實(shí)時(shí)熒光PCR與DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)手足口病病毒結(jié)果分析

盧艷玲

（濟(jì)源市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，河南 濟(jì)源 459000）

手足口病是臨床的多發(fā)病和常見(jiàn)病，具有較高的傳染性和流行性，通常發(fā)生在夏秋季節(jié)，以5歲以下的嬰幼兒最為常見(jiàn)。其中，以手、足部出疹，口腔黏膜皰疹或潰瘍等為特征性表現(xiàn)[1]。一般情況下患兒在發(fā)病的5～7天自行緩解，也有少部分患兒會(huì)發(fā)展至重癥，即在發(fā)病后的1～4天出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、脊髓炎、腦脊髓炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累并發(fā)癥，甚至伴有肺水腫、肺出血及循環(huán)衰竭等癥狀。危重癥患兒與輕癥患兒不同，因其病情進(jìn)展較快，，若不及時(shí)接受有效治療，可危及生命安全。目前臨床上診斷手足口病的金標(biāo)準(zhǔn)為病毒分離培養(yǎng)，雖然準(zhǔn)確率高，但價(jià)格昂貴，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)備要求高，并不適合大規(guī)模推廣，因此尋求一種操作簡(jiǎn)單、方便、費(fèi)用低、準(zhǔn)確率高、靈敏度高的檢查方法十分必要[2]。有學(xué)者建議采用實(shí)時(shí)熒光PCR與DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)手足口病病毒，但國(guó)內(nèi)對(duì)于它們的對(duì)比性研究較少，尚不清楚哪種方法的確診率高。故本次對(duì)126例疑似感染手足口病患兒采用實(shí)時(shí)熒光PCR與DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)，探討其對(duì)確診率、敏感度、特異度的影響。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 前瞻性選取2017年03月-2019年06月收治的126例疑似感染手足口病患兒進(jìn)行研究，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)確診為手足口病共92例，均給予實(shí)時(shí)熒光PCR與DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)。其中男性患兒62例、女性患兒64例；年齡范圍2～11歲，平均5.71歲；病程范圍3～7d，平均4.45d。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合“手足口病診療指南(2018年版)”[3]診斷標(biāo)準(zhǔn)，譬如伴有口痛、厭食、低熱及手足口等部位出現(xiàn)小皰疹等表現(xiàn)，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)確診。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；⑵無(wú)藥物禁忌癥；⑶年齡大于或等于2歲；⑷家屬同意參加本次研究；⑸無(wú)肺部感染性疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴伴有嚴(yán)重先天性心臟病；⑵哭鬧情緒較為嚴(yán)重，無(wú)法配合操作。

1.2 方法 ⑴標(biāo)本采集與制作：用無(wú)菌棉球采集本次所有受檢者咽拭子標(biāo)本，采集完畢后將其標(biāo)本保存在采樣瓶中，盡快倒入病毒保存液，在4℃的環(huán)境下保存及時(shí)送檢。

⑵病毒分離培養(yǎng)：將所有采集的咽拭子標(biāo)本接種到健康的單層RD細(xì)胞中，每份標(biāo)本接種0.2ml，在33攝氏度的環(huán)境下培養(yǎng)；其次采用顯微鏡觀察細(xì)胞，并記錄細(xì)胞所發(fā)生的變化；若是在觀察期間發(fā)生有特征的腸道病毒CPE出現(xiàn)，且高達(dá)70%左右，則將其儲(chǔ)藏在-20℃的環(huán)境下以備二次傳代；若是觀察7d后無(wú)腸道病毒CPE出現(xiàn)，則應(yīng)該盲傳一代繼續(xù)觀察，盲傳二代仍是沒(méi)有出現(xiàn)腸道病毒CPE，則將其判定為陰性。

⑶實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)：采用生理鹽水對(duì)所有的標(biāo)本重懸，再取1.5ml放置在無(wú)菌離心管中，并加入Trizol試劑200μl與氯仿100μl，通過(guò)振蕩器離心振蕩20s、靜置3min后12000r/min冷凍離心2min，提取上清液，提取完畢后在上清液中加入10PLRNA提取液A，再次通過(guò)振蕩器將溶液混合均勻，充分混勻后8000r/min冷凍離心1min，其目的是為了棄除上清液，而剩余的溶液放置在通風(fēng)櫥中，通風(fēng)時(shí)間為15min，待瓶中出現(xiàn)白色沉淀物后加入DEPC 30μl，對(duì)其輕輕搖晃，待充分混勻后呈白色懸濁液進(jìn)行PCR擴(kuò)增；最后在PCR反應(yīng)管中加入逆轉(zhuǎn)錄酶系2μl、Taq酶系3μL及RT-PCRl反應(yīng)液5μl，加入完畢后再加入陰、陽(yáng)性質(zhì)控液與RNA標(biāo)本懸濁液，其中PCR反應(yīng)管總體積控制在25μl左右，8000r/min離心，待離心處理完畢后采用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。熒光PCR檢測(cè)試劑盒由上?？迫A生物工程股份有限公司提供。

⑷DNA測(cè)序：采用貝克曼DNA測(cè)序儀檢測(cè)，病毒DNA提取試劑盒由西安天隆生物科技有限公司提供，按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 評(píng)估實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)與DNA測(cè)序的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。采用四格表法計(jì)算。

1.3.2 評(píng)估上述方法對(duì)手足口病毒亞型的檢出情況，包括腸道病毒通用型（EV）檢出率、腸道病毒71型（EV-71）檢出率、柯薩奇病毒A16（CA-16）。

1.3.3 評(píng)估上述方法的準(zhǔn)確率、漏診率、誤診率。

1.3.4 評(píng)估實(shí)時(shí)熒光PCR、DNA測(cè)序技術(shù)診斷手足口病的AUC、敏感度、特異性及約登指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件分析本次數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用（）表示，行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用（n；%）表示，行χ2檢驗(yàn)；診斷價(jià)值采用ROC曲線分析；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手足口病病原體分型 在126例疑似感染手足口病患兒中，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)確診為手足口病共92例、百分比為73.02%；其中，檢出為EV病毒共48例、百分比為52.17%，檢出EV-71病毒共32例、百分比為34.78%，檢出CA-16病毒共16例、百分比為17.39%。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR的陽(yáng)、陰性預(yù)測(cè)值分析126例疑似感染手足口病患兒經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)后陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.77%、陰性預(yù)測(cè)值為93.94%；與金標(biāo)準(zhǔn)齊同（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR的陽(yáng)、陰性預(yù)測(cè)值比較

2.3 DNA測(cè)序技術(shù)的陽(yáng)、陰性預(yù)測(cè)值分析126例疑似感染手足口病患兒經(jīng)DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)后陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.53%、陰性預(yù)測(cè)值為48.78%；低于金標(biāo)準(zhǔn)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 DNA測(cè)序技術(shù)的陽(yáng)、陰性預(yù)測(cè)值比較

2.4 手足口病毒亞型的檢出情況126例疑似感染手足口病患兒經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢查后確診為手足口病共90例，其中感染EV病毒47例、EV-71病毒31例、CA-16病毒12例；經(jīng)DNA測(cè)序技術(shù)檢查后確診為手足口病共71例，其中感染EV病毒38例、EV-71病毒20例、CA-16病毒13例。見(jiàn)表3。

表3 不同檢查方法對(duì)手足口病毒亞型的檢出情況（n；%）

2.5 準(zhǔn)確率、漏診率、漏診率比較 實(shí)時(shí)熒光PCR的準(zhǔn)確率高于DNA測(cè)序技術(shù)，而誤診率、漏診率低于DNA測(cè)序技術(shù)（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩種檢查方法的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率比較（n；%）

2.6 ROC曲線分析ROC曲線分析顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR、DNA測(cè)序技術(shù)診斷手足口病的AUC分別為（0.945、0.680，P＜0.05）；依據(jù)AUC及標(biāo)準(zhǔn)誤，采用Z檢驗(yàn)AUC差異，結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光PCR VS DNA測(cè)序技術(shù)Z=4.171、P＜0.001；其中敏感度分別為97.80%、77.20%，特異度分別為91.20%、58.80%。見(jiàn)表5，ROC曲線見(jiàn)圖1。

表5 診斷效能分析

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR與DNA測(cè)序技術(shù)的ROC曲線分析

3 討論

手足口病是一種急性傳染病，由多種腸道病毒感染所引起，譬如柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型等病原體[4]。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，腸道病毒71型會(huì)導(dǎo)致患兒發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，如腦膜炎、腦脊髓炎等，甚至因中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)損害而死亡[5]。基于此，盡早診治顯得十分重要，對(duì)控制病情發(fā)展及挽救患兒生命安全具有重要意義。目前臨床上針對(duì)該病，多采用病毒分離培養(yǎng)、DNA測(cè)序技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR等方法檢測(cè)。其中，第一種方法為臨床診斷手足口病的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然診斷確診率較高，但因檢測(cè)周期長(zhǎng)，無(wú)法滿足早診斷、早治療的目標(biāo)[6]。第二種方法是分子生物學(xué)研究中最為常用的技術(shù)之一，盡管測(cè)序法可達(dá)到一定通量，但因設(shè)備特殊、昂貴、操作步驟繁瑣及結(jié)果判讀復(fù)雜，對(duì)環(huán)境和操作者要求高，導(dǎo)致該項(xiàng)檢查無(wú)法大規(guī)模推廣。而第三種是通過(guò)檢測(cè)手足口病患兒的咽拭子、糞便等標(biāo)本，行病原體診斷，具有操作簡(jiǎn)單、方便、穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)[7]。另外，它也是一種新興的分子生物檢測(cè)方法，通過(guò)在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，避免人為判斷[8-10]。

研究結(jié)果顯示，126例疑似感染手足口病患兒經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)后，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.77%顯著高于DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)后的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；并且實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較接近“金標(biāo)準(zhǔn)”，提示實(shí)時(shí)熒光PCR診斷確診率更高。其中，DNA測(cè)序技術(shù)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低可能與病毒缺失有關(guān)，加上基因突變圖譜復(fù)雜，導(dǎo)致標(biāo)本需在基因克隆的前提下，確定其突變類(lèi)型，否則難以檢測(cè)到病毒[10-12]。在敏感度、特異性及準(zhǔn)確率方面，本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR更高，但也存在假陰性情況，即假陰性出現(xiàn)3例；為了避免該情況的發(fā)生，建議在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物放置在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，則可排除假陰性的可能[13]。另外，實(shí)時(shí)熒光PCR所采用96孔板實(shí)時(shí)PCR儀器，同時(shí)能檢測(cè)48個(gè)標(biāo)本，甚至更多，且檢測(cè)時(shí)間較短，能在2h內(nèi)完成；而DNA測(cè)序技術(shù)無(wú)法做到，需要進(jìn)行擴(kuò)增、純化、序列分析等步驟，故耗時(shí)較長(zhǎng)[14,15]。并且檢測(cè)費(fèi)用及其成本比實(shí)時(shí)熒光PCR高，故本文更建議采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，在其ROC曲線分析中，發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR的AUC值高于DNA測(cè)序技術(shù)，提示前者診斷價(jià)值更高。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR與DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)相比，前者更加快捷，且靈敏度、特異度更高，能滿足臨床需求。