流式微球陣列術(shù)（CBA)檢測細胞因子室內(nèi)質(zhì)控方法的初步建立

謝聞悅，聶李平，黃銘杰，李博文

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518000；2.福建省福州市長樂區(qū)婦幼保健院檢驗科，福建 福州 350299）

流式微球陣列術(shù)(cytometric bead arry,CBA)是液相多重蛋白定量技術(shù)，是以流式細胞儀為檢測平臺，以不同大小或攜帶不同熒光信號的微球為載體，能同時定量測量樣品中的多種可溶性分子和細胞因子，具有高通量、線性范圍廣、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等諸多優(yōu)點[1]，該技術(shù)建立以后被廣泛地用于臨床診斷與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中[2-4]。細胞因子在檢測標(biāo)本中含量低，樣本數(shù)量少，傳統(tǒng)的方法無法滿足多因子檢測；CBA法可一次性定量檢測細胞因子多，用時短，標(biāo)本用量少，尤其適用于微量樣本。但該方法操作過程繁瑣，影響因素多，檢測過程中易受人為因素影響[5，6]，因而如何保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定可靠尤為重要。由于目前市場中尚無商品化的穩(wěn)定質(zhì)控物，也未見關(guān)于細胞因子質(zhì)控方法建立的文獻報道，本實驗室擬通過自制質(zhì)控品，初步探討建立CBA技術(shù)檢測細胞因子的室內(nèi)質(zhì)控方法，為及時找出測定誤差，以保證細胞因子檢測的質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備及試劑

1.1.1 儀器 貝克曼navios流式細胞儀。

1.1.2 試劑Aim Plex多因子流式檢測IFN-r/IL-8試劑盒(北京曠博生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 分析軟件FCAPS流式細胞分析軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)控品的制備

1.2.1.1 陽性血漿 吸取2019年12月一名CAR-T治療后出現(xiàn)2級細胞因子風(fēng)暴（CRS）患者EDTA抗凝血漿1ml，其IL-10檢測結(jié)果為130.26ng/L，IL-8檢測結(jié)果為127.5ng/L。

1.2.1.2 陰性血漿 吸取2019年12月來本院體檢的健康體檢者EDTA抗凝血漿各1ml，IL-10檢測結(jié)果分別為0.52ng/L、0.73ng/L，IL-8檢測結(jié)果分別為1.32ng/L、2.17ng/L。

1.2.1.3 將陽性血漿與陰性血漿混合后,分裝為60 ul/管，-80℃迅速凍存。

1.2.2 操作步驟 按照試劑操作說明書，標(biāo)準(zhǔn)品被稀釋成7個梯度濃度，和自制質(zhì)控樣本各取45μl與IL-10/IL-8微球混懸液45μl室溫混合避光震蕩孵育1h，洗滌后加入二抗25μl混合震蕩孵育30min,二次洗滌后加入鏈合親霉素-PE25ul震蕩孵育30min后,洗滌加入讀數(shù)液200μl上機獲取數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 打開FCAPS軟件創(chuàng)建實驗?zāi)０?，建立?biāo)準(zhǔn)曲線,設(shè)門圈出樣本微球，計算樣本濃度。

1.3 質(zhì)控方法 本實驗室質(zhì)控方法先采用“即刻法”，當(dāng)每個質(zhì)控品種檢測的數(shù)據(jù)點超過20個后，轉(zhuǎn)入使用Levey-Jennings(L-J)質(zhì)控圖法。

1.3.1 “即刻法”的建立 按文獻做法[7]，先測定兩次質(zhì)控值，從第三次開始，每次計算其平均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s，再根據(jù)公式SI上限=(x最大值-x)/s,SI下限=(x-x最小值)/s算出SI值,將其值與SI界值表中數(shù)據(jù)作比較。當(dāng)SI上限和S1下限都小于其界值表中n2s的值時，說明其結(jié)果可靠處于在控，可以繼續(xù)進行試驗，當(dāng)其中有一個值大于界值表的n2s且小于n3s時，該狀態(tài)處于警告，當(dāng)其中有一個值大于n3s時，則說明該質(zhì)控結(jié)果處于失控狀態(tài)，對于失控和警告狀態(tài)的值，選擇舍去一個離散程度最大的值。

表1 SI值表

1.3.2 Levey—Jennings質(zhì)控方法建立 在測定20次的質(zhì)控值后，計算出其平均值，以及標(biāo)準(zhǔn)差s，按westgard的3s標(biāo)準(zhǔn)進行判斷，即以x±3s作圖建立一個質(zhì)控框架圖，將同批質(zhì)控品和檢測試劑測定的結(jié)果描人上述所做的質(zhì)控圖中，當(dāng)描入的質(zhì)控值大于x+3s或小于x-3s時，即說明該質(zhì)控值已處于失控狀態(tài)，對于這樣的值，需要尋找失控的原因，并重新測定該值。

2 結(jié)果

2.1 IL-10質(zhì)控結(jié)果 表2為IL-10即刻法結(jié)果，圖1是按表2數(shù)據(jù)所做的L—J法質(zhì)控圖(x=43.23，SD=5.90)。IL-10即刻法未見警告或失控數(shù)據(jù)，而在L—J法中第13點(30.26)大于x-2s小于x-3s，判定結(jié)果為警告狀態(tài)，其余結(jié)果在控。見表2，圖1。

圖1 IL-10 20個質(zhì)控測定值應(yīng)用L—J法繪制質(zhì)控圖(x=43.23，SD=5.90，CV=13.66%)

表2 IL-10 20個質(zhì)控值應(yīng)用即刻法繪制質(zhì)控表

2.2 IL-8質(zhì)控結(jié)果 表3為IL-8即刻法20次測定結(jié)果，圖2是按表3數(shù)據(jù)所做的L—J法質(zhì)控圖(x=50.11，SD=9.28，CV=18.52%)。即刻法第4組數(shù)據(jù)出現(xiàn)告警，而L-J圖顯示在控狀態(tài)；第20組數(shù)據(jù)則即刻法、L-J圖同時出現(xiàn)警告。在剔除第4點告警值后，發(fā)現(xiàn)即刻法第13點數(shù)據(jù)告警狀態(tài)浮現(xiàn),見表4。剔除即刻法3次告警值并補充第21、22、23點測定值（分別是58.71、34.77、57.71）后，重新計算IL-8的均值、變異系數(shù)為x=47.86，SD=7.27，CV=15.19%。

表4 IL-8刪除第4點告警值后部分數(shù)據(jù)即刻法質(zhì)控表

圖2 IL-8前20個質(zhì)控測定值應(yīng)用L—J法繪制質(zhì)控圖(x=50.11，SD=9.28，CV=18.52%)

表3 IL-8前20個質(zhì)控值應(yīng)用即刻法繪制質(zhì)控表

3 討論

細胞因子在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，檢測其含量有助于判斷疾病活動程度，因此細胞因子測定結(jié)果準(zhǔn)確性對于臨床的治療有著非常重要的影響。隨著細胞因子檢測在臨床的廣泛應(yīng)用，建立好室內(nèi)質(zhì)量質(zhì)控（ICQ)保證樣本測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性有著非常重要的意義。

在日常的室內(nèi)質(zhì)控工作中，大多數(shù)的定量檢驗項目都采用Levey—Jennings圖作為常規(guī)的質(zhì)控方法。但L-J質(zhì)控圖通常需要作20次測定才可繪成，在此之前，不能對檢測進行實時監(jiān)控。因此對于類似CBA法檢測細胞因子這類檢測頻次低，不能迅速進行質(zhì)控數(shù)據(jù)積累的檢驗項目,迫切需要另一個能比較及時反映檢測過程是否在控的質(zhì)控方法。

“即刻法”是一種對離群值進行檢驗的統(tǒng)計方法，實質(zhì)上是將數(shù)據(jù)處理過程中對異常值(即離群值)的判斷及舍棄的方法[8]。其優(yōu)點是只需要連續(xù)測定三次，即可對第3次及以后的數(shù)據(jù)進行在控與失控的判斷，操作簡單、易于掌握[8，9]。在本文中，我們運用“即刻法”分別監(jiān)控IL-10、IL-8初期的質(zhì)控數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大部分的數(shù)據(jù)都未處于告警或失控，這說明檢測過程在控，即刻法用于細胞因子實驗的室內(nèi)質(zhì)控是可行的。在積累20個質(zhì)控數(shù)據(jù)法后即轉(zhuǎn)為L-J圖后，我們發(fā)現(xiàn)IL-10即刻法數(shù)據(jù)雖未出現(xiàn)失控現(xiàn)象，但轉(zhuǎn)化為L-J圖后仍可發(fā)現(xiàn)第13點數(shù)為大于2s的警告狀態(tài)，這說明“即刻法”有時并不能對告警或失控做到“實時”判斷,所以其“即刻性”是相對的[8]。由于即刻法是從當(dāng)天及以前的所有測定值中找出最大值和最小值，在室內(nèi)質(zhì)控時，測定次數(shù)較少時有些離群值可能不一定會顯示失控，但隨著測定次數(shù)的增加，測定值逐漸趨于穩(wěn)定，這時以前的離群值將“暴露”出來顯示為失控，對于這類數(shù)據(jù)值有的研究者被稱之為“遲后異常值”[9]，這種現(xiàn)象被稱為“回顧性失控檢出”現(xiàn)象[10]，這是即刻法的一大缺陷。在IL-8的質(zhì)控檢測中我們還發(fā)現(xiàn)，即刻法第4組數(shù)據(jù)出現(xiàn)告警，而L-J圖顯示在控狀態(tài)；而刪除第4點后，又出現(xiàn)了第12點告警值，但仔細觀察數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)第11點數(shù)據(jù)（63.13）較第12點數(shù)據(jù)（43.55）偏離質(zhì)控 均值 更遠，出現(xiàn)了“距均值近的測定值被判告警,而距均值遠的測定值在控”的不合理現(xiàn)象，有人[10]認為出現(xiàn)這種SI上限或SI下限值>n2S值時,說明該組測定值中最大值或最小值告警了,而并非末次測定值告警。因此，我們舍棄了即刻法出現(xiàn)告警的第4、20點數(shù)據(jù)以及實際超出了前10次累加計算在之外的異常值——第11點數(shù)據(jù)，補充了第21、22、23點數(shù)據(jù)后，重新計算均值和變異系數(shù)，顯而易見，標(biāo)準(zhǔn)差變小，數(shù)據(jù)間離散程度（CV%)也變小了。

即刻法的另一不足之處，在于不能判斷連續(xù)趨勢性上升或下降失控。為了彌補這一不足，我們在檢測20個點之后，計算出中心線和控制線，轉(zhuǎn)入L-J法繪制質(zhì)控圖，使實驗室工作人員能及時發(fā)現(xiàn)質(zhì)控數(shù)據(jù)的失控情況，并能一目了然的判斷質(zhì)控數(shù)據(jù)出現(xiàn)上升或下降等趨勢性變化，及時發(fā)現(xiàn)一些即刻法仍在控，而Levery-Jenning圖可能已處于警告或失控范圍的情況。

質(zhì)控方法建立離不開持續(xù)性的改進：⑴“即刻法”只要3次檢測結(jié)果就可開始質(zhì)控，所以前3次的檢測結(jié)果至關(guān)重要。據(jù)計算表明，若前3次檢測結(jié)果允許的CV在5%以內(nèi)時，第4個檢測結(jié)果CV值>16%即失控；若前3次檢測結(jié)果允許的CV>15%時，第4個檢測結(jié)果CV值>40%遠超室內(nèi)質(zhì)控允許的范圍（≤30%）[11，12]。在本研究中IL-10前三點的CV值為7.72%，這有可能導(dǎo)致即刻法未能及時檢出第13點警告值。因此在后續(xù)的檢測中我們認為應(yīng)重復(fù)前三次檢測，將測定結(jié)果>均值+2SD或＜均值-2SD的數(shù)據(jù)剔除，以保證前3次結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度；⑵由于CBA法操作過程繁瑣，從樣本處理、上機檢測到數(shù)據(jù)處理都對實驗者要求較高，每一步操作出現(xiàn)失誤都會影響到結(jié)果[6]。因此實驗前期我們建立了細胞因子測定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP)，定期校準(zhǔn)專用的加樣槍，每次測定前都對流式細胞儀進行校準(zhǔn)，盡量保證了每次實驗條件的一致性。但臨床工作中仍然發(fā)現(xiàn)有操作過程不規(guī)范，對質(zhì)控方法理解不到位等情況，因此加強對實驗室人員的操作培訓(xùn),提高工作人員對即刻法質(zhì)控的理解，也是預(yù)防性質(zhì)控必不可少的一環(huán)。

綜上所述，我們認為以“即刻法”可基本滿足CBA法檢測細胞因子的初始數(shù)據(jù)監(jiān)控，在數(shù)據(jù)滿20次后結(jié)合L-J圖,可建立一個全面的質(zhì)量管理體系,能確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。