NK細(xì)胞、HA和Ⅳ-C水平與慢性丙肝患者肝纖維化的診斷效能

吳輝

（駐馬店市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 駐馬店 463000）

丙肝病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是導(dǎo)致慢性丙肝（Chronic Hepatitis C，CHC）發(fā)生的主要原因。研究顯示，約85%的HCV感染患者會(huì)發(fā)展為CHC[1]。CHC作為一種慢性疾病，大部分患者早期無特異表現(xiàn)，但隨著疾病發(fā)展，CHC可能會(huì)出現(xiàn)肝纖維化，逐步進(jìn)展為肝硬化、肝癌，威脅患者生命安全[2]。病理診斷是評估CHC患者肝纖維化“金標(biāo)準(zhǔn)”,該檢查方式雖可明確肝組織病變情況，評估肝纖維化發(fā)生及嚴(yán)重程度，但該技術(shù)屬于有創(chuàng)檢查，部分患者難以接受,且取部分肝組織也無法全面了解整個(gè)肝臟病變情況，應(yīng)用仍有局限[3]。自然殺傷（natural killer cell，NK）細(xì)胞是重要免疫細(xì)胞，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用，有研究顯示，NK細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫，提高個(gè)體對HCV的清除能力,且可能對預(yù)防CHC患者肝纖維化有一定作用[4]。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅳ型膠原蛋白（Ⅳcollagen，Ⅳ-C）是臨床判斷肝纖維化常用指標(biāo)，二者不僅可反映肝細(xì)胞損傷情況，還可參與肝纖維化過程[5]。結(jié)合NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C作用機(jī)制，推測三者可能與CHC患者肝纖維化有關(guān)，且對肝纖維化有一定診斷效能,但具體關(guān)系及診斷效能尚未明確。鑒于此,本研究重在分析NK細(xì)胞、HA和Ⅳ-C對CHC患者肝纖維化的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2019年6月-2020年5月收治的81例CHC患者，男43例，女38例；年齡37～58歲，平均47.37±5.63歲；病程3～9年，平均6.30±1.13年。本研究的實(shí)施經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情本次研究，且簽署相關(guān)同意書。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) ⑴納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《丙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(節(jié)選)》[6]中CHC診斷標(biāo)準(zhǔn)，且HCV檢測呈陽性；精神正常，可配合研究；患者均無抗纖維化治療史。⑵排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤；合并心、肝、腎等重要臟器病變；哺乳或妊娠期患者；智力障礙；合并其他感染性疾??；合并自身代謝性疾病。

1.3 方法

1.3.1 肝纖維化評估及分組 所有患者均接受肝穿刺活檢,于彩超引導(dǎo)下,采用16G穿刺針（美國Bard公司，型號：MAGNUM型）快速進(jìn)行肝組織穿刺術(shù)，取約1-2cm肝組織行病理診斷；參照肝纖維化病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]評估，肝組織匯管區(qū)可見纖維化表現(xiàn)，或可見纖維間隔，或可見纖維間隔同時(shí)伴有小葉結(jié)構(gòu)紊亂，或出現(xiàn)早期肝硬化表現(xiàn)等。將符合上述肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)患者納為肝纖維化組，反之納為無肝纖維化組。

1.3.2 外周血NK細(xì)胞、血清HA、Ⅳ-C檢測⑴外周血NK細(xì)胞檢測：采集患者清晨空腹肘部靜脈血2ml，置于肝素抗凝管內(nèi)；另取一個(gè)2ml試管，于試管內(nèi)添加20μl CD3-FITC/CD（16+56）-PE/CD45-PerCP/CD19-APC四色試劑（購自深圳邁瑞醫(yī)療有限公司），再添加50μl抗凝血標(biāo)本，充分搖勻后，放在室溫下靜置15min；于試管內(nèi)添加450μl溶血?jiǎng)?，充分搖勻，放在室溫下靜置15min后，采用流式細(xì)胞儀（深圳邁瑞醫(yī)療有限公司，型號：BriCyte）測定NK細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞分別用SSC/CD45、SSC/CD3設(shè)門圈定，NK細(xì)胞用淋巴細(xì)胞百分比表示。⑵血清HA、Ⅳ-C檢測：采集患者清晨空腹肘部靜脈血5ml，采用低速離心機(jī)（北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司，型號：TD-420）以4000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，離心半徑為10cm，采取血清用全自動(dòng)生化分析儀（濟(jì)南童鑫生物科技有限公司，型號：BK-1200），以化學(xué)發(fā)光發(fā)測定HA、Ⅳ-C水平，檢測試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司，檢驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 基線資料調(diào)查 設(shè)計(jì)基線資料調(diào)查問卷，詳細(xì)記錄CHC患者基本信息，包括性別（男、女）、年齡、BMI、病程、合并癥（糖尿病：空腹血糖水平≥7.0mmol/L；高血壓：收縮壓水平≥140mmHg，舒張壓水平≥90mmHg）等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；全部計(jì)量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用“”表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；經(jīng)單項(xiàng)Logistic回歸分析，并建立Logistic多元回歸模型作影響分析；繪制受試者工作曲線（ROC），并計(jì)算曲線下面積（AUC），檢驗(yàn)NK、HA和Ⅳ-C對CHC患者肝纖維化的診斷效能，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者肝纖維化發(fā)生情況81例CHC患者中19例發(fā)生肝纖維化，發(fā)生率為23.46%。

2.2 肝纖維化組、無肝纖維化組相關(guān)基線資料及NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平比較 肝纖維化組男43例，女38例；平均年齡47.52±5.21歲；平均病程6.25±1.12年；合并糖尿病5例,合并高血壓6例；無肝纖維化組男33例，女29例；平均年齡（47.33±5.20）歲；平均病程6.31±1.11年；合并糖尿病12例，合并高血壓13例；兩組基線資料比較差異無統(tǒng) 計(jì) 學(xué)意義 （χ2=0.002、t=0.139、0.206、χ2=0.080、0.912，P=0.964、0.890、0.838、0.777、0.340）；肝纖維化組HA、Ⅳ-C水平高于無肝纖維化組,NK細(xì)胞含量低于無肝纖維化組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 肝纖維化組、無肝纖維化組相關(guān)基線資料及NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平比較（）

表1 肝纖維化組、無肝纖維化組相關(guān)基線資料及NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平比較（）

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2.3 NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平與CHC患者肝纖維化的關(guān)系回歸分析 將NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C作為自變量（均為連續(xù)變量），將CHC患者肝纖維化情況作為因變量（1=肝纖維化，0=無肝纖維化），經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，NK細(xì)胞升高可能是CHC患者肝纖維化的保護(hù)因子（OR＜1，P＜0.05），HA、Ⅳ-C升高可能是CHC患者肝纖維化的風(fēng)險(xiǎn)因子（OR＞1，P＜0.05）。見表2。

表2 NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平與CHC患者肝纖維化的關(guān)系回歸分析結(jié)果

2.4 NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平診斷CHC患者肝纖維價(jià)值分析 將CHC患者肝纖維化發(fā)生作為狀態(tài)變量，將NK、HA、Ⅳ-C細(xì)胞作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC曲線（見圖1），結(jié)果顯示，NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平單獨(dú)及聯(lián)合檢測診斷CHC患者肝纖維的AUC分 別 為0.812、0.864、0.871、0.932，AUC均＞0.80，均有一定診斷效能，當(dāng)三者cut-off值分別取83.230ng/ml、50.230ng/ml、8.555%時(shí)，診斷效能最佳。見表3。

圖1 NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平單獨(dú)及聯(lián)合檢測診斷CHC患者肝纖維的ROC曲線圖

表3 NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平診斷CHC患者肝纖維價(jià)值分析結(jié)果

3 討論

肝纖維化是指肝臟內(nèi)結(jié)締組織異常增生過程，不加以干預(yù),病情長期發(fā)展可能會(huì)形成肝硬化，加重病情,提高治療難度，患者不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)增加。研究顯示,肝纖維化是CHC進(jìn)展為肝硬化必經(jīng)過程,若能明確肝纖維化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，對早期干預(yù)、預(yù)防肝硬化發(fā)生，改善患者預(yù)后意義重大[8]。因此，需尋求可早期評估纖維化風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo),以指導(dǎo)臨床早期干預(yù)、預(yù)防。

NK細(xì)胞屬于天然免疫細(xì)胞,可增強(qiáng)免疫力，抵御病毒入侵，有研究顯示，該細(xì)胞在HCV感染早期及發(fā)展過程具有重要作用。先天性免疫反應(yīng)是個(gè)體在HCV感染后出現(xiàn)的第一防線,而NK細(xì)胞作為免疫細(xì)胞可殺傷被HCV感染的細(xì)胞，且分泌的干擾素-γ（IFN-γ）可抑制HCV病毒DNA復(fù)制，繼而有效控制感染[9]。相關(guān)研究顯示，HCV入侵后除會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)外，還可能抑制某些免疫環(huán)節(jié)，促使HCV病毒逃脫免疫阻滯，造成IFN信號通路中斷，導(dǎo)致免疫細(xì)胞無法阻止HCV入侵[10]。而NK細(xì)胞除可抑制HCV病毒入侵外，還可促進(jìn)腫瘤壞死因子β、白介素10等細(xì)胞因子釋放，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，繼而提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)對HCV病毒殺傷能力[11]。HA、Ⅳ-C是評估纖維化程度常用指標(biāo)，其中HA是由肝間質(zhì)細(xì)胞分泌而來，可被肝內(nèi)皮細(xì)胞降解，當(dāng)肝纖維細(xì)胞含量增加，或內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，HA表達(dá)顯著增高。有研究顯示，相比較肝臟組織活檢，HA更利于提示肝臟病變?nèi)?且可作為肝纖維化敏感指標(biāo)[12]。Ⅳ-C是肝基底膜重要組成部分，可提示基底膜膠原更新率，參與肝竇毛細(xì)血管化形成過程,常被作為肝纖維化早期標(biāo)志物[13]。結(jié)合NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C作用機(jī)制，推測三者可能與CHC患者肝纖維化發(fā)生有關(guān)。

本研究初步比較兩組相關(guān)基線資料及NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平，后經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，NK細(xì)胞升高可能是CHC患者肝纖維化的保護(hù)因子，HA、Ⅳ-C升高可能是CHC患者肝纖維化的風(fēng)險(xiǎn)因子,證實(shí)推測。進(jìn)一步繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平診斷CHC患者肝纖維均有理想的價(jià)值，在三者cut-off值分別取83.230ng/ml、50.230ng/ml、8.555%時(shí)，可獲得最佳診斷效能，且隨著NK細(xì)胞含量的降低、HA、Ⅳ-C的升高，患者肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)增加。針對此結(jié)果提出建議，對于入院時(shí)NK細(xì)胞降含量低、HA、Ⅳ-C水平升高的CHC患者，臨床應(yīng)盡早行病理診斷，以明確病變情況，早期干預(yù)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C聯(lián)合檢測診斷CHC患者肝纖維價(jià)值高于各項(xiàng)單獨(dú)檢測，考慮未來可將三者結(jié)合觀察，以提高患者整體獲益。但本研究并未分析NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C三者相關(guān)性，研究存有局限，未來仍需展開前瞻性研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，CHC患者肝纖維化可能與患者NK細(xì)胞含量低、HA、Ⅳ-C水平升高有關(guān)，且NK、HA和Ⅳ-C對CHC患者肝纖維化有一定診斷效能，考慮未來可檢測患者入院時(shí)NK細(xì)胞、HA、Ⅳ-C水平,輔助評估CHC患者肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)早期干預(yù)。