Lam和TDF治療乙肝患者病毒耐藥基因研究

陳紅，劉慶豐，張要鋒，李慧，呂丹，李婷

（1.焦作市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 焦作 454000；2.焦作市疾病預(yù)防控制中心，河南 焦作 454000；3.焦作市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，河南 焦作 454001）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）所致慢性乙型肝炎臨床上常用核苷酸類似物（Nucleos(t)ide Analogues，NAs）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HBV聚合酶抑制其活性來治療[1]。但長(zhǎng)期藥物治療使得病毒產(chǎn)生耐藥性是一個(gè)普遍的問題，耐藥基因突變多發(fā)生在HBV聚合酶基因的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域，并在病毒復(fù)制過程中隨機(jī)出現(xiàn)[2]。同時(shí)，耐藥基因突變的乙肝病毒株會(huì)感染他人[3],而且改變乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）氨基酸序列，HBsAg突變導(dǎo)致抗體逃逸并成功感染接種HBV疫苗個(gè)體[4]。替諾福韋酯（TenofovirDisoprox，TDF）是目前臨床上耐藥率較低的一線用藥[5]。據(jù)報(bào)道，在接受拉米夫定（Lamivudine，Lam）單藥治療或聯(lián)合替諾福韋酯治療的乙肝患者中，其中37.37%感染帶有耐藥基因突變的HBV[6]。研究發(fā)現(xiàn)rtL180M突變和rtM204V突變與基因A，B和C型乙肝病毒顯著相關(guān)[7]。此外，HBV基因分型不同其在LAM耐藥的基因突變位點(diǎn)上也有所不同[8]。另一項(xiàng)研究表明，由于LAM耐藥，基因C型與移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)率更高相關(guān)[9]。因此本研究通過分析本地區(qū)60例慢性乙肝患者的基因型和耐藥基因突變位點(diǎn)，探討HBV耐藥基因突變位點(diǎn)和特征，鑒定有意義的突變以期更好治療乙肝患者。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象2017年至2019年之間我院肝病科60名治療一年以上乙肝患者，收集患者的性別、年齡、AST、ALT和AFP信息。患者自愿接受治療并簽署知情同意書，該研究得到當(dāng)?shù)貍惱韺彶槲瘑T會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2010版中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)慢性乙型肝炎防治指南；患者在納入研究前至少6個(gè)月均為HBsAg陽性；其中基因A型乙肝患者采用替諾福韋酯治療，所有患者均聯(lián)合γ-干擾素治療；從未接觸過任何抗HIV藥物。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 甲、丙、丁和戊型肝炎；HIV檢測(cè)呈陽性。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 所有患者根據(jù)指南給予對(duì)癥、支持以及防治并發(fā)癥等治療。拉米夫定組100mg/d治療和替諾福韋酯100mg/d替諾福韋酯300mg/d，兩組患者療程均為一年及以上。

1.2.2 標(biāo)本采集 抗凝試管采集患者靜脈5ml血液。將血液以3,000r/min的速度離心10分鐘，分離血清并儲(chǔ)存在-20°C直到使用。

1.2.3 熒光定量PCR定量檢測(cè)HBV DNA核酸載量HBV DNA提取和定量使用QiaAmp DNA mini試劑（QIAGEN，Hilden，德國），按照使用操作說明從血清樣品中提取HBV DNA,并將提取的DNA洗脫在50ml洗脫緩沖液中。加入PCR反應(yīng)試管后，HBV DNA通過熒光實(shí)時(shí)PCR分析進(jìn)行檢測(cè)分析。HBV DNA片段在25μl范圍內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5μl模板DNA(20ng),0.5μl Taq DNA聚合酶(1.25U),2.5μl V3F和V3R引 物(5pmol)，2.5μl MgCl2（50 mmol/L），2.5μl Taq緩沖液（Mg2+去除），0.5μl dNTP和13.5μl ddH2O。擴(kuò)增條件如下：94℃3分鐘；30個(gè)循環(huán),分別為94°C 1分鐘,65°C 1分鐘和72°C 1分鐘；最后的延伸步驟是在72°C下進(jìn)行8分鐘。

1.2.4 基因型分析采用Sanger測(cè)序法 采用Sanger測(cè)序法對(duì)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序信息結(jié)果比對(duì)NCBI標(biāo)準(zhǔn)株信息序列進(jìn)行基因型分組。

1.2.5 DNA反相斑點(diǎn)雜交芯片檢測(cè)HBV常見耐藥位點(diǎn)60例患者的HBV DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)RT區(qū)域進(jìn)行突變分析。HBV聚合酶RT區(qū)域的突變分析僅限于域A到E的氨基酸，包括位于域BC和C-D之間的氨基酸。

1.2.6 微粒子化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBs Ag含量 采用乙型肝炎病毒s抗原(HBs-Ag)檢測(cè)試劑盒（倍愛康生物技術(shù)有限公司，北京）對(duì)患者血清進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用()來表示，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床基線資料 研究結(jié)果顯示，HBV基因B型22例、C型19例、D型6例、B+C混合型7例和其它型6例。HBV基因D型感染患者年齡較其他型更高，各個(gè)基因型中男性患者感染均不少于女性患者數(shù)量，AST和ALT水平在各基因型差異不明顯，B基因型患者AFP水平最高，但與其它組之間差異不明顯，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBV DNA和HBsAg指標(biāo)各組差異不明顯。見表1。

表1 患者臨床基線資料

2.3 患者治療前乙肝病毒分型與耐藥基因位點(diǎn)關(guān)系4例（18.2%）基因B型患者耐藥基因突變位點(diǎn)有rtA181T、rtN194T、rtM204V和rtL180M。基因C型3例（15.7%）患者耐藥基因突變位點(diǎn)為rtV191、rtN236T和rtM204V。另外，有12名患者（20.0%）在不同基因位點(diǎn)發(fā)生耐藥突變，其中單堿基突變占52.6%（10/19），多堿基突變占10.5%（2/19）。在單堿基突變中，rtL180M，rtM204V和rtA181T的突變率較高。

2.4 患者經(jīng)拉米夫定與替諾福韋酯治療后耐藥基因突變位點(diǎn)差異B基因型15例（68.1%）和C基因型9例(47.4%),有11名其他基因型患者(57.9%)在不同位點(diǎn)具有耐藥突變，其中單堿基突變占42.1%（8/19），多堿基突變占15.9%（3/19）。在單堿基突變中,rtL180M、rtM204V、sW172和rtA181T的患病率較高。見表3。

表3 患者經(jīng)拉米夫定與替諾福韋酯治療后耐藥基因突變位點(diǎn)差異

2.5 治療后突變頻率與HBsAg濃度的相關(guān)性 一元線性回歸分析患者治療前后基因突變頻率增加與HbsAg濃度的增加相關(guān)性，結(jié)果如下表4，5?；貧w系數(shù)估值為3.258(P＜0.05),95%CI(1.415-3.658)，線性回歸方程可表示為Y=11.254+3.258，R方=0.766，預(yù)測(cè)效果較好。

表4 調(diào)整R方值表

3 討論

臨床結(jié)果顯示乙肝抗病毒治療效果不佳可能是由感染耐藥基因變異的HBV引起的，尤其是HBV RT結(jié)構(gòu)域的突變，耐藥性基因突變不僅會(huì)導(dǎo)致NAs無法抑制HBV復(fù)制，還會(huì)導(dǎo)致癌變，盡管癌變發(fā)生頻率較低[10,11]。感染耐藥基因突變HBV患者肝功能較差并且病毒量較高,上述患者面臨病情發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌等風(fēng)險(xiǎn)。耐藥突變的存在可能不會(huì)立即引起病毒載量增加和ALT升高[12]。耐藥基因突變需要長(zhǎng)期NAs藥物治療，這使患者乙肝病毒對(duì)于核苷類似物的耐藥基因突變概率上升，這與李曉東等人研究結(jié)果一致[13]。本研究結(jié)果顯示核苷類似物誘導(dǎo)的抗性突變的發(fā)生率高達(dá)45.1%（32/71），單堿基突變占主導(dǎo)地位，占56.25%(18/32),多堿基突變較少。另外,年齡和性別與HBV耐藥突變無關(guān)，本研究結(jié)果與高萬芹等人[14]研究結(jié)果相符。

表2 患者治療前HBV基因型出現(xiàn)耐藥基因位點(diǎn)突變

表5 患者治療前后基因突變頻率增加與HbsAg濃度的相關(guān)性研究

與LAM抗性相關(guān)聚合酶區(qū)域中的突變可導(dǎo)致包膜區(qū)域（S）變化，由于基因突變疊加，導(dǎo)致HBsAg蛋白抗原性降低[15,16]。有趣的是，與感染基因D型乙肝病毒患者相比，基因B型患者更容易在S區(qū)中出現(xiàn)耐藥基因突變[17]。LAM治療患者中出現(xiàn)耐藥突變病毒株比未接受過治療的患者更為常見，LAM耐藥基因突變的主要位點(diǎn)是rtL180M、rtN236T和rtA181T[18]。本研究結(jié)果表明慢性乙型肝炎患者對(duì)拉夫米定耐藥率較高,這可能與近期在臨床實(shí)踐中大規(guī)模使用拉夫米定或者是因?yàn)槔蛎锥ㄊ亲笮塑疹愃莆镉嘘P(guān)。李志強(qiáng)等[19]證明HBV LAM抗藥性病毒株在LAM停藥后表現(xiàn)出較短的持久性，而檢測(cè)LAM抗藥性突變的可能性與LAM停藥后的時(shí)間跨度成反比[20]。在使用拉米夫定的治療過程中，rtA181T/rtL180M突變病毒株基因復(fù)制能力加強(qiáng)，這表明該突變病毒株基因復(fù)制能力依賴于拉米夫定。rtL180M的突變與HBV的基因型密切相關(guān)，rtL180M突變被認(rèn)為是補(bǔ)償性或繼發(fā)性突變，可以增加病毒復(fù)制的適應(yīng)性[21]。在本研究中，PCR測(cè)序結(jié)果表明聚合酶RT區(qū)域中攜帶突變的HBV病毒株的存在較常見，因?yàn)槠渲?3.3%（20/60）被至少一類耐藥基因突變的HBV感染。同樣，必須進(jìn)一步評(píng)估rtL180M突變?cè)诳剐酝蛔冎械淖饔?。在本研究中，?0.0%在HBV病毒株中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)存在基因突變。本研究中替諾福韋酯耐藥基因 突 變 位 點(diǎn) 多 為sW182、rtN194T、rtV191I和sW172。其中rtM204V突變?cè)贐、C、D、和B+C混合型中均出現(xiàn)，提示其為多發(fā)突變。Tong等[22]報(bào)道rtV191I/sW182突變削弱Huh7細(xì)胞中HBV的復(fù)制能力。這種缺陷可以通過在HBeAg（-）隱匿型乙肝患者中發(fā)現(xiàn)伴隨核心啟動(dòng)子突變來恢復(fù),這表明rtV191I/sW182基因位點(diǎn)突變可能在HBeAg（+）患者中更容易存活。rtA181T/sW172和rtV191I/sW182突變體需要進(jìn)行更多的研究來闡述耐藥基因突變病毒株的存活于基因突變的關(guān)系[23]。但是，相關(guān)研究表明這三個(gè)突變體可能會(huì)破壞病毒顆粒的分泌，導(dǎo)致HBV表面抗原蛋白和血清HBV DNA水平降低以及致癌作用[24]。

感染耐藥性基因突變乙肝病毒的患者體內(nèi)的HBV病毒量也因?yàn)椴《灸退幮远黾?，有利于傳播具有更高適應(yīng)性的抗性乙肝病毒株。劉艾芹等人研究調(diào)查5種核苷類似物之間的交叉耐藥，旨在為核苷類似物的合理臨床使用提供證據(jù)，結(jié)果顯示拉米夫定和替比夫定之間，恩替卡韋和拉米夫定之間以及恩替卡韋和替比夫定之間存在交叉耐藥，表明一旦乙型肝炎患者發(fā)現(xiàn)病毒耐藥基因突變，則必須聯(lián)合治療[25]。由于未接受過治療的患者攜帶具有耐藥突變的病毒株，因此必須質(zhì)疑是否值得用對(duì)該突變產(chǎn)生耐藥的藥物進(jìn)行治療?？偠灾b別對(duì)核苷酸類似物耐藥的乙肝患者HBV序列中的基因突變位點(diǎn)，以便識(shí)別潛在的乙肝病毒基因耐藥患者，指導(dǎo)臨床用藥。