丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌的抗菌作用機(jī)制

王 明，張家濤，周 斌，丁 潔，徐趙萌，孫 彤,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司，上海 201306；3.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 臺(tái)州 318000）

水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖是引起水產(chǎn)品腐敗的主要因素之一，腐敗希瓦氏菌是水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一[1]。丁香的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類和黃酮等，揮發(fā)油相對(duì)含量為14%～20%，其中丁香酚的相對(duì)含量為78%～95%。丁香酚具有抗癌、抗氧化、抗衰老和抗菌性能[2-4]。周倩倩[5]和Devi[6-7]等研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出很好的抗菌活性。麝香草酚又稱百里（香）酚，化學(xué)名為5-甲基-2-異丙基酚，是一種單萜酚，主要存在于百里香屬植物中，也是百里香屬植物揮發(fā)油的主要成分[8]。其具有抗菌、消炎等功效[9-11]，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有很好的抗菌活性[12-13]。逄炳棟[14]的研究表明，麝香草酚分布在細(xì)胞膜的多聚糖層，通過抑制主要活性成分的合成及蛋白質(zhì)的形成，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。乳酸菌在代謝過程中會(huì)生成乳酸等有機(jī)酸，降低環(huán)境中的pH值，此過程對(duì)乳酸菌自身生長(zhǎng)無明顯影響，但可抑制有害菌增殖，未解離的有機(jī)酸通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)，在菌體內(nèi)解離釋放質(zhì)子，降低了菌體內(nèi)環(huán)境的pH值，破壞了細(xì)菌內(nèi)部的酸堿平衡，造成菌體死亡[15]。溶菌酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物等體內(nèi)，由18 種129 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量約14 000 Da，是一種天然的穩(wěn)定蛋白酶[16]。溶菌酶具有很好的抗菌性能，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌性能優(yōu)于革蘭氏陰性菌[17-18]。

應(yīng)用于食品保鮮的復(fù)合生物保鮮劑備受關(guān)注，它不僅可以減少單一保鮮劑的使用量，也可拓寬其抑菌譜，發(fā)揮其廣譜抑菌作用。王葉青等[19]研究發(fā)現(xiàn)，菊花精油和金盞花精油復(fù)配對(duì)枯草芽孢桿菌具有協(xié)同抑菌作用。Zhang Jiatao[20]和Yang Hua[21]等分別發(fā)現(xiàn)茶多酚與溶菌酶復(fù)合保鮮劑、茶多酚與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌均有協(xié)同抗菌作用。而對(duì)丁香酚復(fù)合保鮮劑的抗菌性能和抗菌機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。

本研究以水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌——腐敗希瓦氏菌為抗菌對(duì)象，選用丁香酚、丁香酚/麝香草酚、丁香酚/乳酸和丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)和生物級(jí)）為保鮮劑，研究其抗菌性能及作用機(jī)制。采用抑菌圈法表征丁香酚及其復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌的抗菌性能，通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察菌體的微觀形態(tài)變化，測(cè)定腐敗希瓦氏菌菌體細(xì)胞膜的通透性、完整性、損傷程度以及菌體內(nèi)Na＋、K＋-腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase，ATPase）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKPase）活性變化，分析丁香酚及其保鮮劑的抗菌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腐敗希瓦氏菌（ATCC 8071） 美國(guó)微生物菌種保藏中心。

半乳糖苷酶釋放法和正苯基萘胺攝入法細(xì)菌膜損傷熒光檢測(cè)試劑盒、細(xì)菌可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；超微量Na＋、K＋-ATPase測(cè)定試劑盒、AKPase測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成生物工程研究所；L-乳酸（純度為90%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溶菌酶（食品級(jí)，18 U/mg） 上海鼎盛生物科技有限公司；溶菌酶（生物級(jí)，20 000 U/mg）上海麥克林生化科技有限公司；LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂北京奧博星生物試劑有限公司；去離子水（電導(dǎo)率小于20 μS/cm）為實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3030CH型立式高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋有限公司；LQ-C5001型電子天平 上?，幮码娮涌萍加邢薰?；LRH-150型生化培養(yǎng)箱、DK-8D型恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；THZ-D型臺(tái)式恒溫振蕩箱太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；X1R型高速冷凍離心機(jī)、Legend Micro21R型臺(tái)式微量離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Victor X3型酶標(biāo)儀 上海珀金埃爾默儀器有限公司；S-4800型場(chǎng)發(fā)射SEM 日本日立公司；Jem-2100F型場(chǎng)發(fā)射TEM 日本電子公司；FE38-Meter型電導(dǎo)率儀 瑞士梅特勒-托利多公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZD-9556型脫色搖床 常州市凱航儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香酚復(fù)合保鮮劑抗菌性能測(cè)定

以體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液為溶劑，分別配制0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）丁香酚、0.1%麝香草酚、1.0%乳酸、2.4%溶菌酶（食品級(jí)）、2.4%溶菌酶（生物級(jí)）和0.15%＋0.05%丁香酚/麝香草酚、0.15%＋0.50%丁香酚/乳酸、0.15%＋1.20%丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）和0.15%＋1.20%丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）的保鮮劑溶液，并以30%乙醇溶液為對(duì)照組。參照王夢(mèng)如等[22]的方法并作適當(dāng)修改，采用牛津杯法，分別加入200 μL上述一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抗菌劑，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定各保鮮劑作用后腐敗希瓦氏菌的抑菌圈直徑。

1.3.2 腐敗希瓦氏菌微觀形態(tài)觀察

取適量新鮮菌懸液于50 mL離心管中，于3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.4）稀釋并調(diào)節(jié)菌懸液濃度至OD600nm≈0.5。取10 mL菌懸液，加入保鮮劑至所需添加水平，于28 ℃振蕩培養(yǎng)。12 h后取出部分菌懸液，參照楊麗麗[23]的方法對(duì)腐敗希瓦氏菌樣品進(jìn)行后續(xù)處理，采用離子濺射儀于20 kV下噴金3 min，再采用場(chǎng)發(fā)射SEM觀察保鮮劑處理前后菌體的微觀形態(tài)。經(jīng)染色、切片處理后，采用場(chǎng)發(fā)射TEM觀察保鮮劑處理前后菌體內(nèi)部的微觀形態(tài)。

1.3.3 腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜通透性、完整性和損傷程度測(cè)定

細(xì)胞膜通透性測(cè)定：菌體培養(yǎng)和抗菌過程參考1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)。之后每間隔一段時(shí)間測(cè)定菌懸液的電導(dǎo)率，至電導(dǎo)率不再變化為止。

細(xì)胞膜完整性測(cè)定：參考李元政等[24]方法，每20 min取0.5 mL的菌懸液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，采用酶標(biāo)儀測(cè)定濾液在260 nm波長(zhǎng)處的吸光度，至吸光度不再變化為止。

細(xì)胞膜損傷程度測(cè)定：參照正苯基萘胺攝入法細(xì)胞膜損傷熒光檢測(cè)試劑盒說明書，采用Victor X3型酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞膜外膜損傷程度；參照半乳糖苷酶釋放法細(xì)胞膜損傷熒光檢測(cè)試劑盒說明書，采用Victor X3型酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞膜內(nèi)膜損傷程度。

1.3.4 腐敗希瓦氏菌Na＋、K＋-ATPase、AKPase活力測(cè)定

在菌體培養(yǎng)、抗菌12 h后，參照超微量Na＋、K＋-ATPase活力測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行菌體樣品處理、酶促反應(yīng)及定磷實(shí)驗(yàn)并測(cè)定Na＋、K＋-ATPase活力；參照AKPase活力測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定AKPase活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 次平行，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 9.0軟件作圖。采用SPSS 19.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚復(fù)合保鮮劑抗菌性能分析結(jié)果

丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌——腐敗希瓦氏菌的抗菌性能如表1所示。丁香酚、麝香草酚、乳酸、食品級(jí)的溶菌酶作用于腐敗希瓦氏菌后，均表現(xiàn)出較好的抑菌性能，而生物級(jí)別的溶菌酶無抑菌性能。與單一保鮮劑相比，丁香酚復(fù)合保鮮劑的抑菌性能更優(yōu)。說明丁香酚與其他保鮮劑復(fù)配后，對(duì)腐敗希瓦氏菌有協(xié)同抗菌作用。

表1 丁香酚復(fù)合保鮮劑的抑菌圈直徑Table 1 Inhibitory zone diameters of eugenol-containing composite preservatives

2.2 丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌微觀形態(tài)的影響

經(jīng)丁香酚復(fù)合保鮮劑處理前后的腐敗希瓦氏菌微觀形貌如圖1所示。對(duì)照組的腐敗希瓦氏菌呈桿狀，表面光滑且個(gè)體飽滿，無形變損傷，菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁邊緣較清晰，細(xì)胞膜包裹著細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)比較均勻地分布在細(xì)胞內(nèi)（圖1A1、A2）。由圖1B1、B2可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌稍有扭曲變形，菌體中間部位的細(xì)胞壁膜破損裂開、有明顯凹陷。菌體內(nèi)部的細(xì)胞壁膜變薄甚至消失，細(xì)胞質(zhì)流失較多，菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。分析認(rèn)為，丁香酚可與細(xì)胞膜的磷脂反應(yīng)，增加細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞出現(xiàn)孔洞甚至破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，使細(xì)胞死亡，這與Devi等[7]的研究結(jié)果一致。由圖1C1、C2可見，經(jīng)丁香酚/麝香草酚處理后，腐敗希瓦氏菌出現(xiàn)了質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞壁膜溶解，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物分布不均，且有部分流失。分析認(rèn)為，可能是麝香草酚中共同存在疏水性很強(qiáng)的苯環(huán)和親水性較強(qiáng)的酚羥基，使其能夠很快融入細(xì)菌的細(xì)胞膜中，因此，丁香酚與麝香草酚復(fù)配后可增加細(xì)胞膜通透性，使膜電位降低，細(xì)菌細(xì)胞膜上的離子通道被打開或被溶解損壞，細(xì)胞破裂，菌體內(nèi)容物發(fā)生泄露[12-13,25]。由圖1D1、D2可見，經(jīng)丁香酚/乳酸處理的腐敗希瓦氏菌菌體出現(xiàn)褶皺、部分凹陷，細(xì)胞壁不完整，有溶解消失現(xiàn)象，造成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物分布不均勻，飽滿感缺失。丁香酚對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜能產(chǎn)生一定損傷，與乳酸復(fù)配后，未解離的乳酸更多地通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)，在菌體內(nèi)解離并釋放質(zhì)子，破壞細(xì)菌內(nèi)部的酸堿平衡，進(jìn)一步干擾細(xì)胞膜的正常代謝，從而對(duì)細(xì)菌的破壞進(jìn)一步加強(qiáng)[15]。

由圖1E1、E2可見，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）處理后，腐敗希瓦氏菌菌體細(xì)胞嚴(yán)重變形，褶皺加深，細(xì)胞部分萎縮，細(xì)胞壁膜損傷程度較重，造成內(nèi)容物流出，密度下降，這是丁香酚與溶菌酶協(xié)同抗菌作用的結(jié)果。丁香酚首先與腐敗希瓦氏菌細(xì)胞壁脂多糖層作用，使細(xì)胞壁肽聚糖層暴露，進(jìn)而導(dǎo)致溶菌酶將暴露于表面的肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵水解，引起細(xì)胞裂解死亡[26]。由圖1F1、F2可見，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）處理后，腐敗希瓦氏菌的菌體結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，細(xì)胞壁膜溶解嚴(yán)重，壁膜消失，細(xì)胞內(nèi)容物嚴(yán)重流失，胞內(nèi)物質(zhì)向細(xì)胞膜一側(cè)集中，并出現(xiàn)空腔。這可能是由于生物級(jí)溶菌酶比食品級(jí)溶菌酶純度更高，活力更強(qiáng)。

圖1 丁香酚復(fù)合保鮮劑處理前后腐敗希瓦氏菌的SEM和TEM圖Fig. 1 SEM and TEM images of S. putrefaciens before and after treatment with eugenol-containing composite preservative

2.3 丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜通透性及完整性的影響

細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障，保鮮劑破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜后，會(huì)引起內(nèi)部電解質(zhì)如K＋、Ca2＋、Na＋等小分子離子外泄至培養(yǎng)液，導(dǎo)致其電導(dǎo)率上升，因此，菌懸液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜通透性變化[20]。由圖2A可知，隨著保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌懸液的電導(dǎo)率逐漸上升直至趨于平穩(wěn)。經(jīng)丁香酚復(fù)合保鮮劑處理后，菌懸液的電導(dǎo)率明顯高于同期未處理樣品。說明丁香酚提高了菌體細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致菌體細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏。與單一丁香酚相比，經(jīng)丁香酚/麝香草酚復(fù)合保鮮劑處理的腐敗希瓦氏菌菌懸液的電導(dǎo)率略高，說明丁香酚與麝香草酚復(fù)配后，對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的破壞能力略有增強(qiáng)，加速了胞內(nèi)電解質(zhì)的流失，兩者具有協(xié)同抗菌作用；而經(jīng)丁香酚/乳酸復(fù)合保鮮劑處理后，腐敗希瓦氏菌菌懸液電導(dǎo)率與單一丁香酚處理樣品無明顯差異。這是由于丁香酚與乳酸復(fù)配并作用于菌體后，丁香酚首先破壞細(xì)菌外膜的磷脂、糖脂成分，打開離子通道，隨后未解離乳酸通過自由擴(kuò)散由細(xì)胞外膜進(jìn)入菌體內(nèi)，釋放質(zhì)子，干擾細(xì)菌正常代謝，而對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜組分無直接的破壞作用。經(jīng)丁香酚/溶菌酶復(fù)合保鮮劑處理后，腐敗希瓦氏菌菌懸液的電導(dǎo)率高于單一丁香酚和丁香酚/麝香草酚處理的樣品。這是由于丁香酚與腐敗希瓦氏菌細(xì)胞壁脂多糖層作用后，使細(xì)胞壁肽聚糖層暴露，而后溶菌酶水解暴露于表面的肽聚糖中的β-1,4-糖苷鍵，因兩者具有協(xié)同增效作用，加速了細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的流失[17]。在處理初期，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）處理后的腐敗希瓦氏菌菌液電導(dǎo)率明顯高于丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）處理樣品，這可能是因?yàn)槭称芳?jí)溶菌酶中含有部分其他抗菌劑，發(fā)揮了較好的抗菌性能。在處理后期，丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）處理的菌懸液電導(dǎo)率最高，這可能是因?yàn)槎∠惴幼饔煤?，使腐敗希瓦氏菌?xì)胞壁的肽聚糖層充分暴露，溶菌酶的作用就更加出色。同時(shí)，生物級(jí)溶菌酶的純度和酶活性較高，對(duì)菌體細(xì)胞壁的破壞能力更強(qiáng)。

圖2 丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜通透性（A）及完整性（B）的影響Fig. 2 Effect of eugenol-containing composite preservatives on cell membrane permeability (A) and cell membrane integrity (B) of S. putrefaciens

通常情況下，細(xì)菌細(xì)胞膜控制細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)自由進(jìn)出，細(xì)菌細(xì)胞壁膜的微孔道只能透過粒徑小于1 nm的分子，而蛋白質(zhì)和核酸等大分子無法透過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，在細(xì)胞膜遭受損傷后，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)極易發(fā)生外滲，包括K＋、PO43－等小分子物質(zhì)和DNA、RNA等大分子物質(zhì)，由于DNA和RNA在260 nm波長(zhǎng)處具有很高的摩爾吸光系數(shù)，因此被稱為260 nm吸收物質(zhì)，可通過測(cè)定260 nm吸收物質(zhì)吸光度確定細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性[27]。由圖2B可見，隨著保鮮劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，腐敗希瓦氏菌菌懸液的吸光度逐漸上升。對(duì)照組菌懸液的吸光度上升較慢；經(jīng)丁香酚處理初期，菌懸液的吸光度上升速率增加緩慢，而在200 min后，其上升速率加快，明顯高于未處理的腐敗希瓦氏菌，說明丁香酚對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜具有一定的破壞能力，但作用于菌體后不能立刻使細(xì)胞膜破壞，而作用一定時(shí)間后才能破壞菌體細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)流出。采用丁香酚復(fù)合保鮮劑處理后，菌懸液的吸光度上升加快，其中丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）處理的菌懸液吸光度上升最快，丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）和丁香酚/麝香草酚次之，丁香酚/乳酸較慢，但高于單一丁香酚處理的樣品，說明麝香草酚、溶菌酶和乳酸與丁香酚復(fù)配后對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜的破壞能力增強(qiáng)，具有協(xié)同破壞能力。經(jīng)分析認(rèn)為乳酸以未解離的有機(jī)酸分子形式通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌，在細(xì)菌體內(nèi)解離并釋放出質(zhì)子，降低了細(xì)菌內(nèi)的pH值，破壞了細(xì)菌內(nèi)部的酸堿平衡，造成菌體死亡[15]。同時(shí)，乳酸解離后，引起細(xì)胞內(nèi)酸性離子增多，增大細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)菌破裂死亡[28]，此外，乳酸解離會(huì)使細(xì)胞內(nèi)某些酶鈍化或變性，影響細(xì)菌體內(nèi)大分子物質(zhì)的合成，進(jìn)而使細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖和代謝受到抑制，甚至死亡[29]，故丁香酚與乳酸復(fù)配后可加速菌體內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)流出。同時(shí)，乳酸是在丁香酚破壞細(xì)胞外膜后才大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的，所需的作用時(shí)間較長(zhǎng)，故其菌懸液的吸光度上升較慢。由于丁香酚和麝香草酚復(fù)配后可使膜電位差降低，增加細(xì)胞膜通透性，打破了菌體原有的保護(hù)屏障，從而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏增加[7,12-13]。因此，采用丁香酚/麝香草酚處理后，腐敗希瓦氏菌菌懸液的吸光度高于同期丁香酚處理的樣品。而溶菌酶可水解經(jīng)丁香酚作用后暴露于細(xì)菌表面的細(xì)胞壁肽聚糖中的β-1,4-糖苷鍵，增加了對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞程度，從而導(dǎo)致胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏增加。因此，采用丁香酚/溶菌酶處理后，菌懸液的吸光度較高。又由于食品級(jí)溶菌酶中含有其他抑菌劑，對(duì)腐敗希瓦氏菌膜的損傷能力更大，因此采用丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）處理后，菌懸液的吸光度最高。

2.4 丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞膜損傷程度的影響

當(dāng)細(xì)胞膜遭到損害時(shí)，正苯基萘胺能夠進(jìn)入外膜磷脂層，可通過其產(chǎn)生的藍(lán)色熒光評(píng)價(jià)細(xì)菌外膜的損傷程度。由圖3A可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌的外膜通透性增加。經(jīng)丁香酚/麝香草酚和丁香酚/乳酸處理后，菌體的外膜通透性進(jìn)一步增加，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）處理后，菌體的外膜通透性低于單一丁香酚處理的樣品。而經(jīng)丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）處理后，菌體的外膜通透性增加最顯著。分析認(rèn)為，麝香草酚、乳酸與丁香酚一樣具有對(duì)細(xì)胞膜外膜的破壞能力，且與丁香酚復(fù)合后其破壞能力增強(qiáng)。此外，生物級(jí)溶菌酶在丁香酚作用后，對(duì)細(xì)胞膜外膜的破壞能力更強(qiáng)，兩者具有協(xié)同增效作用。

圖3 丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌細(xì)胞外膜（A）、內(nèi)膜（B）通透性的影響Fig. 3 Effect of eugenol-containing composite preservatives on extracellular membrane (A) and intracellular membrane (B) integrity of S. putrefaciens

菌懸液中β-半乳糖苷酶的熒光強(qiáng)度與細(xì)菌內(nèi)膜的破損程度呈正相關(guān)。由圖3B可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌的內(nèi)膜被破壞。與丁香酚相比，丁香酚與麝香草酚或溶菌酶復(fù)配后，腐敗希瓦氏菌的內(nèi)膜損傷更嚴(yán)重，且丁香酚/麝香草酚對(duì)菌體細(xì)胞內(nèi)膜的損傷程度最大。這是由于在麝香草酚的疏水性和親水性基團(tuán)共同作用下，對(duì)菌體細(xì)胞膜的內(nèi)膜破壞能力更強(qiáng)，且二者發(fā)揮了協(xié)同增效作用。而丁香酚和溶菌酶在協(xié)同破壞細(xì)胞外膜之后，兩者也會(huì)共同作用于細(xì)胞內(nèi)膜，促進(jìn)了菌體內(nèi)膜的破壞。用丁香酚/乳酸處理后，對(duì)腐敗希瓦氏菌內(nèi)膜的破壞沒有顯著差異，這可能是由于丁香酚含量較少，且乳酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜無破壞能力。

2.5 丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌體內(nèi)Na＋、K＋-ATPase和AKPase活力的影響

由圖4A可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力顯著降低，說明丁香酚能夠降低菌體的Na＋、K＋-ATPase活力。與丁香酚相比，經(jīng)丁香酚/麝香草酚和丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）處理后，腐敗希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力顯著提高，這可能是由于麝香草酚和食品級(jí)溶菌酶中的活性抗菌成分主要作用于細(xì)菌壁膜，而對(duì)菌體Na＋、K＋-ATPase的活性影響較小。經(jīng)丁香酚/乳酸和丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）處理的腐敗希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力遠(yuǎn)低于單一丁香酚處理的樣品，說明乳酸進(jìn)入細(xì)胞后可作用于Na＋、K＋-ATPase，使其活性降低。而生物級(jí)溶菌酶在丁香酚破壞細(xì)胞外膜脂多糖層后，與其協(xié)同破壞細(xì)胞膜其他組分，使菌體被嚴(yán)重破壞，菌體內(nèi)的Na＋、K＋-ATPase失去正常發(fā)揮作用的環(huán)境，表現(xiàn)出Na＋、K＋-ATPase活力總體降低。

圖4 經(jīng)丁香酚復(fù)合保鮮劑處理對(duì)腐敗希瓦氏菌Na＋、K＋-ATPase（A）、AKPase（B）活力的影響Fig. 4 Effect of eugenol-containing composite preservatives on Na+,K+-ATPase (A) and AKPase (B) activities of S. putrefaciens

由圖4B可見，經(jīng)丁香酚處理的腐敗希瓦氏菌AKPase活力顯著降低，說明丁香酚能顯著抑制菌體AKPase活性，這與儀淑敏[30]的研究結(jié)果相似。分析認(rèn)為，丁香酚在破壞菌體細(xì)胞壁膜后進(jìn)入內(nèi)環(huán)境，作用于AKPase，降低了AKPase活性，從而抑制了菌體的生長(zhǎng)和代謝。與丁香酚相比，丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)AKPase活性的抑制能力更強(qiáng)，說明麝香草酚、乳酸和溶菌酶菌與丁香酚存在協(xié)同效應(yīng)，使其對(duì)AKPase活性的抑制能力增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

丁香酚分別與麝香草酚、乳酸和溶菌酶復(fù)配后，對(duì)腐敗希瓦氏菌均具有協(xié)同抗菌作用，使菌體結(jié)構(gòu)損傷加劇。丁香酚及其復(fù)合保鮮劑對(duì)菌體的作用機(jī)制略有不同。丁香酚與溶菌酶（生物級(jí)）復(fù)配后，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的破壞能力最大。丁香酚與乳酸復(fù)配后，對(duì)Na＋、K＋-ATPase活力的抑制更加顯著。丁香酚與不同級(jí)別溶菌酶復(fù)配后，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜完整性，顯著增加細(xì)胞膜通透性。而由于兩種級(jí)別溶菌酶的純度和酶活性存在差異，丁香酚/溶菌酶（生物級(jí)）復(fù)合保鮮劑可顯著增加細(xì)菌內(nèi)、外膜的通透性，且對(duì)Na＋、K＋-ATPase、AKPase活性的抑制作用最強(qiáng)，而丁香酚/溶菌酶（食品級(jí)）復(fù)合保鮮劑主要增加細(xì)胞內(nèi)膜通透性，而對(duì)細(xì)胞外膜通透性的影響較弱。本實(shí)驗(yàn)研究了丁香酚復(fù)合保鮮劑對(duì)水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌——腐敗希瓦氏菌的抗菌性能，并闡明了其抗菌機(jī)理，可為提高丁香酚復(fù)合保鮮劑的性能并減少其使用量、降低生產(chǎn)成本提供參考。本研究結(jié)果可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮方面，具有廣闊的市場(chǎng)前景。