COPD患者支氣管黏膜活檢標(biāo)本中TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)及其與肺功能的相關(guān)性研究

王建峰，劉寧寧，楊楠楠

（焦作市第二人民醫(yī)院，河南 焦作 454000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種具有較高發(fā)病率、死亡率的呼吸系統(tǒng)慢性疾病,主要表現(xiàn)為肺功能進(jìn)行減退,嚴(yán)重者可發(fā)展為肺源性心臟病、呼吸衰竭等，嚴(yán)重威脅人類身體健康[1]。COPD病情呈進(jìn)行性進(jìn)展，病因尚未完全明確，缺乏特效療法，防重于治療，故而有必要對COPD患者體內(nèi)病理變化、臨床表現(xiàn)等方面進(jìn)行研究。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一種重要的生長因子家族,其在氣道重塑方面發(fā)揮著重要作用[2]。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一類高度保守的跨細(xì)胞膜選擇性水轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白，其中AQP1不僅在瘤體運(yùn)輸中起重要作用,也參與細(xì)胞的增殖、遷移及調(diào)亡等過程[3]。血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1）是一種催化血紅素生成膽紅素、CO、鐵的限速酶，主要是在機(jī)體處于非正常狀態(tài)或應(yīng)急狀態(tài)下發(fā)揮作用，既往研究指出，COPD患者體內(nèi)HO-1活性明顯上升，加重低氧血癥[4]。目前，有關(guān)在COPD患者體內(nèi)TGF-β水平相關(guān)研究主要通過采集血液、手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行[5]，HO-1、AQP1水平相關(guān)研究多為基礎(chǔ)研究[6]，而通過支氣管粘膜活檢進(jìn)行研究的報(bào)道鮮少。因此，本研究通過纖維支氣管鏡（fiberoptic bronchoscopy，F(xiàn)B）檢查鉗取COPD患者支氣管粘膜標(biāo)本，檢測標(biāo)本中TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平，并分析探討它們與患者肺功能相關(guān)性以及各指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷COPD的效能，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月-2019年6月行纖維支氣管鏡檢查患者76例。納入標(biāo)準(zhǔn)：胸部X線片或CT檢查發(fā)現(xiàn)不明原因的肺不張、肺部占位性病變或咯血；患者知情同意參與本研究。排出標(biāo)準(zhǔn)：合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；無法耐受FB者；合并除COPD以外其他慢性氣道疾病者；惡性腫瘤者。根據(jù)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]分為COPD患者45例（COPD組，其中輕度18例，中度27例）與無其他慢性氣管炎癥性疾病的患者31例（非COPD組）。

1.2 肺功能檢查 患者休息5～10min，使用肺功能檢測儀進(jìn)行肺功能檢查，主要檢測用第1s用力呼氣容積 （forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）/力呼氣肺合量（forced vital capacity，F(xiàn)VC），即為FEV1/FVC，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）。

1.3 纖維支氣管鏡檢查及支氣管黏膜標(biāo)本收集術(shù)前禁食6～8h，術(shù)前15min采用霧化吸入2%利多卡因進(jìn)行咽喉部麻醉?；颊呷⊙雠P位，鼻塞吸氧，心電及血氧監(jiān)護(hù)，纖維支氣管鏡經(jīng)患者鼻腔進(jìn)入氣道，使用活檢鉗取肺占位病變的對側(cè)肺上／下葉(中間)、中／下葉支氣管間脊黏膜。取出的活檢組織即刻置于多聚甲醛中固定、使用梯度酒精脫水，待透明后石蠟包埋，做2μm厚切片以備檢測。

1.4 免疫組化學(xué)檢測 采用鏈菌素-親生物素過氧化物酶法（streptavidin-perosidase，SP法），SP試劑盒購自于艾迪生物科技有限公司，特異抗體分別為兔抗人TGF-β、AQP1、HO-1多克隆抗體（分別購自于上海億欣生物科技有限公司、上海萬疆生物技術(shù)有限公司、武漢愛博泰克生物科技有限公司）。染色步驟：⑴石蠟切片脫蠟與水化：將石蠟切片置于60℃恒溫箱內(nèi)烘烤20min；石蠟切片置于二甲苯液體中浸泡10min，更換二甲苯再泡10min，然后用無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇各浸泡5min；⑵抗原修復(fù)：熱修復(fù)抗原，切片浸入的0.01mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液（其PH值為6.0），使用微波爐加熱至沸騰后斷電，等待5～10min，再次重復(fù)加熱1～2次。置于涼水中至冷卻。⑶SP法：冷去后使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2次，每次5min；置于PBS配置新鮮3%過氧化氫液，室溫封閉10min，再用PBS洗3次；滴加10%山羊血清室溫封閉15min，接著滴加一抗，4℃環(huán)境下過夜，PBS洗3次，每次2min；滴加二抗，20-37℃孵育30分鐘，PBS洗3次，每次2min；根據(jù)用量，將SP按1:100稀釋于PBS中制成工作液，滴加SP工作液，20～37℃孵育30分鐘，PBS洗4次，每次5min；DAB顯色，根據(jù)用量，自配顯色液，滴加至切片上，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，5～30min，蒸餾水洗終止反應(yīng)；蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、樹膠封片，顯微鏡觀察。采用圖像分析儀對支氣管黏膜TGF-β、AQP1、HO-1陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量檢測，測定三者的平均吸光度值，隨機(jī)測4個(gè)高倍視野，計(jì)算平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件，對性別、吸煙情況等計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以百分比(%)形式表示，比較用χ2檢 驗(yàn)；對 年 齡 構(gòu) 成、吸 煙 數(shù) 量、FEV1/FVC、FEV1%、吸光度值等計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()形式表示，比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)；TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)與FEV1/FVC、FEV1%的相關(guān)性用Pearson分析，用受試者工作特征曲線（ROC）評估診斷效能，P<0.05，表示對比差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料對比 兩組在性別、年齡構(gòu)成、吸煙情況方面對比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);COPD組患者FEV1/FVC、FEV1%均明顯低于非COPD組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 兩組患者TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平對比COPD組患者支氣管黏膜中TGF-β、HO-1表達(dá)水平明顯高于非COPD組（P<0.05），而AQP1表達(dá)水平明顯低于非COPD組（P<0.05）。見表2。

表2 兩組患者TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平對比（s）

表2 兩組患者TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平對比（s）

組別 n COPD組非COPD組t值P值45 31--TGF-β AQP1 1.07±0.25 0.76±0.14 6.253＜0.001 0.21±0.08 0.52±0.19 9.523＜0.001 HO-1 0.15±0.04 0.10±0.03 5.740＜0.001

2.3 不同疾病程度COPD患者TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平對比 輕度COPD組患者支氣管黏膜中TGF-β、HO-1表達(dá)水平明顯低于中度COPD組（P<0.05），而AQP1表達(dá)水平明顯高于中度COPD組（P<0.05）。見表3。

表3 不同疾病程度COPD患者TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平對比（）

表3 不同疾病程度COPD患者TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平對比（）

組別 n輕度COPD組中度COPD組t值P值18 27--TGF-β AQP1 0.85±0.18 1.22±0.33 4.336＜0.001 0.29±0.13 0.15±0.05 5.083＜0.001 HO-1 0.13±0.03 0.17±0.05 3.042 0.003

2.4 TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平與FEV1/FVC、FEV1%的相關(guān)性分析COPD組患者支氣管黏膜中TGF-β、HO-1表達(dá)水平與FEV1/FVC、FEV1%均呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)，AQP1表達(dá)水平與FEV1/FVC、FEV1%呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 TGF-β、AQP1、HO-1表達(dá)水平與FEV1/FVC、FEV1%的相關(guān)性分析

2.5 TGF-β、AQP1、HO-1對COPD的 診 斷 價(jià) 值當(dāng)TGF-β表達(dá)水平取最佳截?cái)嘀?.01，AQP1表達(dá)水平取最佳截?cái)嘀?.32，HO-1表達(dá)水平取最佳截?cái)嘀?.11時(shí)，上述指標(biāo)聯(lián)合診斷COPD的AUC高于各指標(biāo)單一檢測。見圖1，表5。

表5 TGF-β、AQP1、HO-1對COPD的診斷價(jià)值

圖1 TGF-β、AQP1、HO-1診斷COPD的ROC曲線

3 討論

一項(xiàng)Meta分析顯示，我國≥40歲人群COPD的發(fā)病率為9.9%，男性患病率高于女性，且隨著年齡的增長，發(fā)病率逐漸上升[8]。肺功能檢查是呼吸系統(tǒng)疾病必要的檢查項(xiàng)目,其可有效判別患者肺功能是否正常。本研究結(jié)果顯示,COPD組患者FEV1/FVC、FEV1%明顯低于非COPD組,提示COPD患者肺功能明顯降低，肺部損傷加重，與國內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果一致[9]。但影響COPD的因素較多，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，主要可能與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及蛋白酶/抗蛋白酶失衡有關(guān)[10]，患者病情呈進(jìn)行性進(jìn)展，臨床上缺乏有效的治療措施，故有必要進(jìn)行病理方面的研究。

COPD患者的氣道炎癥可激活單核巨噬細(xì)胞，通過自分泌或旁分泌TGF-β進(jìn)一步刺激巨噬細(xì)胞的合成及炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)；TGF-β是一類具有轉(zhuǎn)化作用的生長因子，其可促使氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，參與氣道重塑，也可促進(jìn)氧化應(yīng)激，加重氣道炎癥[11]。陳娟等[12]研究指出，COPD患者氣道組織TGF-β的表達(dá)明顯上升，參與了氣道重塑。本研究中，與非COPD組相比，COPD組患者支氣管黏膜中TGF-β表達(dá)水平明顯升高，且病情越嚴(yán)重的患者，其TGF-β表達(dá)水平越高，提示支氣管黏膜中TGF-β表達(dá)水平對COPD患者病情嚴(yán)重程度具有指示作用，此與上述學(xué)者及既往研究結(jié)果均相似[13]。

目前，在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的AQPs有13種，分布在肺 組 織 的 主 要 為AQP1、3、4、5，其 異 常 表 達(dá) 與COPD氣道炎癥、氣道重塑及肺功能下降等密切相關(guān)[14]。石志紅等[15]研究指出，COPD患者肺組織中AQP5表達(dá)水平顯著降低,且中度病情患者AQP5表達(dá)水平低于輕度患者。AQP1主要表達(dá)于起到上皮細(xì)胞、支氣管黏膜下腺、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮中,具有清支氣管與血管周圍水分的作用[16],但有關(guān)AQP1在COPD患者研究鮮少，相關(guān)報(bào)道多是基礎(chǔ)研究。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者支氣管黏膜中AQP1表達(dá)水平明顯低于非COPD組，且中度病情患者AQP1表達(dá)水平低于輕度患者，提示AQP1可能參與了COPD的發(fā)生發(fā)展。這也與COPD患者存在氣道炎癥，炎癥的長期刺激會(huì)使氣道中杯狀細(xì)胞及粘液腺的增生與化生，造成氣道粘液高分泌，影響其表達(dá)有關(guān)。因此，AQP1的表達(dá)水平可作為判斷COPD發(fā)生發(fā)展的新指標(biāo)。

HO有3種同工酶，其中HO-1為誘導(dǎo)型抗氧化酶，表達(dá)于心、肺、腦等多種組織，可將血紅素分解為膽紅素、CO及鐵,發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激及炎癥損傷的作用[17]。李巧榮等[18]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者支氣管黏膜中HO-1的表達(dá)水平升高，并與肺功能有關(guān)。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HO-1在兩組患者支氣管黏膜中表達(dá)水平同TGF-β，且其水平變化與病情嚴(yán)重程度一致。這可能是因?yàn)镃OPD患者缺氧、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素可誘導(dǎo)HO-1mRNA的轉(zhuǎn)錄，使得HO-1合成增加。香煙煙霧是導(dǎo)致COPD發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，可誘發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，Lee等[19]研究了COPD患者支氣管上皮細(xì)胞中HO-1表達(dá)降低的分子機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物可通過激活核因子E2相關(guān)因子的活性從而增加HO-1水平。

同時(shí)本研究也分析了TGF-β、AQP1、HO-1與FEV1/FVC、FEV1%相關(guān)性，Pearson相關(guān)性結(jié)果顯示，TGF-β、HO-1與FEV1/FVC呈 明 顯 負(fù) 相 關(guān)，AQP1與FEV1/FVC呈明顯正相關(guān)；TGF-β、HO-1與FEV1%呈明顯負(fù)相關(guān)，AQP1與FEV1%呈明顯正相關(guān)；提示TGF-β、AQP1、HO-1的表達(dá)水平可反映COPD患者肺功能損傷程度，可作為診斷COPD的標(biāo)志物。這可能與病情進(jìn)展，使得炎癥程度、氧化應(yīng)激加重有關(guān)。進(jìn)一步ROC分析結(jié)果顯示，TGF-β、AQP1、HO-1能夠較好地指示COPD診斷，聯(lián)合檢測具有更優(yōu)的診斷價(jià)值。但本研究納入COPD患者有限，后續(xù)尚需擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行深入探討，以便對臨床治療有更好參考意義。近年，Bafadhel[20]等外國學(xué)者也就COPD患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測指標(biāo)展開分析，以探尋COPD病情發(fā)生發(fā)展的新型監(jiān)測指標(biāo)，為臨床診療提供新方向。AQP1、HO-1此前在與COPD關(guān)系的研究中以體外實(shí)驗(yàn)為主，而本研究針對COPD患者的表達(dá)水平進(jìn)行探析，發(fā)現(xiàn)2種新型監(jiān)測指標(biāo)在COPD病情判斷中具有可行性，可為國內(nèi)COPD診療提供新方向，且聯(lián)合監(jiān)測TGF-β對判斷肺功能損傷程度有利。

綜上所述，COPD患者支氣管黏膜中TGF-β、HO-1表達(dá)水平增加，與FEV1/FVC、FEV1%負(fù)相關(guān)；AQP1表達(dá)水平降低，與FEV1/FVC、FEV1%正相關(guān)，TGF-β、AQP1、HO-1聯(lián)合檢測對COPD有更佳的診斷價(jià)值，可作為COPD診斷的標(biāo)志物。