• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面法優(yōu)化輔助降糖降脂的海藻果蔬提取物復(fù)配配方

    2021-07-29 03:26:50周賽楠王發(fā)合王曉梅李兆杰薛長湖唐慶娟
    食品科學(xué) 2021年13期
    關(guān)鍵詞:水提物脂肪酶糖苷酶

    周賽楠,張 青,王發(fā)合,王曉梅,李兆杰,薛長湖,3,唐慶娟,*

    (1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266100;2.青島明月海藻集團有限公司,海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室,山東 青島 266400;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東 青島 266237)

    如今超重和肥胖成為一種全球性的“流行病”,中國已成為世界上肥胖人口最多的國家[1]。肥胖使人易患冠心病[2]、高血壓[3]、內(nèi)分泌及代謝性疾病[4]。肥胖者患病率比常人高,如患糖尿病的概率約為常人的5 倍[5]。部分肥胖患者服用減肥和降脂藥來達(dá)到減肥降脂的目的,然而這些藥物都具有較為明顯的副作用,如運用最多的減肥藥奧利司他會導(dǎo)致服用者體內(nèi)脂溶性維生素缺乏[6]、肝臟損傷[7]、形成油性便[8]。他汀類降脂藥物會損害人體肌肉和肝臟[9]。這些藥物不能滿足如今人類對健康的要求。因此,研發(fā)輔助減肥、降糖降脂的綠色天然健康食品及配方來代替減肥降脂藥物是食品科學(xué)與人類健康領(lǐng)域的重要研究課題之一,也是當(dāng)下的研究熱點。

    近年來海洋生物資源漸漸被開發(fā)利用。海藻產(chǎn)量豐富、易獲得,是一種具有食藥兩用價值的海洋生物資源[10]。來自海藻的許多天然產(chǎn)物具有抗炎、降血脂、降血糖等活性[11]。羊棲菜(Sargassum fusiforme)是褐藻門馬尾藻科馬尾藻屬植物,在我國沿海地帶均有分布,是一種低脂低熱、高蛋白、高膳食纖維和富含礦物元素的天然食品[12]。研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜具有抗氧化、抗癌和減肥等功效[13]。與此同時,對果蔬中天然產(chǎn)物的開發(fā)利用也越來越多。從姜科植物姜黃中提取的姜黃素是一種常見的食用色素,具有抗氧化、抗炎等功能,還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝[14]。從石榴皮中提取的多酚物質(zhì)安石榴苷在抗炎抗癌等方面具有重要作用,同時也具有降脂減肥的功效[15]。這些海藻、果蔬來源的天然產(chǎn)物安全無毒、無害、社會認(rèn)可度高[16]。利用上述海藻、果蔬開發(fā)輔助降糖降脂的綠色天然健康食品及配方對自然資源開發(fā)利用和人類健康都具有重要意義。

    從天然產(chǎn)物中篩選糖脂代謝關(guān)鍵酶抑制劑,是開發(fā)輔助降糖降脂食品的有效途徑[17]。α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶,將淀粉、蔗糖等水解為單糖后被吸收進(jìn)入血液[18]。胰脂肪酶是人體脂質(zhì)消化的關(guān)鍵酶,能夠?qū)⒅|(zhì)大分子分解成小分子、形成乳糜微粒吸收入腸[19]。精準(zhǔn)靶向抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性,可抑制葡萄糖和脂質(zhì)的吸收,控制血糖[20]、減少脂質(zhì)攝入[21]。Wang等[22]使用響應(yīng)面法以α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-4的體外抑制活性為評價指標(biāo)優(yōu)化配方,動物實驗顯示配方能顯著降低肥胖小鼠的血糖水平,改善了糖耐量。由此可知消化代謝酶抑制活性可以作為配方設(shè)計的依據(jù)[23]。因此本實驗以羊棲菜水提物為主,姜黃、石榴提取物(姜黃素、安石榴苷)為輔,以體外α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制率為依據(jù),通過響應(yīng)面法優(yōu)化輔助降糖降脂的配方,為開發(fā)輔助降糖降脂的保健食品提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羊棲菜(Sargassum fusiforme)采摘自浙江溫州沿海。

    α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖(純度≥98%)、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside,PNPG)、奧利司他(純度≥98%)上海源葉生物科技有限公司;豬胰脂肪酶、4-甲基傘形酮油酸酯(4-methylumbelliferyl oleate,4-MUO)美國Sigma公司;姜黃素(純度95%) 河北天旭生物科技有限公司;安石榴苷(純度98%) 四川維克奇生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    GIPP-4000FD真空冷凍干燥機 上海繼譜電子科技有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;MR-23i型高速冷凍離心機 法國Jouan公司;MB100-4A微孔板恒溫孵育器 常州邁科諾儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;Sunrisebasic酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

    1.3 方法

    1.3.1 羊棲菜水提物制備

    將真空冷凍干燥的羊棲菜樣品室溫下水中浸泡10 h,研磨粉碎,以料液比1∶50將羊棲菜粉末與蒸餾水混合均勻,85 ℃水浴攪拌6 h[24]。將提取液在室溫下以4 500 r/min離心15 min,隨后收集上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,至冷凝管無水滴流下時轉(zhuǎn)移到恒溫箱中35 ℃烘干,獲得的干燥粉末即為羊棲菜水提物。

    1.3.2α-葡萄糖苷酶活力測定

    采用PNPG比色法進(jìn)行測定,參考文獻(xiàn)[25]并稍作修改。測定原理為α-葡萄糖苷酶與PNPG底物反應(yīng)會產(chǎn)生有色物質(zhì)。用磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)溶解樣品(各單獨的配方組分、復(fù)合配方組分)得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。實驗在96 孔酶標(biāo)板中進(jìn)行,20 μL樣品溶液與20 μL 2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育15 min,向其中加入20 μL 20 mmol/L PNPG溶液(溶劑為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液),37 ℃孵育10 min,再加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng),通過酶標(biāo)儀測定體系在405 nm波長處的吸光度。實驗設(shè)置3 個組:樣品組、背景組(蒸餾水代替酶溶液)、空白組(蒸餾水代替樣品溶液)。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)式(1)計算α-葡萄糖苷酶活力抑制率。

    式中:A0為空白組吸光度;A1為背景組吸光度;A2為樣品組吸光度。

    1.3.3 胰脂肪酶活力測定

    胰脂肪酶活力測定的原理為胰脂肪酶降解4-MUO生成具有熒光吸收的產(chǎn)物4-甲基傘形酮[26]。樣品(各單獨的配方組分、復(fù)合配方組分)用二甲基亞砜助溶后用Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)稀釋得到質(zhì)量濃度分別為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL的溶液。0.5 mg豬胰脂肪酶粉末溶解在1 mL Tris-HCl緩沖液中。酶溶液和樣品溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配。25 μL樣品溶液與25 μL胰脂肪酶溶液混合后加入96 孔板中,預(yù)孵育10 min后,向其中加入50 μL 4-MUO啟動反應(yīng),37 ℃反應(yīng)30 min后使用酶標(biāo)儀讀取激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長465 nm處體系熒光強度。實驗設(shè)置3 個組:樣品組、背景組(蒸餾水代替酶溶液)、空白組(蒸餾水代替樣品溶液)。按式(1)計算胰脂肪酶活力抑制率。

    1.3.4 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗

    以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷為配方組分,設(shè)計以羊棲菜水提物為主,姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方。以3 個組分對2 種酶活力的半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)平均值為各組分配比的確定依據(jù)[27],確定各組分質(zhì)量比例范圍。以0.5 mg/mL復(fù)合配方對2 種酶的活力抑制率為指標(biāo),通過預(yù)實驗確定每個單因素試驗中兩個固定因素的配比,進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗,確定各組分最佳配比。

    1.3.4.1 羊棲菜水提物配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

    固定m(姜黃素)∶m(安石榴苷)=4∶2(定義配比為混合物中各成分質(zhì)量比的數(shù)值,比如此處姜黃素、安石榴苷的配比分別為4、2),改變羊棲菜水提物的配比,分別為150、450、750、1 050、1 350,以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率為指標(biāo),判定羊棲菜水提物最佳配比。

    1.3.4.2 姜黃素配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

    固定羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比分別為450和2,改變姜黃素的配比,分別為2、4、6、8、10,以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對2 種酶活力的抑制率為指標(biāo),判定姜黃素最佳配比。

    1.3.4.3 安石榴苷配比對復(fù)配配方抑制酶活性的影響

    確定羊棲菜水提物配比和姜黃素配比分別為450和4,改變安石榴苷的配比,分別為1、2、3、4、5,以配方質(zhì)量濃度0.5 mg/mL下對2 種酶活力的抑制率為指標(biāo),判定安石榴苷最佳配比。

    1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化海藻果蔬提取物復(fù)配配方

    以羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷的配比為3 個因素,每個因素設(shè)3 個水平(單因素篩選出),總質(zhì)量濃度是0.5 mg/mL,以配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性的抑制率為響應(yīng)值,響應(yīng)值越大,配比效果越好,用響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析[28],確定各成分配比。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

    表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Independent variables and their coded and actual levels used for response surface design

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    實驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計,采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)均為3 次平行實驗的平均值,結(jié)果以表示。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率

    圖1比較了配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50,IC50越小抑制效果越好。安石榴苷對兩種酶的抑制效果明顯強于其他成分,其對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別是(0.420 0±0.001 3)mg/mL和(0.090 0±0.010 9)mg/mL;姜黃素的抑制效果次之,其IC50分別是(0.730 0±0.018 6)mg/mL和(0.740 0±0.028 6)mg/mL;羊棲菜水提物的抑制效果相對較弱,其IC50分別是(38.22±1.57)mg/mL和(1.02±0.02)mg/mL。3 個組分(羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷)對兩種酶活力的IC50平均值之比約為150∶6∶2。以此比值為依據(jù),確定各組分配比范圍,即羊棲菜水提物配比:150、450、750、1 050、1 350;姜黃素配比:2、4、6、8、10;安石榴苷配比:1、2、3、4、5。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化以羊棲菜水提物為主,姜黃素、安石榴苷為輔的復(fù)配配方,首先進(jìn)行海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗。

    圖1 配方組分對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50Fig. 1 IC50 values for inhibition of α-glucosidase and pancreatic lipase by formulation ingredients

    2.2 海藻果蔬提取物復(fù)配單因素試驗結(jié)果

    如圖2A所示,0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下,配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加逐漸降低。配方對胰脂肪酶活力抑制率隨羊棲菜水提物配比的增加先升高后降低,在羊棲菜水提物配比為450時達(dá)到最高。綜合分析確定羊棲菜水提物最佳配比為450。

    如圖2B所示,0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下,配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低,在姜黃素配比為4時達(dá)到最高。配方對胰脂肪酶活力抑制率隨姜黃素配比的增加先升高后降低,在姜黃素配比為6時達(dá)到最高;在姜黃素配比為4時,配方對胰脂肪酶活力抑制率也達(dá)到了較高水平。綜合分析后確定姜黃素最佳配比為4。

    如圖2C所示,0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下,配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率均隨著安石榴苷配比的增加先升高后降低,且均在安石榴苷配比為2時達(dá)到最高。因此確定安石榴苷最佳配比為2。

    圖2 組分配比對配方α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力抑制率的影響Fig. 2 Effect of ratios of ingredients on the inhibition rate of α-glucosidase and pancreatic lipase activities by formulation

    2.3 D優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以羊棲菜水提物配比(A)、姜黃素配比(B)和安石榴苷配比(C)為自變量,以α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率為響應(yīng)值,通過D優(yōu)化響應(yīng)面法進(jìn)行配方優(yōu)化分析,確定各成分最優(yōu)配比。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

    運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到的回歸方程,見式(2)、(3)。

    為了檢驗方程的有效性,對結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)和可信度分析(表4)。由表3可知,對于α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率兩個響應(yīng)值,模型的P值均小于0.05,判斷模型顯著;模型失擬誤差P值均大于0.05,說明模型失擬項不顯著。由表4可知,模型響應(yīng)值α-葡萄糖苷酶活力抑制率和胰脂肪酶活力抑制率的決定系數(shù)R2分別為0.99、0.94,校正后R2分別為0.97、0.82,表明模型擬合度高;模型的變異系數(shù)均小于10%,說明模型對響應(yīng)值的置信度良好,該模型可以較好地反映真實的實驗結(jié)果。綜上所述,該回歸模型對響應(yīng)值的擬合程度較高,方程能夠較好地反映響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

    表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis of models

    為更直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響,對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面圖分析。隨著羊棲菜水提物配比的增加,配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率先降低后升高;配方對α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨著姜黃素和安石榴苷配比的增加而升高(圖3A、B、C)。結(jié)合表3中三因素P值可知,三因素對配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率的影響力由高到低:羊棲菜水提物配比>安石榴苷配比>姜黃素配比。

    圖3 配方組分配比對配方抑制α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig. 3 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of α-glucosidase activity by formulation

    表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

    圖4是三因素之間的交互作用對配方抑制胰脂肪酶活力影響的響應(yīng)面圖。配方對胰脂肪酶活力的抑制率隨著羊棲菜水提物配比和安石榴苷配比的增加先升高后降低;隨著姜黃素配比的增加而升高。結(jié)合表3中三因素P值可知,三因素對配方胰脂肪酶活力抑制率的影響力:姜黃素配比>羊棲菜水提物配比>安石榴苷配比。

    圖4 配方組分配比對配方抑制胰脂肪酶活力的影響Fig. 4 Response surface plots showing the effect of ratios of ingredients on the inhibition of pancreatic lipase activity by formulation

    經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析得出最佳配方為:羊棲菜水提物配比150,姜黃素配比6,安石榴苷配比3;相應(yīng)的模型預(yù)測α-葡萄糖苷酶活力抑制率為45.98%,胰脂肪酶活力抑制率為73.88%。選取預(yù)測所得的最佳配比進(jìn)行復(fù)配,測定復(fù)配配方對這兩種酶活力的抑制率。配方α-葡萄糖苷酶活力抑制率為(47.77±2.15)%,胰脂肪酶活力抑制率為(74.18±0.46)%。實際值與預(yù)測值相近,說明該模型能夠較好地預(yù)測配方最佳配比。因此,最佳配比為m(羊棲菜水提物)∶m(姜黃素)∶m(安石榴苷)=150∶6∶3。測定配方體外酶活力抑制效果,配方對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為(0.56±0.04)mg/mL和(0.210 0±0.000 3)mg/mL,優(yōu)于羊棲菜水提物單一成分。說明以羊棲菜水提物為主,復(fù)配以姜黃素、安石榴苷之后,體外抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的能力得到了很大提高。

    3 討 論

    本研究結(jié)果表明,配方組分羊棲菜水提物、姜黃素、安石榴苷均對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力有較好的抑制作用。汪財生等[29]研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜中的巖藻黃質(zhì)提取物可顯著降低肥胖小鼠體質(zhì)量和Lee’s指數(shù),具有良好的減肥作用。本研究中羊棲菜水提物對胰脂肪酶活力的IC50為(1.02±0.02)mg/mL,表現(xiàn)出了較強的輔助降血脂能力。王令充等[30]研究表明姜黃素可以顯著降低血清和肝臟中的膽固醇含量。本實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素對兩種糖脂代謝酶(α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶)活力均具有較好的抑制活力,IC50分別為(0.730 0±0.018 6)mg/mL和(0.740 0±0.028 6)mg/mL。相比之下,3 種成分中安石榴苷的酶活力抑制效果最優(yōu),對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的IC50分別為(0.420 0±0.001 3)mg/mL和(0.090 0±0.010 9)mg/mL,說明安石榴苷具有較強的降血糖、降血脂活性。3 種成分均具有開發(fā)成為輔助減肥、降糖降脂保健食品的潛力。

    利用上述3 種活性成分,以海藻水提物為主,果蔬提取物為輔進(jìn)行復(fù)配,設(shè)計綠色健康的食品配方,有助于控制血糖、血脂以及減少相關(guān)并發(fā)癥的出現(xiàn),達(dá)到輔助降糖降脂的目的,還可以促進(jìn)對藻類的開發(fā)利用。以三者對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果IC50為判別依據(jù),以配方對兩種酶活力的抑制率為評價指標(biāo),通過單因素試驗和D優(yōu)化響應(yīng)面法最終確定了海藻果蔬配方最佳配比:m(羊棲菜水提物)∶m(姜黃素)∶m(安石榴苷)=150∶6∶3。該配方體外對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的IC50分別為(0.56±0.04)mg/mL和(0.210 0±0.000 3)mg/mL。將姜黃素和安石榴苷與羊棲菜水提物復(fù)配后,對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制效果優(yōu)于單一成分羊棲菜水提物。此配方原料均為海藻、果蔬的天然產(chǎn)物,安全無毒、無害。

    雖然本研究優(yōu)化得到的海藻果蔬提取物復(fù)配最佳配方在體外有良好的輔助降糖降脂的效果,但其體內(nèi)輔助降糖降脂效果及作用機理有待進(jìn)一步探討。并且本研究中的配方組分均是從植物中分離提取的純度高的成分,不是食品原料,不能直接用于保健食品。因此,符合保健食品規(guī)格的輔助降糖降脂配方還需在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步研究和開發(fā)。

    猜你喜歡
    水提物脂肪酶糖苷酶
    鬼針草水提物對大鼠腎結(jié)石改善作用
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:39:02
    天麻水提物HPLC指紋圖譜的建立及其真?zhèn)舞b別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:38
    知母中4種成分及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    木蝴蝶提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    枇杷葉水提物的急性毒性和遺傳毒性
    脂肪酶Novozyme435手性拆分(R,S)-扁桃酸
    脂肪酶N435對PBSA與PBSH的酶催化降解和分子模擬
    中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:53
    六種花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究
    丹參水提物對缺血—再灌注心律失常大鼠的保護作用及機制
    β-葡萄糖苷酶與茶增香及抗病蟲害的研究進(jìn)展
    茶葉通訊(2014年4期)2014-02-27 07:55:49
    97热精品久久久久久| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜日韩欧美国产| 亚洲成人久久爱视频| www.999成人在线观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲不卡免费看| 欧美性感艳星| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一级黄色大片毛片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩免费av在线播放| 成人欧美大片| 青草久久国产| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美在线黄色| 欧美日韩黄片免| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产亚洲精品久久久com| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久人妻av系列| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久久久久午夜电影| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 99热精品在线国产| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲av.av天堂| 搞女人的毛片| 又爽又黄无遮挡网站| 岛国在线免费视频观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲专区中文字幕在线| 三级国产精品欧美在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 在线天堂最新版资源| 伊人久久精品亚洲午夜| 伦理电影大哥的女人| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 国产熟女xx| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲欧美日韩东京热| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本黄色片子视频| 欧美3d第一页| 一本一本综合久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产成人aa在线观看| 能在线免费观看的黄片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 如何舔出高潮| 久久草成人影院| 熟女人妻精品中文字幕| 精品人妻熟女av久视频| 久久久色成人| а√天堂www在线а√下载| 一夜夜www| 97热精品久久久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产成人啪精品午夜网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 老女人水多毛片| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美不卡视频在线免费观看| 99久久九九国产精品国产免费| av福利片在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美一级a爱片免费观看看| 成人av在线播放网站| 欧美激情在线99| 一本一本综合久久| 三级毛片av免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜精品一区二区三区免费看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 青草久久国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲最大成人手机在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 99在线人妻在线中文字幕| 精品人妻1区二区| 成人国产一区最新在线观看| 午夜福利在线在线| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品国产高清国产av| 内射极品少妇av片p| 国产精品98久久久久久宅男小说| 免费观看精品视频网站| 亚洲第一电影网av| 久久精品国产亚洲av天美| 免费黄网站久久成人精品 | 日韩欧美国产一区二区入口| 精品人妻偷拍中文字幕| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本黄大片高清| 欧美在线黄色| 亚洲内射少妇av| 久久久久久久精品吃奶| 热99re8久久精品国产| 高清在线国产一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 国内精品美女久久久久久| 热99在线观看视频| or卡值多少钱| 国产精品精品国产色婷婷| 一级作爱视频免费观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 禁无遮挡网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 男人狂女人下面高潮的视频| 中文字幕av在线有码专区| 看黄色毛片网站| 国内精品一区二区在线观看| 国产乱人视频| 我的女老师完整版在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 桃红色精品国产亚洲av| 老鸭窝网址在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 三级毛片av免费| 亚洲人成网站在线播| 中文字幕久久专区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美日韩黄片免| 又黄又爽又免费观看的视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 白带黄色成豆腐渣| 身体一侧抽搐| 久久国产乱子免费精品| 久久久久久久久久黄片| 有码 亚洲区| 少妇的逼好多水| 久久国产乱子伦精品免费另类| 2021天堂中文幕一二区在线观| 天天一区二区日本电影三级| 国产激情偷乱视频一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 91久久精品电影网| 亚洲自拍偷在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成人久久性| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 男女之事视频高清在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲五月婷婷丁香| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲av.av天堂| 久久精品影院6| 亚洲av免费在线观看| 美女黄网站色视频| 亚州av有码| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲av熟女| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产69精品久久久久777片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品久久久久久久久av| 少妇的逼好多水| 成人特级av手机在线观看| 少妇丰满av| 久久热精品热| 男人舔奶头视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一区二区三区高清视频在线| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久久久久久成人| 怎么达到女性高潮| 亚洲美女搞黄在线观看 | 欧美激情国产日韩精品一区| 又黄又爽又免费观看的视频| 婷婷精品国产亚洲av| 精品人妻偷拍中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 久久亚洲真实| x7x7x7水蜜桃| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜视频国产福利| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 黄色日韩在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 日本黄色视频三级网站网址| 波多野结衣高清无吗| 国产三级在线视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 五月玫瑰六月丁香| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品女同一区二区软件 | 丝袜美腿在线中文| 亚洲欧美日韩高清专用| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 老女人水多毛片| 亚洲午夜理论影院| 亚洲精品在线美女| 日本 av在线| 欧美一区二区亚洲| 麻豆国产av国片精品| 色尼玛亚洲综合影院| av专区在线播放| 麻豆成人av在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产高清激情床上av| 亚洲av成人av| 最近视频中文字幕2019在线8| 我要搜黄色片| 欧美成人a在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲一区二区三区不卡视频| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久成人免费电影| 舔av片在线| 久99久视频精品免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日本黄大片高清| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 中出人妻视频一区二区| 国产精品国产高清国产av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久久国产a免费观看| 能在线免费观看的黄片| 中文资源天堂在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲五月天丁香| 国产久久久一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费搜索国产男女视频| 三级毛片av免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利免费观看在线| 久久久久性生活片| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产av在哪里看| 久久6这里有精品| 国产在视频线在精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 我要搜黄色片| 9191精品国产免费久久| 麻豆国产97在线/欧美| 别揉我奶头 嗯啊视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久久九九精品影院| 亚洲av二区三区四区| 亚洲在线观看片| 热99在线观看视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人欧美大片| 一二三四社区在线视频社区8| 男人狂女人下面高潮的视频| 身体一侧抽搐| 免费观看的影片在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 舔av片在线| 怎么达到女性高潮| 亚洲av免费在线观看| 亚洲人成网站在线播| 成人av一区二区三区在线看| 国模一区二区三区四区视频| av国产免费在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 赤兔流量卡办理| 宅男免费午夜| www.熟女人妻精品国产| 色噜噜av男人的天堂激情| 热99re8久久精品国产| 麻豆成人av在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产私拍福利视频在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国内精品久久久久久久电影| 999久久久精品免费观看国产| 欧美成人性av电影在线观看| 久久久久久久久久成人| 极品教师在线免费播放| 看黄色毛片网站| 久久久久久久久久黄片| 精品人妻一区二区三区麻豆 | netflix在线观看网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美成人性av电影在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品午夜福利在线看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 性色avwww在线观看| 婷婷亚洲欧美| 欧美在线一区亚洲| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜亚洲福利在线播放| 内射极品少妇av片p| 中文字幕熟女人妻在线| 少妇的逼水好多| 97超视频在线观看视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 直男gayav资源| av国产免费在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产三级中文精品| 51国产日韩欧美| 身体一侧抽搐| 麻豆国产av国片精品| 一区二区三区激情视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产视频一区二区在线看| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美激情国产日韩精品一区| 日本免费a在线| netflix在线观看网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 97超视频在线观看视频| 亚洲在线自拍视频| 一二三四社区在线视频社区8| 九色国产91popny在线| 久久99热这里只有精品18| 性欧美人与动物交配| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美黄色淫秽网站| 国产老妇女一区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 性欧美人与动物交配| 国产老妇女一区| 国产高清视频在线观看网站| xxxwww97欧美| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲av.av天堂| 最新在线观看一区二区三区| 真实男女啪啪啪动态图| 国内精品一区二区在线观看| 最新中文字幕久久久久| 天美传媒精品一区二区| 久久99热6这里只有精品| 国产精品一区二区免费欧美| 久久精品91蜜桃| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费在线观看日本一区| 小说图片视频综合网站| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品亚洲美女久久久| 国产不卡一卡二| 麻豆国产av国片精品| 亚洲无线观看免费| 国产精品av视频在线免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 国产成人a区在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 久久亚洲真实| 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩中字成人| 国产淫片久久久久久久久 | 欧美日韩黄片免| 搡老妇女老女人老熟妇| 九色国产91popny在线| 国产野战对白在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久这里只有精品中国| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产私拍福利视频在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费高清视频大片| 看片在线看免费视频| 国产精品三级大全| 91在线观看av| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩精品中文字幕看吧| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲专区国产一区二区| 男插女下体视频免费在线播放| 动漫黄色视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 1000部很黄的大片| 很黄的视频免费| 精品人妻偷拍中文字幕| 色视频www国产| 搡老岳熟女国产| 精品久久久久久成人av| av中文乱码字幕在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看舔阴道视频| 丰满的人妻完整版| x7x7x7水蜜桃| 黄色一级大片看看| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜激情福利司机影院| 欧美不卡视频在线免费观看| 99热只有精品国产| 午夜激情欧美在线| 少妇的逼水好多| 午夜福利高清视频| 男女之事视频高清在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 看黄色毛片网站| 在线观看av片永久免费下载| 午夜亚洲福利在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 脱女人内裤的视频| 一a级毛片在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲熟妇熟女久久| 国产私拍福利视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜福利高清视频| 国产高清有码在线观看视频| 成人欧美大片| 99久久精品热视频| 很黄的视频免费| 免费av不卡在线播放| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲在线观看片| 精品人妻1区二区| 免费观看人在逋| 18禁在线播放成人免费| 毛片女人毛片| 如何舔出高潮| 男女那种视频在线观看| 国产精品国产高清国产av| 男女下面进入的视频免费午夜| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区| 91九色精品人成在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 极品教师在线免费播放| 国产69精品久久久久777片| 搞女人的毛片| 久久这里只有精品中国| 在线观看午夜福利视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲av成人av| 能在线免费观看的黄片| 中文字幕高清在线视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 搡老妇女老女人老熟妇| 人妻久久中文字幕网| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产在线精品亚洲第一网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲自偷自拍三级| bbb黄色大片| 日韩欧美在线乱码| av国产免费在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 男女之事视频高清在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 波野结衣二区三区在线| 国产私拍福利视频在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 免费看美女性在线毛片视频| 国产色婷婷99| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 老女人水多毛片| 亚洲成人久久性| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 桃色一区二区三区在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 久久中文看片网| 在线免费观看不下载黄p国产 | 成年免费大片在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| www.色视频.com| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲自拍偷在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产成人aa在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 免费搜索国产男女视频| 中文字幕高清在线视频| 波多野结衣高清作品| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久99热这里只有精品18| 免费在线观看亚洲国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品电影一区二区三区| 黄色女人牲交| 一级av片app| 成人国产一区最新在线观看| 麻豆国产av国片精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜福利欧美成人| 欧美中文日本在线观看视频| av在线蜜桃| a在线观看视频网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 无人区码免费观看不卡| 国产精品亚洲一级av第二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 丁香六月欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 能在线免费观看的黄片| 国产乱人伦免费视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲人成网站在线播| 久久热精品热| 久久午夜福利片| 国产熟女xx| 久久久久久大精品| 91在线观看av| 天美传媒精品一区二区| 757午夜福利合集在线观看| 热99在线观看视频| 免费av毛片视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产高清有码在线观看视频| 国产黄片美女视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| av天堂中文字幕网| 亚洲av免费高清在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 日韩有码中文字幕| av在线观看视频网站免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 1024手机看黄色片| 亚洲精品在线美女| 在现免费观看毛片| 国产老妇女一区| 免费搜索国产男女视频| 欧美+日韩+精品| 亚洲最大成人av| 美女被艹到高潮喷水动态| 97超视频在线观看视频| 一本精品99久久精品77| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 精品人妻视频免费看| 国内精品久久久久久久电影| 我的老师免费观看完整版| 国产亚洲精品久久久com| h日本视频在线播放| 一个人免费在线观看电影| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 88av欧美| 一本精品99久久精品77| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久草成人影院| 午夜影院日韩av| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩免费av在线播放| 国产美女午夜福利| 成人av一区二区三区在线看| 国产欧美日韩一区二区精品|