溫孵育器 常州邁科諾儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;Sunrisebasic酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

    1.3 方法

    1.3.1 羊棲菜水提物制備

    將真空冷凍干燥的羊棲菜樣品室溫下水中浸泡10 h,研磨粉碎,以料液比1∶50將羊棲菜粉末與蒸餾水混合均勻,85 ℃水浴攪拌6 h[24]。將提取液在室溫下以4 500 r/min離心15 min,隨后收集上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,至冷凝管無水滴流下時轉(zhuǎn)移到恒溫箱中35 ℃烘干,獲得的干燥粉末即為羊棲菜水提物。

    1.3.2α-葡萄糖苷酶活力測定

    采用PNPG比色法進(jìn)行測定,參考文獻(xiàn)[25]并稍作修改。測定原理為α-葡萄糖苷酶與PNPG底物反應(yīng)會產(chǎn)生有色物質(zhì)。用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)溶解樣品(各單獨的配方組分、復(fù)合配方組分)得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。實驗在96 孔酶標(biāo)板中進(jìn)行,20 μL樣品溶液與20 μL 2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育15 min,向其中加入20 μL 20 mmol/L PNPG溶液(溶劑為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液),37 ℃孵育10 min,再加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng),通過酶標(biāo)儀測定體系在405 nm波長處的吸光度。實驗設(shè)置3 個組:樣品組、背景組(蒸餾水代替酶溶液)、空白組(蒸餾水代替樣品溶液)。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)式(1)計算α-葡萄糖苷酶活力抑制率。

    式中:A0為空白組吸光度;A1為背景組吸光度;A2為樣品組吸光度。

    1.3.3 胰脂肪酶活力測定

    胰脂肪酶活力測定的原理為胰脂肪酶降解4-MUO生成具有熒光吸收的產(chǎn)物4-甲基傘形酮[26]。樣品(各單獨的配方組分、復(fù)合配方組分)用二甲基亞砜助溶后用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)稀釋得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。0.5 mg豬胰脂肪酶粉末溶解在1 mL Tris-HCl緩沖液中。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。25 μL樣品溶液與25 μL胰脂肪酶溶液混合后加入96 孔板中,預(yù)孵育10 min后,向其中加入50 μL 4-MUO啟動反應(yīng),37 ℃反應(yīng)30 min后使用酶標(biāo)儀讀取激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長465 nm處體系熒光強度。實驗設(shè)置3 個組:樣品組、背景組(蒸餾水代替酶溶液)、空白組(蒸餾水代替樣品溶液)。按式(1)計算胰脂肪酶活力抑制率。

    1.3.4 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗

    以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷為配方組分,設(shè)計以羊棲菜水提物為主,姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方。以3 個組分對2 種酶活力的半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)平均值為各組分配比的確定依據(jù)[27],確定各組分質(zhì)量比例范圍。以0.5 mg/mL復(fù)合配方對2 種酶的活力抑制率為指標(biāo),通過預(yù)實驗確定每個單因素試驗中兩個固定因素的配比,進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗,確定各組分最佳配比。

    1.3.4.1 羊棲菜水提物配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

    固定m(姜黃素)∶m(安石榴苷)=4∶2(定義配比為混合物中各成分質(zhì)量比的數(shù)值,比如此處姜黃素、安石榴苷的配比分別為4、2),改變羊棲菜水提物的配比,分別為150、450、750、1 050、1 350,以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率為指標(biāo),判定羊棲菜水提物最佳配比。

    1.3.4.2 姜黃素配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

    固定羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比分別為450和2,改變姜黃素的配比,分別為2、4、6、8、10,以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對2 種酶活力的抑制率為指標(biāo),判定姜黃素最佳配比。

    1.3.4.3 安石榴苷配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

    確定羊棲菜水提物配比和姜黃素配比分別為450和4,改變安石榴苷的配比,分別為1、2、3、4、5,以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對2 種酶活力的抑制率為指標(biāo),判定安石榴苷最佳配比。

    1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化海藻果蔬提取物復(fù)配配方

    以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷的配比為3 個因素,每個因素設(shè)3 個水平(單因素篩選出),總質(zhì)量濃度是0.5 mg/mL,以配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性的抑制率為響應(yīng)值,響應(yīng)值越大,配比效果越好,用響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析[28],確定各成分配比。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

    表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Independent variables and their coded and actual levels used for response surface design

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    實驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計,采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)均為3 次平行實驗的平均值,結(jié)果以表示。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率

    圖1比較了配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50,IC50越小抑制效果越好。安石榴苷對兩種酶的抑制效果明顯強于其他成分,其對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別是(0.420 0±0.001 3)mg/mL和(0.090 0±0.010 9)mg/mL;姜黃素的抑制效果次之,其IC50分別是(0.730 0±0.018 6)mg/mL和(0.740 0±0.028 6)mg/mL;羊棲菜水提物的抑制效果相對較弱,其IC50分別是(38.22±1.57)mg/mL和(1.02±0.02)mg/mL。3 個組分(羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷)對兩種酶活力的IC50平均值之比約為150∶6∶2。以此比值為依據(jù),確定各組分配比范圍,即羊棲菜水提物配比:150、450、750、1 050、1 350;姜黃素配比:2、4、6、8、10;安石榴苷配比:1、2、3、4、5。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化以羊棲菜水提物為主,姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方,首先進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗。

    圖1 配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50Fig. 1 IC50 values for inhibition of α-glucosidase and pancreatic lipase by formulation ingredients

    2.2 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗結(jié)果

    如圖2A所示,0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下,配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加逐漸降低。配方對胰脂肪酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加先升高后降低,在羊棲菜水提物配比為450時達(dá)到最高。綜合分析確定羊棲菜水提物最佳配比為450。

    如圖2B所示,0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下,配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低,在姜黃素配比為4時達(dá)到最高。配方對胰脂肪酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低,在姜黃素配比為6時達(dá)到最高;在姜黃素配比為4時,配方對胰脂肪酶活力抑制率也達(dá)到了較高水平。綜合分析后確定姜黃素最佳配比為4。

    如圖2C所示,0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下,配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率均隨著安石榴苷配比的增加先升高后降低,且均在安石榴苷配比為2時達(dá)到最高。因此確定安石榴苷最佳配比為2。

    圖2 組分配比對配方α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力抑制率的影響Fig. 2 Effect of ratios of ingredients on the inhibition rate of α-glucosidase and pancreatic lipase activities by formulation

    2.3 D優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以羊棲菜水提物配比(A)、姜黃素配比(B)和安石榴苷配比(C)為自變量,以α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率為響應(yīng)值,通過D優(yōu)化響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析,確定各成分最優(yōu)配比。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

    運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到的回歸方程,見式(2)、(3)。

    為了檢驗方程的有效性,對結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)和可信度分析(表4)。由表3可知,對于α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率兩個響應(yīng)值,模型的P值均小于0.05,判斷模型顯著;模型失擬誤差P值均大于0.05,說明模型失擬項不顯著。由表4可知,模型響應(yīng)值α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率的決定系數(shù)R2分別為0.99、0.94,校正后R2分別為0.97、0.82,表明模型擬合度高;模型的變異系數(shù)均小于10%,說明模型對響應(yīng)值的置信度良好,該模型可以較好地反映真實的實驗結(jié)果。綜上所述,該回歸模型對響應(yīng)值的擬合程度較高,方程能夠較好地反映響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

    表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis of models

    為更直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響,對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面圖分析。隨著羊棲菜水提物配比的增加,配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率先降低后升高;配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨著姜黃素和安石榴苷配比的增加而升高(圖3A、B、C)。結(jié)合表3中三因素P值可知,三因素對配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率的影響力由高到低:羊棲菜水提物配比>安石榴苷配比>姜黃素配比。

    圖3 配方組分配比對配方抑制α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig. 3 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of α-glucosidase activity by formulation

    表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

    圖4是三因素之間的交互作用對配方抑制胰脂肪酶活力影響的響應(yīng)面圖。配方對胰脂肪酶活力的抑制率隨著羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比的增加先升高后降低;隨著姜黃素配比的增加而升高。結(jié)合表3中三因素P值可知,三因素對配方胰脂肪酶活力抑制率的影響力:姜黃素配比>羊棲菜水提物配比>安石榴苷配比。

    圖4 配方組分配比對配方抑制胰脂肪酶活力的影響Fig. 4 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of pancreatic lipase activity by formulation

    經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析得出最佳配方為:羊棲菜水提物配比150,姜黃素配比6,安石榴苷配比3;相應(yīng)的模型預(yù)測α-葡萄糖苷酶活力抑制率為45.98%,胰脂肪酶活力抑制率為73.88%。選取預(yù)測所得的最佳配比進(jìn)行復(fù)配,測定復(fù)配配方對這兩種酶活力的抑制率。配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率為(47.77±2.15)%,胰脂肪酶活力抑制率為(74.18±0.46)%。實際值與預(yù)測值相近,說明該模型能夠較好地預(yù)測配方最佳配比。因此,最佳配比為m(羊棲菜水提物)∶m(姜黃素)∶m(安石榴苷)=150∶6∶3。測定配方體外酶活力抑制效果,配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為(0.56±0.04)mg/mL和(0.210 0±0.000 3)mg/mL,優(yōu)于羊棲菜水提物單一成分。說明以羊棲菜水提物為主,復(fù)配以姜黃素、安石榴苷之后,體外抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的能力得到了很大提高。

    3 討 論

    本研究結(jié)果表明,配方組分羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷均對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力有較好的抑制作用。汪財生等[29]研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜中的巖藻黃質(zhì)提取物可顯著降低肥胖小鼠體質(zhì)量和Lee’s指數(shù),具有良好的減肥作用。本研究中羊棲菜水提物對胰脂肪酶活力的IC50為(1.02±0.02)mg/mL,表現(xiàn)出了較強的輔助降血脂能力。王令充等[30]研究表明姜黃素可以顯著降低血清和肝臟中的膽固醇含量。本實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素對兩種糖脂代謝酶(α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶)活力均具有較好的抑制活力,IC50分別為(0.730 0±0.018 6)mg/mL和(0.740 0±0.028 6)mg/mL。相比之下,3 種成分中安石榴苷的酶活力抑制效果最優(yōu),對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為(0.420 0±0.001 3)mg/mL和(0.090 0±0.010 9)mg/mL,說明安石榴苷具有較強的降血糖、降血脂活性。3 種成分均具有開發(fā)成為輔助減肥、降糖降脂保健食品的潛力。

    利用上述3 種活性成分,以海藻水提物為主,果蔬提取物為輔進(jìn)行復(fù)配,設(shè)計綠色健康的食品配方,有助于控制血糖、血脂以及減少相關(guān)并發(fā)癥的出現(xiàn),達(dá)到輔助降糖降脂的目的,還可以促進(jìn)對藻類的開發(fā)利用。以三者對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果IC50為判別依據(jù),以配方對兩種酶活力的抑制率為評價指標(biāo),通過單因素試驗和D優(yōu)化響應(yīng)面法最終確定了海藻果蔬配方最佳配比:m(羊棲菜水提物)∶m(姜黃素)∶m(安石榴苷)=150∶6∶3。該配方體外對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別為(0.56±0.04)mg/mL和(0.210 0±0.000 3)mg/mL。將姜黃素和安石榴苷與羊棲菜水提物復(fù)配后,對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果優(yōu)于單一成分羊棲菜水提物。此配方原料均為海藻、果蔬的天然產(chǎn)物,安全無毒、無害。

    雖然本研究優(yōu)化得到的海藻果蔬提取物復(fù)配最佳配方在體外有良好的輔助降糖降脂的效果,但其體內(nèi)輔助降糖降脂效果及作用機理有待進(jìn)一步探討。并且本研究中的配方組分均是從植物中分離提取的純度高的成分,不是食品原料,不能直接用于保健食品。因此,符合保健食品規(guī)格的輔助降糖降脂配方還需在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步研究和開發(fā)。

    猜你喜歡
    水提物脂肪酶糖苷酶
    鬼針草水提物對大鼠腎結(jié)石改善作用
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:39:02
    天麻水提物HPLC指紋圖譜的建立及其真?zhèn)舞b別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:38
    知母中4種成分及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    木蝴蝶提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    枇杷葉水提物的急性毒性和遺傳毒性
    脂肪酶Novozyme435手性拆分(R,S)-扁桃酸
    脂肪酶N435對PBSA與PBSH的酶催化降解和分子模擬
    中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:53
    六種花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究
    丹參水提物對缺血—再灌注心律失常大鼠的保護作用及機制
    β-葡萄糖苷酶與茶增香及抗病蟲害的研究進(jìn)展
    茶葉通訊(2014年4期)2014-02-27 07:55:49
    两个人免费观看高清视频| xxxwww97欧美| 波多野结衣巨乳人妻| 国内精品一区二区在线观看| 国产成人系列免费观看| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美色视频一区免费| 久久久久精品国产欧美久久久| 韩国av一区二区三区四区| 一级黄色大片毛片| 香蕉av资源在线| 51午夜福利影视在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 九色国产91popny在线| 欧美日韩精品网址| 午夜福利欧美成人| 大型av网站在线播放| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 在线a可以看的网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品影院久久| 91av网站免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久久久久久中文| 午夜两性在线视频| 亚洲av美国av| 一级作爱视频免费观看| 一级毛片高清免费大全| av中文乱码字幕在线| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 制服人妻中文乱码| 999久久久精品免费观看国产| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲乱码一区二区免费版| 久久精品综合一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 国产精品野战在线观看| av中文乱码字幕在线| a级毛片a级免费在线| 99久久国产精品久久久| 国产av麻豆久久久久久久| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品色激情综合| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲 欧美一区二区三区| 身体一侧抽搐| 日韩三级视频一区二区三区| 99热6这里只有精品| 国产激情欧美一区二区| 免费看a级黄色片| 亚洲人成77777在线视频| 午夜老司机福利片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| www日本黄色视频网| 免费看美女性在线毛片视频| 精品欧美一区二区三区在线| av福利片在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 老鸭窝网址在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲男人天堂网一区| 黄片大片在线免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品综合久久久久久久免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产高清有码在线观看视频 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久久国产a免费观看| 一进一出抽搐动态| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲人成网站高清观看| 国产成人系列免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 真人做人爱边吃奶动态| 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久久国产精品麻豆| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩国内少妇激情av| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 免费在线观看亚洲国产| 中文字幕高清在线视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 校园春色视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| av有码第一页| 亚洲成人久久爱视频| 中文字幕高清在线视频| 在线观看一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产三级中文精品| 大型av网站在线播放| 国产精品永久免费网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产三级黄色录像| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美精品啪啪一区二区三区| 美女黄网站色视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日韩大码丰满熟妇| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 12—13女人毛片做爰片一| 国产三级黄色录像| 女人被狂操c到高潮| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 一进一出抽搐动态| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 最近最新中文字幕大全电影3| 又紧又爽又黄一区二区| 色综合站精品国产| 特大巨黑吊av在线直播| 变态另类成人亚洲欧美熟女| av有码第一页| 精品久久久久久成人av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99久久综合精品五月天人人| 精品国产亚洲在线| 极品教师在线免费播放| 国产久久久一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费在线观看成人毛片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| av欧美777| 午夜免费激情av| 脱女人内裤的视频| 午夜福利欧美成人| 久久久国产成人免费| 亚洲国产欧美网| 欧美在线黄色| 亚洲精品久久国产高清桃花| 9191精品国产免费久久| 国产免费av片在线观看野外av| 制服诱惑二区| 日韩欧美在线乱码| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精华一区二区三区| 精品高清国产在线一区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 青草久久国产| 国产免费男女视频| 草草在线视频免费看| 国产av又大| 中文字幕高清在线视频| 精品国产美女av久久久久小说| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产欧美网| 男人舔女人下体高潮全视频| 男插女下体视频免费在线播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 岛国在线观看网站| 国产精品久久久av美女十八| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品高清国产在线一区| 国产欧美日韩一区二区三| av福利片在线| 成年版毛片免费区| or卡值多少钱| 国产激情久久老熟女| 欧美三级亚洲精品| 露出奶头的视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲午夜理论影院| 亚洲激情在线av| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看66精品国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 免费看日本二区| 熟女电影av网| 久久久国产精品麻豆| 国产激情久久老熟女| 老司机靠b影院| 一个人免费在线观看电影 | 久久国产精品影院| 视频区欧美日本亚洲| 色av中文字幕| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩高清综合在线| 超碰成人久久| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精华一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲国产欧美人成| svipshipincom国产片| 老司机靠b影院| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 在线视频色国产色| 99精品久久久久人妻精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产亚洲欧美98| 国产视频一区二区在线看| 国产午夜精品久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 小说图片视频综合网站| 香蕉丝袜av| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久国产乱子伦精品免费另类| 69av精品久久久久久| 久久热在线av| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 长腿黑丝高跟| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一边摸一边做爽爽视频免费| 天天添夜夜摸| 91老司机精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 成年人黄色毛片网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费看日本二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品永久免费网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精华一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| 国产不卡一卡二| 国模一区二区三区四区视频 | 手机成人av网站| 国产免费av片在线观看野外av| 日本一区二区免费在线视频| 婷婷亚洲欧美| 日韩欧美三级三区| 午夜激情福利司机影院| 妹子高潮喷水视频| 男女之事视频高清在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产91精品成人一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 麻豆成人av在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美一级a爱片免费观看看 | 正在播放国产对白刺激| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日韩有码中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 久久久国产精品麻豆| 精品日产1卡2卡| 欧美三级亚洲精品| 日韩欧美免费精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 好男人电影高清在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 天天添夜夜摸| 可以在线观看毛片的网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一夜夜www| 久久久精品大字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 一级作爱视频免费观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 午夜福利在线观看吧| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 变态另类丝袜制服| 久久久久久久久免费视频了| 免费电影在线观看免费观看| 国产成人av教育| 在线观看www视频免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩欧美三级三区| 国产久久久一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 亚洲人成电影免费在线| 12—13女人毛片做爰片一| 这个男人来自地球电影免费观看| 成年版毛片免费区| 国产精品av久久久久免费| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99热这里只有是精品50| 亚洲成人国产一区在线观看| 成人18禁在线播放| 两个人免费观看高清视频| 最新在线观看一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 精品国产乱子伦一区二区三区| 午夜福利在线在线| 国产成人aa在线观看| 欧美三级亚洲精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国语自产精品视频在线第100页| 99国产综合亚洲精品| 国产久久久一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 三级国产精品欧美在线观看 | 中文字幕最新亚洲高清| www日本黄色视频网| 国产97色在线日韩免费| 国产av在哪里看| 精品欧美国产一区二区三| av福利片在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 日本熟妇午夜| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 午夜日韩欧美国产| 亚洲性夜色夜夜综合| 看片在线看免费视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品第一国产精品| 国产成年人精品一区二区| 国产成人啪精品午夜网站| 美女大奶头视频| 国产亚洲欧美98| 国产三级中文精品| 亚洲欧美激情综合另类| 男女午夜视频在线观看| 性欧美人与动物交配| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久99久视频精品免费| 亚洲一区二区三区色噜噜| 午夜免费激情av| 国产精品免费视频内射| 日韩高清综合在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一本一本综合久久| 悠悠久久av| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久久久久人人人人人| 午夜老司机福利片| 国产男靠女视频免费网站| 午夜老司机福利片| 最好的美女福利视频网| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产69精品久久久久777片 | 黄频高清免费视频| 特级一级黄色大片| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 制服丝袜大香蕉在线| 国产亚洲精品一区二区www| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 在线免费观看的www视频| 日韩欧美国产在线观看| 88av欧美| 国产激情欧美一区二区| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲七黄色美女视频| 99国产精品一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 好男人电影高清在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成年人黄色毛片网站| 国产一区二区三区视频了| 制服诱惑二区| 久久精品人妻少妇| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品一区av在线观看| av片东京热男人的天堂| 男女午夜视频在线观看| 精品日产1卡2卡| avwww免费| 日本三级黄在线观看| 亚洲片人在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产私拍福利视频在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品一及| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 人人妻人人看人人澡| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人永久免费在线观看视频| 欧美在线一区亚洲| 国产亚洲av高清不卡| 久久性视频一级片| 久久久久久九九精品二区国产 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 午夜老司机福利片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 免费电影在线观看免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲欧美日韩东京热| 久久亚洲真实| 动漫黄色视频在线观看| 在线观看日韩欧美| av天堂在线播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一级a爱片免费观看的视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久这里只有精品中国| 99热这里只有是精品50| 九九热线精品视视频播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲精华国产精华精| 一区二区三区激情视频| tocl精华| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人18禁在线播放| 啦啦啦免费观看视频1| 热99re8久久精品国产| 亚洲成人久久性| 久久性视频一级片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 国产午夜精品论理片| 九九热线精品视视频播放| 十八禁网站免费在线| 国产探花在线观看一区二区| 99国产综合亚洲精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 一本精品99久久精品77| 床上黄色一级片| 在线观看舔阴道视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 在线观看免费视频日本深夜| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线视频色国产色| 国产人伦9x9x在线观看| 国产一区二区激情短视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲美女视频黄频| 国内精品久久久久精免费| or卡值多少钱| 老司机在亚洲福利影院| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲美女黄片视频| 午夜成年电影在线免费观看| 国产av不卡久久| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品亚洲一级av第二区| 三级毛片av免费| 美女免费视频网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久香蕉国产精品| 亚洲欧美日韩东京热| 国产成人影院久久av| 欧美一区二区精品小视频在线| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜免费观看网址| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜影院日韩av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精华一区二区三区| av天堂在线播放| www.精华液| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美日韩黄片免| 亚洲欧美激情综合另类| 国产av一区二区精品久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 毛片女人毛片| 久久久国产欧美日韩av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美性猛交黑人性爽| 婷婷亚洲欧美| 在线观看日韩欧美| 美女午夜性视频免费| 观看免费一级毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲专区国产一区二区| 三级毛片av免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 免费搜索国产男女视频| 亚洲专区中文字幕在线| 人妻久久中文字幕网| 波多野结衣高清作品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本在线视频免费播放| 久久久久久大精品| 一二三四在线观看免费中文在| 在线观看日韩欧美| av欧美777| 可以在线观看毛片的网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品久久蜜臀av无| 波多野结衣高清作品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精华一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费在线观看黄色视频的| 午夜福利欧美成人| 窝窝影院91人妻| 久久久久久久精品吃奶| 999久久久国产精品视频| 国产激情久久老熟女| av有码第一页| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲美女视频黄频| 中文字幕av在线有码专区| 精品久久久久久久末码| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产人伦9x9x在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 在线观看www视频免费| 国产成人欧美在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品一区二区免费欧美| 9191精品国产免费久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 中文字幕久久专区| av视频在线观看入口| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲最大成人中文| 操出白浆在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 韩国av一区二区三区四区| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品久久久久久久久久免费视频| 两个人视频免费观看高清| 午夜视频精品福利| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久久久性生活片| 宅男免费午夜| 99国产精品一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 婷婷六月久久综合丁香| 人人妻人人看人人澡| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 一级毛片精品| 久久久久国内视频| www.自偷自拍.com| 午夜a级毛片| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲五月天丁香| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产在线精品亚洲第一网站| а√天堂www在线а√下载| 精品电影一区二区在线| svipshipincom国产片| 久久中文字幕人妻熟女| 两个人的视频大全免费| 日韩欧美在线二视频| 国产精品av久久久久免费| 两个人的视频大全免费| www.熟女人妻精品国产| 日韩欧美免费精品| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久久国产精品麻豆| 日韩中文字幕欧美一区二区| 色av中文字幕| 成在线人永久免费视频| 999精品在线视频| 日本在线视频免费播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 青草久久国产| 一区福利在线观看|