茉莉酸處理對木本油料植物小桐子早期花序芽基因表達的影響

徐傳佳，陳茂盛，徐增富，3*

(1.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園,種子創(chuàng)新研究院,中國科學(xué)院熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室,勐侖 666303；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100049；3.廣西大學(xué)林學(xué)院和亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004)

茉莉酸 (jasmonic acid,JA)在植物花序、小花和雄器官發(fā)育過程中具有重要調(diào)控作用[1-2]。根據(jù)經(jīng)典的Vick-Zimmerman途徑[3-4]，茉莉酸生物合成最初底物是α-亞麻酸 (α-linolenic acid,ALA)，其由半乳糖脂經(jīng)磷脂酶A1催化而成；磷脂酶A1包括DONGLE (DGL)，DAD1(deffective in Anther Dehiscence1)和其他未被識別的脂酶[5]。ALA在一系列酶催化下轉(zhuǎn)化成12-氧代植物二烯酸 [(9S,13S)-12-oxophytodienoic acid,OPDA]。這些酶包括脂氧合酶 (lipoxygenase,LOX)，丙二烯氧合酶 (allene oxide synthase,AOS)和丙二烯氧化物環(huán)化酶 (allene oxide cyclase,AOC)。OPDA由過氧化物酶體ABC轉(zhuǎn)運蛋白 (peroxisomal ABC transporter 1,PXA1)轉(zhuǎn)運到過氧化物酶體，被OPDA還原酶 (OPDA reductase,OPR)還原成OPC-8:0，隨后經(jīng)過三步β氧化生成茉莉酸[6-7]。β氧化酶包括乙酰輔酶A氧化酶 (acyl-CoA oxidase,ACX)，多功能酶 (multifunctional protein,MFP)和3-酮酯酰輔酶A硫解酶 (3-ketoacyl-CoA thiolase,KAT)組成[1]。

在擬南芥花藥不開裂基因DAD1(defectiveinantherdehiscence1)突變體中，由于內(nèi)源茉莉酸含量降低，花絲變短，花粉失活以及花藥開裂缺陷，導(dǎo)致雄性不育[8-9]。kat2kat5雙突變體表現(xiàn)出節(jié)間間距異常，花序長度縮短，以及花器官異位的表型[10]。在水稻 (Oryzasativa)中，與DAD1同源的基因EG1(EXTRAGLUME1)突變，會引起花分生組織決定缺陷，改變花器官數(shù)量，生成額外的類穎器官，導(dǎo)致小穗形態(tài)發(fā)生變化[11]。在玉米 (Zeamays)中，茉莉酸合成基因突變體ts1或opr7opr8均表現(xiàn)出穗狀花序由雄蕊向雌蕊逆轉(zhuǎn)表型，表明JA在玉米花性別決定上起著重要作用[12-13]。

在茉莉酸信號傳遞途徑中，植物響應(yīng)發(fā)育或環(huán)境信號，迅速合成具有生物活性的茉莉酸-異亮氨酸 (jasmonoyl-isoleucine,JA-Ile)[14-17]。F-box COI1(CORONATINE INSENSITIVE 1)蛋白感知JA-Ile后，募集不同的jasmonate-ZIM domain (JAZ)蛋白，經(jīng)26S蛋白酶體使JAZ蛋白泛素化并降解[18-21]。JAZ蛋白降解會解除JAZ-NINJA-TPL(JAZ-NOVEL INTERACTOR OF JAZ-TOPLESS)復(fù)合物對JA響應(yīng)基因的直接抑制，同時使得結(jié)合在這些響應(yīng)基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子 (如MYC2)被釋放，調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達，從而調(diào)控植物生長發(fā)育和防御響應(yīng)[19,22-23]。同時，COI1蛋白與SCF(Skp-Cullin-F-box)蛋白特異性結(jié)合，形成SCFCOI1蛋白復(fù)合體；此復(fù)合體通過結(jié)合靶向蛋白，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄響應(yīng)，進而調(diào)控相應(yīng)的生物學(xué)過程[24]。此外，作為JAZ蛋白的靶標(biāo)，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子中的IIIe亞群 (MYC2、MYC3、MYC4和MYC5)是茉莉酸信號通路中的正調(diào)控因子，IIId亞群 (JAM1、JAM2、JAM3和bHLH14)是負調(diào)控因子[9,25-28]。在水稻中，JAZ1與茉莉酸受體蛋白COI1b相互作用，引起茉莉酸信號抑制子JAZ1降解，啟動茉莉酸信號，從而調(diào)控穗的發(fā)育[11]。擬南芥coi1突變體表現(xiàn)為雄性不育，而水稻OsCOI1 RNAi轉(zhuǎn)基因植株的穗表型沒有明顯變化[29-30]。作為轉(zhuǎn)錄抑制子，擬南芥JAM1、JAM2和JAM3調(diào)控茉莉酸信號途徑，它們的功能增強突變體雄性育性下降[31]。番茄中超量表達SlJAZ2基因引起植株早期葉片發(fā)生和開花時間提前以及株高和節(jié)間縮短[32]。茄子花藥開裂相關(guān)基因SmDAD1的啟動子與GUS基因在擬南芥中異源融合表達，展現(xiàn)出該啟動子在根部、葉片和花藥中的較強活性，且其受逆境和生長發(fā)育相關(guān)激素的誘導(dǎo)，暗示SmDAD1可能參與茄子發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程[33]。以上研究結(jié)果表明，在草本植物中，JA合成及信號途徑在植物花發(fā)育中發(fā)揮著多樣的功能，但是其在木本植物花發(fā)育中的調(diào)控作用卻鮮有報道[2,32-34]。

小桐子 (Jatrophacurcas)是大戟科多年生木本油料植物，其種子含油率高 (30%～40%)，是種很有潛力的可再生能源植物[35]。然而，小桐子是雌雄同株異花植物，雌雄花比例 (1∶13～1∶29)和種子產(chǎn)量低[36]，限制其生產(chǎn)應(yīng)用。因此，解析小桐子花性別決定的分子機制對小桐子遺傳改良十分重要。前期通過對雄花退化的小桐子突變體與野生型植株花序的比較轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)JA在小桐子花發(fā)育中可能發(fā)揮調(diào)控功能[37]，然而其具體作用機制尚不清楚。現(xiàn)通過外源茉莉酸處理小桐子早期花序芽，分析JA對花發(fā)育及基因轉(zhuǎn)錄的影響，為進一步解析JA調(diào)控小桐子花發(fā)育的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

三年生的小桐子種植于云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園苗圃 (北緯21°54′,東經(jīng)101°46′;海拔580 m)。茉莉酸購于上海源葉生物科技有限公司 (Cat.No.JJ210510)。茉莉酸溶解在10%乙醇中配成10 mmol/L母液，儲存在4 ℃?zhèn)溆茫敢河?0%乙醇稀釋成不同濃度后使用。預(yù)實驗結(jié)果表明，相比2.5 mmol/L和5 mmol/L茉莉酸處理，1 mmol/L茉莉酸處理小桐子花序芽，對花序芽無明顯損傷，故選取該濃度作為處理濃度。于長勢相同的小桐子上，選取出現(xiàn)1～7 d的花序芽 (圖1)為實驗材料[37]，分別用1 mmol/L茉莉酸 (處理組ja1-3)和10%乙醇 (對照組ck1-3)噴施處理[38-39]，24 h后取樣，3～5個花序芽為一個生物學(xué)重復(fù)。采集的樣品用液氮速凍，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。另外，用同樣濃度的試劑和相同的處理方法，對同一發(fā)育時期的花序芽進行處理，連續(xù)處理3次，每次間隔1 d。25 d后，先對未完全開放小花的數(shù)量進行統(tǒng)計；待花完全開放后，再對花序進行形態(tài)學(xué)觀察和雌雄花大小測定。

圖1 出現(xiàn)1～7 d的小桐子花序芽Fig.1 The Jatropha inflorescence bud 1～7 days after emergence

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和測序文庫的構(gòu)建

花序總RNA的提取采用文獻中描述的硅膠吸附法[40]。用NanoDrop 2000分光光度計 (Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)測定RNA濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量。用Agilent 2100 生物分析儀 (Agilent,Santa Clara,CA,USA)確認RNA的完整性，并通過Qiagen RNeasy kit (Venlo,Netherlands)試劑盒純化RNA。選擇RIN值 (RNA integrity number)大于7的RNA樣品用于建庫。建庫測序由武漢菲沙基因信息有限公司DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000)平臺完成。數(shù)據(jù)儲存于國家基因庫序列歸檔系統(tǒng) (China Nucleotide Sequence Archive,CNSA)，項目編號為CNP0001154。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組分析

Clean reads用Subread (version 1.6.2)軟件 (http://subread.sourceforge.net/)比對到小桐子基因組，并進行基因豐度計算[41]。用edgeR軟件進行差異表達基因 (differentially expressed gene,DEG)分析[42]。使用DAVID軟件進行Gene Ontology (GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)的基因功能富集分析[43]。用pheatmap R軟件包 (version1.0.7)(https://github.com/cran/pheatmap)完成基因的分層聚類。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(qRT-PCR)

用Primer5.0軟件對小桐子花序芽差異表達的候選基因設(shè)計qRT-PCR引物 (表1)。以cDNA為模板，以小桐子JcActin(GeneBank No.HM044307)基因為內(nèi)參[44]，參照SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Roche diagnostics)試劑盒說明書加樣并在LightCycler480熒光定量PCR儀上進行目的基因片段的擴增。實驗進行2次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)性重復(fù)。結(jié)果用2-ΔΔCT方法分析。

表1 qRT-PCR涉及的基因和引物Table 1 Genes and primers used in qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸處理對早期花序芽中基因表達的影響

基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù) (表2)，對處理和對照樣品進行多維標(biāo)度法 (multidimensional scaling)分析，其中一個對照樣品 (ck3)出現(xiàn)偏離，去除后處理組與對照組能明顯分開(圖2)，表明JA處理后，小桐子花序芽中的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生了明顯變化。茉莉酸處理后，小桐子花序芽中一共1 954個基因被誘導(dǎo)表達，其中1 259個基因上調(diào)表達，695個基因下調(diào)表達[變化倍數(shù)≥2,錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)≤0.01](圖3)。GO注釋顯示，在上調(diào)表達的DEGs中,主要富集“膜重要組分(integral component of membrane)”“質(zhì)膜(plasma membrane)”“胞外區(qū)(extracellular region)”和“ATP(adenoisine-triphosphate)結(jié)合(ATP binding)”功能分類基因；在下調(diào)表達的DEGs中，主要富集“葉綠體(chloroplast)”“膜整體組分(integral component of membrane)”“膜類(membrane)”和“氧化還原過程(oxidation-reduction process)”功能分類基因(圖4)。其中“響應(yīng)茉莉酸(response to jasmonic acid)”功能分類基因出現(xiàn)在上調(diào)表達基因群中，表明在小桐子中，外施JA確實可以促進相應(yīng)信號途徑的基因表達。KEGG注釋顯示“次生代謝物生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)”途徑基因在上調(diào)和下調(diào)表達DEGs中都富集，說明外源JA可能影響小桐子花序芽中次生代謝物的合成 (圖5)。

表2 小桐子花序芽轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計Table 2 Quality statistics of transcriptome sequencing data for inflorescence bud from Jatropha

ck1和ck2是對照樣品的2個生物學(xué)重復(fù)；ja1、ja2和ja3是處理樣品的3個生物學(xué)重復(fù)；BCV表示生物學(xué)變異系數(shù)圖2 處理和對照樣品關(guān)系分析Fig.2 Relationship analysis of sequencing samples based on multidimensional scaling

藍線表示2倍差異表達的基因；紅色點表示FDR小于0.01的差異表達基因；CPM表示每百萬比對到某基因的讀長數(shù)圖3 小桐子花序芽中茉莉酸處理誘導(dǎo)的差異表達基因Fig.3 Differentially expressed genes (DEGs)induced by JA treatment in inflorescence buds of Jatropha curcas

2.2 成花轉(zhuǎn)變、花器官發(fā)育以及茉莉酸合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的DEGs分析

通過序列相似性比對，在差異表達基因中篩選到10個與成花轉(zhuǎn)變相關(guān)的，8個與花器官發(fā)育相關(guān)的，8個與茉莉酸合成途徑相關(guān)的和10個與茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的擬南芥同源基因(P≤ 0.05)(表3)。JA處理后，小桐子花序芽中，參與成花轉(zhuǎn)變的7個基因上調(diào)表達，3個下調(diào)表達；參與花器官發(fā)育的1個基因上調(diào)表達，7個下調(diào)表達；參與茉莉酸合成途徑的5個基因上調(diào)表達，3個下調(diào)表達；參與茉莉酸信號途徑的8個基因上調(diào)表達，2個下調(diào)表達(圖6)。其中，DAF(DAD1-ActivatingFactor)基因同時參與擬南芥茉莉酸合成和花器官發(fā)育過程[45]，MYC4 (myelocytomatosisprotein4)基因同時參與擬南芥茉莉酸信號途徑和成花轉(zhuǎn)變過程[46-47]，在小桐子花序芽中，其同源基因受JA誘導(dǎo)上調(diào)表達。在花器官發(fā)育相關(guān)的基因中，與擬南芥FUL、SRS、SEP1、AGL61、WOX1、TPR4和SEU同源的基因下調(diào)表達，說明JA處理可以誘導(dǎo)小桐子花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達發(fā)生變化。為了驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中候選基因的表達模式，選取2個成花轉(zhuǎn)變相關(guān)基因(JcSPL4和JcSPL9)、4個花器官發(fā)育相關(guān)基因(JcFUL、JcSEP1、JcSEUSS和JcWOX1)和2個茉莉酸合成途徑相關(guān)基因(JcFAD8a和JcFAD8b)，進行qRT-PCR分析。結(jié)果(圖7)顯示，這些基因的表達模式與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果(圖6)相一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。以上結(jié)果表明，外源JA處理可以誘導(dǎo)小桐子早期花序芽中JA合成和信號途徑以及成花轉(zhuǎn)變和花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達，可能對小桐子花的表型產(chǎn)生影響。

圖4 茉莉酸誘導(dǎo)的差異表達基因的GO功能富集分析Fig.4 Enrichment analysis of GO of differentially expressed genes induced by JA treatment

圖5 茉莉酸誘導(dǎo)的差異表達基因的KEGG功能富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG of differentially expressed genes induced by JA treatment

3 討論

茉莉酸生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在花的發(fā)育過程中起著重要作用，參與擬南芥、水稻和玉米的花發(fā)育調(diào)控[13,30,69-71]。在小桐子中，不同花性別生態(tài)型小桐子比較轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示JA在小桐子花器官發(fā)育中可能發(fā)揮調(diào)控功能[37]，且小桐子茉莉酸合成酶基因JcDAD1的沉默對花發(fā)育有明顯的影響[72]，但本研究結(jié)果表明外源JA處理并不顯著影響花發(fā)育后期表型，表明小桐子的花發(fā)育對外源1 mmol/L JA處理不敏感。而外源茉莉酸甲酯(MeJA)可以促進油菜(Brassicanapus)開花，并且引起花器官形態(tài)的異常[73]，表明JA調(diào)控不同植物花發(fā)育過程中的作用方式可能并不相同。

JA處理后，小桐子花序芽中，茉莉酸合成途徑中的FAD7、FAD8、AOC4和OPR3基因下調(diào)表達(圖6)，表明內(nèi)源JA合成受到抑制；而LOX2、LOX5、LOX6和AOS基因上調(diào)表達(圖6)，表明小桐子花序芽中可能存在反饋調(diào)節(jié)。JAZ蛋白是茉莉酸信號途徑中的關(guān)鍵蛋白。JA處理后，JAZ1、JAZ2和JAZ8基因上調(diào)表達(圖6)，響應(yīng)茉莉酸含量的增加，表明在小桐子花序芽中，JAZs基因的轉(zhuǎn)錄受JA正調(diào)控。在擬南芥中，JAM2和JAM3蛋白作為茉莉酸信號途徑中轉(zhuǎn)錄抑制子，其負調(diào)控JA響應(yīng)相關(guān)的脅迫響應(yīng)、花的育性和葉片衰老等過程[74-75]；在小桐子中，JAM2基因上調(diào)表達，JAM3基因下調(diào)表達，表明JAM2和JAM3在小桐子的花發(fā)育過程中可能有不同功能。MYC4是一個受茉莉酸激活的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥開花誘導(dǎo)上發(fā)揮重要功能[47]。DAD1催化茉莉酸合成途徑中半乳糖脂 (18∶3)向游離的ALA的轉(zhuǎn)變過程[7]。在小桐子花序芽中，MYC4基因[46-47]以及DAD1激活因子DAF[45]的同源基因表達均被上調(diào)，表明在小桐子中可能存在與擬南芥相同的茉莉酸生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控途徑。

KEGG功能富集分析顯示“次生代謝物合成基因”途徑基因在上調(diào)和下調(diào)表達DEGs中都富集(圖5)，與JA合成代謝途徑中基因的表達 (圖6)相一致，表明JA合成代謝途徑基因在花發(fā)育過程中發(fā)揮作用。然而，KEGG并未富集JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和花發(fā)育相關(guān)基因，說明僅僅這些JA合成代謝途徑基因的表達變化可能不足以引起花發(fā)育后期(開花期)的表型改變。

表3 成花轉(zhuǎn)變、花器官發(fā)育以及茉莉酸合成和信號途徑相關(guān)DEGs統(tǒng)計Table 3 Differentially expressed genes involved in floral transition,floral organ development and JA synthesis and signal pathway

ck為對照;ja為JA處理圖6 茉莉酸信號途徑和花發(fā)育相關(guān)的差異表達基因聚類分析Fig.6 Hierarchical clustering of differentially expressed genes involved in floral transition,floral organ development and JA synthesis and signal pathway

(a)～(h)分別顯示JcSEUSS、JcSPL9、JcFUL、JcSPL4、JcSEP1、JcWOX1、JcFAD8a和JcFAD8b基因在對照 (ck)和茉莉酸處理 (ja)樣品中的相對表達水平；誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差(n=2)圖7 小桐子中參與成花轉(zhuǎn)變、花器官發(fā)育和茉莉酸合成途徑的候選基因表達模式的驗證Fig.7 Validation of expression profiles of candidate genes involved in floral transition and floral organ development and JA synthesis pathway in J. curcas

本次研究選取出現(xiàn)1～7 d的小桐子花序芽作為實驗對象，事實上花序芽的分化發(fā)生在更早的肉眼不可見的時間段[76]。因此，JA處理更早期的未分化的花序芽，可能對花的后期發(fā)育影響更顯著。另外，茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate,MeJA)是茉莉酸的甲酯化形式，其作為信號分子，自由透過細胞膜，較JA不易被離子化[77]，因此廣泛用于植物脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育相關(guān)的JA外源處理實驗。鑒于本實驗在田間露天進行，而MeJA具有揮發(fā)性，為避免由于環(huán)境因素(風(fēng)向、光照和溫度等)引起MeJA的快速揮發(fā)，影響處理效果，故使用茉莉酸作為處理試劑[78]。今后的實驗中將采用MeJA進行處理，了解采用JA與MeJA處理小桐子花序芽的效果是否存在差異。

4 結(jié)論

對茉莉酸處理的小桐子早期花序芽進行表型變化觀察和轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)茉莉酸處理引起早期花序芽中1 259個基因上調(diào)表達，695個基因下調(diào)表達。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共篩選到10個與成花轉(zhuǎn)變相關(guān)，8個與花器官發(fā)育相關(guān)和18個與茉莉酸合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的擬南芥同源基因。GO注釋顯示，“響應(yīng)茉莉酸”功能分類基因在上調(diào)表達基因群中富集，表明外源茉莉酸可以改變小桐子花序芽中的茉莉酸信號途徑。在花器官發(fā)育相關(guān)的基因中，與擬南芥FUL、SRS、SEP1、AGL61、WOX1、TPR4和SEU同源的基因表達下調(diào)，然而JA處理后小桐子花的發(fā)育后期表型沒有發(fā)生顯著的變化，說明茉莉酸誘發(fā)的這些基因的下調(diào)表達不足以改變小桐子的花器官發(fā)育過程。實驗結(jié)果對解析茉莉酸在小桐子花發(fā)育過程中的調(diào)控作用有一定的參考價值。