HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者的HBsAg確證及歸隊(duì)檢測(cè)分析

任本春，周曉真，卓孝福

（福建省血液中心，福建 福州 350004）

采供血機(jī)構(gòu)為阻止HBV輸血傳播，對(duì)病毒標(biāo)志物HBsAg和HBV-DNA進(jìn)行篩查。HBsAg是HBV感染后的特異性血清學(xué)標(biāo)志物,檢測(cè)方法通常為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。由于ELISA可因cut-off設(shè)置、內(nèi)源性以及外源性因素干擾而造成HBsAg假陽(yáng)性[1],HBsAg ELISA試劑盒說(shuō)明書提出，對(duì)檢測(cè)結(jié)果反應(yīng)性標(biāo)本，應(yīng)行中和確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)行確證，以排除可能的假陽(yáng)性。與電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法比較，ELISA仍可篩查出絕大部分HBsAg陽(yáng)性獻(xiàn)血者[2]；中和確認(rèn)試驗(yàn)是HBsAg確證試驗(yàn)，可作為判斷HBsAg是否真陽(yáng)性的參考標(biāo)準(zhǔn)。HBV-DNA是HBV感染4-5周后，可在血液中檢出的標(biāo)志物，檢測(cè)方法一般包括PCR和TMA。HBV-DNA檢測(cè)不僅可以縮短HBV感染窗口期，還可以檢出隱匿性HBV感染（OBI）[3-6]。有些HBV感染者血液只存在HBsAg等血清學(xué)標(biāo)志物，不存在或存在極低載量HBV-DNA,ELISA和NAT平行檢測(cè)時(shí)，可出現(xiàn)HBsAg+/HBV-DNA-結(jié)果，但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間仍有部分獻(xiàn)血者轉(zhuǎn)為顯性HBV感染，轉(zhuǎn)變?yōu)镠BsAg+/HBV-DNA+[7,8]。此外，在獻(xiàn)血者屏蔽和歸隊(duì)管理工作中,會(huì)對(duì)HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者進(jìn)行歸隊(duì)檢測(cè)，根據(jù)歸隊(duì)檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估獻(xiàn)血者是否恢復(fù)獻(xiàn)血資格。

為了解HBsAg+/HBV-DNA-、HBsAg可疑結(jié)果/HBV-DNA-（ELISA檢測(cè)S/CO值在0.900-0.999）獻(xiàn)血者其HBsAg的S/CO檢測(cè)值與中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果之間關(guān)系以及HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者歸隊(duì)檢測(cè)情況，探討HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者HBsAg確證的必要性及其歸隊(duì)策略，本研究收集兩種標(biāo)本⑴HBsAg+/HBV-DNA-標(biāo)本，⑵HBsAg可疑結(jié)果/HBV-DNA-標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)，并對(duì)HBsAg S/CO檢測(cè)值、中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果以及部分HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者歸隊(duì)檢測(cè)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源2014年1月－2017年3月在本中心無(wú)償獻(xiàn)血者269421名（次），每位獻(xiàn)血者均抽2管標(biāo)本，1管EDTA-K2抗凝真空采血管抽取5 ml用于酶免檢測(cè)，1管EDTA-K2抗凝真空采血管抽取8ml用于核酸檢測(cè)。HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)采用HBsAg+/HBV-DNA-及HBsAg結(jié) 果 可 疑/HBVDNA-獻(xiàn)血者樣本血漿，在-80℃保存。歸隊(duì)體檢標(biāo)本為HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者后續(xù)歸隊(duì)留取,采集標(biāo)本程序同獻(xiàn)血者標(biāo)本，用于ELISA/NAT平行檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器HBsAg試劑盒由DiaSorin S.p.A.UK branch提供。HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)試劑由DiaSorin S.p.A.UK branch Murex提供。核酸聯(lián)合單人份檢測(cè)試劑及HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA鑒別試劑盒由西班牙Grifols公司提供。ELISA法所用試劑均為國(guó)家批批檢合格且均在有效期內(nèi)使用。HBsAg質(zhì)控物質(zhì)由康徹斯坦生物公司提供，濃度為0.2 IU/ml。HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由康徹斯坦生物公司提供，濃度30IU/ml。全自動(dòng)加樣系統(tǒng)MICROLAB STAR和酶免反應(yīng)設(shè)備Micro Lab FAME均由瑞士Halmiton公司提供，核酸檢測(cè)設(shè)備Procleix TIGRIS System由西班牙Grifols公司提供。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 HBsAg與病毒核酸篩查 所有標(biāo)本采用平行ELISA/NAT檢測(cè)模式。HBsAg采用ELISA檢測(cè)。NAT采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)（TMA），采用HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA病毒聯(lián)合單人份檢測(cè)，反應(yīng)性標(biāo)本需進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，以區(qū)分感染病毒類別。

1.3.2 HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn) 將所保存的標(biāo)本復(fù)融后，進(jìn)行中和確認(rèn)試驗(yàn)。對(duì)每一標(biāo)本，在HBsAg診斷試劑盒的微孔板上設(shè)置對(duì)照孔和特異孔。在對(duì)照孔和特異孔分別加入不含抗-HBs的特異性抗體試劑和樣本進(jìn)行反應(yīng)。特異孔中的特異性抗體和微孔板中的固相抗-HBs抗體競(jìng)爭(zhēng)樣本中的HBsAg，從而使結(jié)合到微板上的HBsAg量減少；而對(duì)照孔因不存在競(jìng)爭(zhēng),樣本中的量正常結(jié)合到微孔板,隨后按HBsAgELISA診斷試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 病毒核酸鑒別試驗(yàn) 將核酸篩查反應(yīng)性標(biāo)本進(jìn)行HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA鑒別試驗(yàn)，以準(zhǔn)確區(qū)分感染病毒類別。鑒別試驗(yàn)結(jié)果為HBV-DNA陽(yáng)性，方可確定為HBV-DNA陽(yáng)性。如果鑒別結(jié)果均為陰性，定義為不確定性。

1.3.4 歸隊(duì)檢測(cè)HBsAg+/HBV-DNA-歸隊(duì)獻(xiàn)血者按照獻(xiàn)血者標(biāo)本采集程序采集血樣進(jìn)行常規(guī)血清學(xué)篩查、核酸篩查以及核酸鑒別試驗(yàn)。

1.3.5 結(jié)果判定HBsAg S/CO值＜0.9為無(wú)反應(yīng)性，判為合格。S/CO值≥1為反應(yīng)性，判為不合格。S/CO值在0.900～0.999之間，結(jié)果判為可疑。判為可疑結(jié)果標(biāo)本進(jìn)行雙孔復(fù)查，兩孔S/CO值均小于0.9為無(wú)反應(yīng)性，只要其中1孔為反應(yīng)性或可疑均判為不合格。HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)按試劑說(shuō)明書要求計(jì)算中和率，以中和率50%為確證陽(yáng)性。NAT試驗(yàn)為HBV、HCV、HIV聯(lián)合單人份檢測(cè)，OD值≥cut-off值判斷為有反應(yīng)性，經(jīng)鑒別試驗(yàn)后區(qū)分HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA。

1.3.6 質(zhì)量控制 每天進(jìn)行室內(nèi)控制。HBsAg質(zhì)控品隨同標(biāo)本檢測(cè)，質(zhì)控值>均值-3SD試驗(yàn)有效。NAT檢測(cè)按照試劑說(shuō)明書判讀結(jié)果的有效性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，繪制ROC曲線，計(jì)算ROC曲線下面積（AUC）,以AUC＞0.9認(rèn)為診斷有準(zhǔn)確性。組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBsAg、HBV-DNA檢出情況 在2014年1月-2017年3月期間檢出HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者標(biāo)本499例，檢出率為0.185%（499/269421）；檢出HBsAg結(jié)果可疑/HBV-DNA-獻(xiàn)血者標(biāo)本62份，檢出率為0.023%（62/269421）。

2.2 HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)499例HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行中和確認(rèn)試驗(yàn)，確證陽(yáng)性346例，確證陽(yáng)性率為69.3%，假陽(yáng)性率30.7%。以HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果為診斷參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)ELISA檢測(cè)的S/CO值進(jìn)行分組，各組中和確認(rèn)試驗(yàn)確證陽(yáng)性率隨S/CO值增加而增高，其陽(yáng)性率從7.5%升高到91.2%，見表1。

表1 499例HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)確證結(jié)果

2.3 HBsAg結(jié)果可疑/HBV-DNA-獻(xiàn)血者標(biāo)本中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)62例HBsAg結(jié)果可疑/HBVDNA-獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)，除2例為確證陽(yáng)性之外，其余60例結(jié)果為陰性。

2.4 ROC曲線繪制 將ELISA S/CO值及中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)入SPSS20.0，進(jìn)行ROC曲線分析，ROC線下面積（AUC）為0.934，以AUC＞0.9認(rèn)為診斷有準(zhǔn)確性。Youdeng指數(shù)取最大時(shí)最佳截?cái)郈O值（S/CO）為1.60，比試劑廠家推薦的CO值高。最佳截?cái)郈O值時(shí)其靈敏度為95.4%，特異性為80.6%，見圖1。

圖1 S/CO ROC曲線

2.5 歸隊(duì)檢測(cè)結(jié)果86例HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者參加歸隊(duì)檢測(cè)，2.4%(2/86)獻(xiàn)血者檢測(cè)結(jié)果由HBsAg+/HBV-DNA-轉(zhuǎn)為HBsAg+/HBV-DNA+，67.4%(58/86)獻(xiàn)血者檢測(cè)結(jié)果由HBsAg+/HBVDNA-轉(zhuǎn)為HBsAg-/HBV-DNA-，30.2%(26/86)獻(xiàn)血者檢測(cè)結(jié)果保持HBsAg+/HBV-DNA-不變。2例獻(xiàn)血者HBV-DNA陽(yáng)轉(zhuǎn)情況，見表2。

表2 2例HBsAg+/HBV-DNA-轉(zhuǎn)為HBsAg+/HBV-DNA+的獻(xiàn)血者情況

3 討論

HBV可經(jīng)血液和血制品傳播，是我國(guó)《血站標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》規(guī)定的強(qiáng)制檢驗(yàn)項(xiàng)目，可采用ELISA、化學(xué)發(fā)光法篩查HBsAg及NAT篩查HBV-DNA。ELISA篩查HBsAg由于操作簡(jiǎn)單、敏感性高、成本低廉，適用于大批量標(biāo)本，但也受方法學(xué)、內(nèi)外源干擾因素的影響，可造成假陽(yáng)性。劉孫琴[9]等報(bào)告HBsAg反應(yīng)性標(biāo)本必須經(jīng)中和確認(rèn)試驗(yàn)確證后方可報(bào)告HBsAg陽(yáng)性。WHO頒布的《篩查獻(xiàn)血者血液經(jīng)輸血傳播感染的建議書》，要求血站實(shí)驗(yàn)室開展篩查和確認(rèn)試驗(yàn),分別用于血液篩查和獻(xiàn)血者管理[10]。

2014年1月-2017年3月檢出499例HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者標(biāo)本,檢出率為0.185%（499/269421），經(jīng)HBsAg中和確認(rèn)驗(yàn)后，確認(rèn)HBsAg真陽(yáng)性346例，確證陽(yáng)性率69.3%。這提示：⑴即使HBV-DNA檢測(cè)陰性，如果不進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，仍有相當(dāng)部分獻(xiàn)血者存在HBV漏檢可能。因此應(yīng)重視血清學(xué)HBsAg檢測(cè)，⑵對(duì)于弱反應(yīng)性S/CO值在1.0～1.29和1.30～2.99獻(xiàn)血者標(biāo)本,中和確認(rèn)試驗(yàn)確證陽(yáng)性率分別為7.5%，49.0%,HBsAg假陽(yáng)性率分別為92.5%、51.0%。這些弱反應(yīng)性獻(xiàn)血者如果未進(jìn)行中和確認(rèn)試驗(yàn),采供血機(jī)構(gòu)會(huì)將這些獻(xiàn)血者永久屏蔽，這不但會(huì)造成獻(xiàn)血者流失，還會(huì)給其帶來(lái)心理壓力，引起抱怨和投訴，不利于血液事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，我們認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系，從人、機(jī)、料、法、環(huán)方面著手，制定科學(xué)的SOP，加強(qiáng)工作人員培訓(xùn)，對(duì)設(shè)備定期進(jìn)行有效的維護(hù)和校準(zhǔn),使用前對(duì)試劑進(jìn)行科學(xué)的性能評(píng)價(jià)、選擇靈敏度和特異性高的HBsAg酶免試劑盒,加強(qiáng)檢測(cè)前標(biāo)本質(zhì)量控制，減少標(biāo)本凝塊、溶血和標(biāo)本污染產(chǎn)生,在提高檢測(cè)準(zhǔn)確性時(shí)盡量減少假陽(yáng)性產(chǎn)生。HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)是以HBsAg酶免篩查反應(yīng)性的血液標(biāo)本進(jìn)行的確證實(shí)驗(yàn)，可以滿足獻(xiàn)血者管理的需要。對(duì)于存在非特異性或生物學(xué)假陽(yáng)性篩查結(jié)果應(yīng)向獻(xiàn)血者解釋說(shuō)明，勸其推遲獻(xiàn)血或回歸進(jìn)一步隨訪，然后根據(jù)隨訪結(jié)果，做出永久屏蔽獻(xiàn)血或可再次獻(xiàn)血的決定。

62例HBsAg結(jié)果可疑獻(xiàn)血者中，2例被確證為陽(yáng)性。對(duì)于這類低于cut-off值一些的標(biāo)本，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果不一。李雪梅[11]等在46份科華試劑檢測(cè)的HBsAg灰區(qū)（S/CO值0.8-1.0）標(biāo)本經(jīng)中和確認(rèn)試驗(yàn)后確證2例陽(yáng)性,王瑞[12]在44例灰區(qū)獻(xiàn)血者標(biāo)本（S/CO值在0.900-0.990）進(jìn)行中和確認(rèn)試驗(yàn)，結(jié)果均為無(wú)反應(yīng)性。由于中和試驗(yàn)本身可能具有的方法學(xué)上的缺陷,加上本次2例陽(yáng)性結(jié)果未進(jìn)行其它檢驗(yàn)方法和血清標(biāo)志物驗(yàn)證及追蹤檢測(cè)，故僅憑中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)法確定其是否為HBV感染攜帶者。根據(jù)朱為剛等[13]研究，HBsAg濃度0.5ng/ml以下的檢出率為0.27%；也有研究認(rèn)為，部分血清HBsAg處于低水平狀態(tài)，忽視弱反應(yīng)性結(jié)果,尤其是陽(yáng)性分界cut-off值以下的結(jié)果會(huì)造成人群的漏檢[14]；從理論上分析，一些真陽(yáng)性標(biāo)本其真實(shí)值S/CO為1，但由于試劑、設(shè)備、操作、環(huán)境等因素影響，檢測(cè)的S/CO值出現(xiàn)大于1或小于1的概率為50%,真陽(yáng)性標(biāo)本可能發(fā)生漏檢；因此對(duì)低于cut-off值一些的標(biāo)本，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)具體情況用其它方法或檢測(cè)其它血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證[15]。

以HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果為診斷參考標(biāo)準(zhǔn),ELISA為診斷試驗(yàn),繪制的ROC線下面積(AUC)為0.934，以AUC＞0.9認(rèn)為診斷有準(zhǔn)確性，可以認(rèn)為ELISA檢測(cè)HBsAg準(zhǔn)確性較高。利用ROC曲線最佳cut-off值(S/CO=1.6)來(lái)判定ELISA檢測(cè)結(jié)果時(shí),特異性為80.6%，靈敏度為95.4%，但會(huì)有15份S/CO小于1.6、中和確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性的標(biāo)本被判斷為無(wú)反應(yīng)性，這可能導(dǎo)致陽(yáng)性標(biāo)本漏檢。使用廠家推薦的cut-off值為診斷分界值時(shí)，靈敏度為99.4%，特異性為28.2%，其靈敏度提高，特異性降低，導(dǎo)致假陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)量增多，影響試驗(yàn)的整體性能。由于血站實(shí)驗(yàn)室以篩檢為目的，應(yīng)盡可能檢出HBV感染的獻(xiàn)血者,若以廠家推薦cut-off值來(lái)判定有無(wú)反應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)，雖可導(dǎo)致部分假陽(yáng)性，但也可保證血液安全，降低經(jīng)血傳播HBV感染機(jī)會(huì)。

對(duì)86例HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者歸隊(duì)檢測(cè)結(jié)果表明，僅有2.4%（2/86）HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者轉(zhuǎn)為HBsAg+/HBV-DNA+，低于張宏[7]在30例HBsAg＋/HBV-DNA-獻(xiàn) 血 者 中 有13例 轉(zhuǎn) 為 顯 性HBV感染（HBsAg+/HBV-DNA+）的比例，也低于黃成垠等[8]報(bào)道的50%（4/8例）陽(yáng)轉(zhuǎn)比例。對(duì)于HBsAg+/HBV-DNA-檢測(cè)結(jié)果可認(rèn)為此時(shí)血液中存在HBV表面外殼蛋白，不存在或存在極低載量的HBV-DNA,以致高靈敏度的核酸擴(kuò)增方法呈陰性。本研究中2例HBV-DNA陽(yáng)轉(zhuǎn)若排除了非特異性或假陽(yáng)性因素,造成HBV-DNA陽(yáng)轉(zhuǎn)的原因可能為機(jī)體免疫功能下降，HBV-DNA再次復(fù)制所致[16]。值得注意的是,由表2可知，2例發(fā)生HBV-DNA陽(yáng)轉(zhuǎn)的獻(xiàn)血者其HBsAg S/CO=1附近波動(dòng)，提示HBV-DNA陰性、HBsAg S/CO=1附近波動(dòng)的獻(xiàn)血者也可發(fā)生HBV-DNA陽(yáng)轉(zhuǎn)，應(yīng)引起重視。本研究中67.4%(58/86)獻(xiàn)血者檢測(cè)結(jié)果由HBsAg+/HBVDNA-轉(zhuǎn)為HBsAg-/HBV-DNA-,成為HBV感染康復(fù)獻(xiàn)血者。因此對(duì)于血液篩查結(jié)果為HBsAg+/HBVDNA-的獻(xiàn)血者,其獻(xiàn)血資格是否保留或淘汰需謹(jǐn)慎判斷,以本研究結(jié)論傾向于對(duì)這類獻(xiàn)血者進(jìn)行歸隊(duì)檢測(cè)，若歸隊(duì)檢測(cè)合格，可恢復(fù)其獻(xiàn)血資格。

綜上所述,由于NAT檢測(cè)HBV-DNA存在缺陷,存在漏檢可能，因此NAT與ELISA檢測(cè)呈互補(bǔ)作用，血站應(yīng)強(qiáng)制篩查HBsAg。在選擇HBsAg試劑時(shí),要考慮血站實(shí)驗(yàn)室是以篩檢為目的的檢出要求，應(yīng)盡可能檢出HBV感染獻(xiàn)血者，因此要選擇靈敏度和特異度都較高的試劑。ELISA篩查HBsAg存在假陽(yáng)性，出現(xiàn)HBsAg+/HBV-DNA-檢測(cè)結(jié)果時(shí)有必要對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行HBsAg中和確認(rèn)試驗(yàn)，根據(jù)確證結(jié)果對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行合理的解釋，從而有利于獻(xiàn)血者的管理。此外，HBsAg+/HBV-DNA-獻(xiàn)血者可參加歸隊(duì)檢測(cè)，根據(jù)歸隊(duì)檢測(cè)結(jié)果評(píng)估是否恢復(fù)獻(xiàn)血資格。